結(jié)腸癌組織中差異表達(dá)circRNA的篩選與驗(yàn)證*

孫 林,沈永奇,孫一帆,龍海華,陳建林,易青群,龔敏珍,莫遠(yuǎn)群

廣西醫(yī)科大學(xué)附屬柳鐵中心醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.腫瘤科；3.消化內(nèi)科；4.胃腸外科，廣西柳州 545007

結(jié)腸癌是一種常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在全國(guó)惡性腫瘤中均居前5位[1],早期診斷尤為重要。目前對(duì)結(jié)腸癌的早期篩查主要依靠糖類抗原檢測(cè)，其特異性較高，但靈敏度較差，導(dǎo)致早期診斷率較低，急需尋找一種更為有效的篩查方法。隨著RNA測(cè)序技術(shù)的高速發(fā)展，環(huán)狀RNA(circRNA)已被認(rèn)為是細(xì)胞分化以及疾病發(fā)展的重要調(diào)控因子[2]。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，可能會(huì)成為結(jié)腸癌早期篩查的一種新型生物標(biāo)志物[3]。本研究通過對(duì)臨床結(jié)腸癌組織及配對(duì)癌旁組織的樣本circRNA表達(dá)進(jìn)行比較，篩選具有表達(dá)差異的circRNA，并分析其在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2018年1月至2019年12月在柳州市柳鐵中心醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療的術(shù)前未進(jìn)行過放療或化療的50例結(jié)腸癌患者納入研究。收集上述患者手術(shù)治療中取得的病變組織(經(jīng)病理學(xué)檢查確診為結(jié)腸癌組織)及相應(yīng)癌旁組織(距離癌變部位邊界>2.0 cm)凍存標(biāo)本?；颊呒凹覍賹?duì)本研究均知情同意并簽署知情同意書。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核通過。

1.2試劑與儀器 Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司；總RNA提取試劑盒購(gòu)自Qiagen公司；Arraystar Super RNA Labeling Kit、Arraystar Human circRNA Arrays V2芯片(8×15K)為Arraystar公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Qiagen公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)試劑盒購(gòu)自Takara公司；Agilent Hybridization Oven、Agilent Scanner G2505C為Agilent公司產(chǎn)品；核酸蛋白定量?jī)xNanodrop ND-1000為Nanodrop公司產(chǎn)品；AB7500 qPCR儀為Applied Biosystems公司產(chǎn)品。qPCR所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列見表1。

表1 qPCR的引物設(shè)計(jì)

1.3方法

1.3.1結(jié)腸癌組織及癌旁組織總RNA的提取 使用Trizol試劑在液氮冷凍狀態(tài)下研磨組織，用總RNA提取試劑盒獲得總RNA，然后用Nanodrop ND-1000 檢測(cè)RNA的質(zhì)量和濃度。

1.3.2篩選結(jié)腸癌circRNA差異表達(dá)數(shù)據(jù) 從納入研究的結(jié)腸癌病例中隨機(jī)選取3例腫瘤組織及配對(duì)癌旁組織標(biāo)本提取總RNA，使用8×15K的Human circRNA Arrays V2芯片進(jìn)行circRNA雜交檢測(cè)，用Agilent Scanner G2505C儀器對(duì)雜交、洗片后的基因芯片進(jìn)行掃描，獲取cricRNA芯片原始圖像資料檢測(cè)數(shù)據(jù)。應(yīng)用圖像分析軟件對(duì)獲得的圖像資料進(jìn)行數(shù)據(jù)提取，進(jìn)一步采用R軟件包limma依據(jù)算法Quantile對(duì)circRNA原始芯片信號(hào)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和均一化處理，以P<0.05且差異表達(dá)倍數(shù)(FC)>1.5的條件篩選結(jié)腸癌差異表達(dá)的circRNA，然后在篩選的circRNA中選擇上調(diào)或下調(diào)差異表達(dá)倍數(shù)排在前8位的8個(gè)circRNA做進(jìn)一步的驗(yàn)證。

1.3.3qPCR檢測(cè)驗(yàn)證circRNA的表達(dá) 按照逆轉(zhuǎn)錄試劑使用說明書上的操作將結(jié)直腸癌組織及其癌旁組織提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；再按照qPCR試劑盒的操作說明書進(jìn)行qPCR檢測(cè)，每孔均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取平均Ct值作為該樣本最后Ct值，計(jì)算2-ΔΔCt來反映circRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.4差異表達(dá)circRNAs的生物信息學(xué)分析 通過生物信息相關(guān)數(shù)據(jù)庫對(duì)差異表達(dá)的circRNA進(jìn)行GO數(shù)據(jù)庫(http://amigo.geneontology.org/amigo)基因功能富集分析(GO分析)和KEGG數(shù)據(jù)庫(https://www.kegg.jp/)信號(hào)通路分析(KEGG分析)，預(yù)測(cè)差異表達(dá)的circRNA相關(guān)的生物學(xué)功能。

2 結(jié) 果

2.1基因芯片原始數(shù)據(jù)均一化 經(jīng)過重新標(biāo)準(zhǔn)化和均一化后消除了染色偏差和點(diǎn)樣針頭帶來的空間差異引起的基因表達(dá)量的不同，癌組織和癌旁組織樣本的circRNA表達(dá)譜標(biāo)準(zhǔn)化后的熒光信號(hào)強(qiáng)度均基本一致，從而使得到的基因表達(dá)量的差異以及變化具有生物學(xué)意義，可用于進(jìn)一步表達(dá)譜分析，見圖1。

注：C1～C3為癌組織標(biāo)本；P4～P6為癌旁組織標(biāo)本；C1與P4配對(duì)，C2與P5配對(duì)，C3與P6配對(duì)。

2.2表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因篩選分析 基因芯片在結(jié)腸癌組織和癌旁組織中共檢出5 990個(gè)circRNAs，以FC>1.5且P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出114個(gè)差異表達(dá)circRNA，其中62個(gè)circRNA上調(diào)表達(dá)，52個(gè)circRNA下調(diào)表達(dá)；前8位明顯上調(diào)和明顯下調(diào)的circRNAs，見表2。繪制差異表達(dá)circRNAs火山圖，見圖2，圖中兩側(cè)深色點(diǎn)即代表癌組織及癌旁組織存在差異表達(dá)的circRNAs，左側(cè)的深色點(diǎn)代表在結(jié)腸癌組織下調(diào)表達(dá)的circRNAs，右側(cè)的深色點(diǎn)代表在結(jié)腸癌組織上調(diào)表達(dá)的circRNAs；從圖2中發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌中下調(diào)表達(dá)的cricRNAs比上調(diào)表達(dá)的circRNAs離散程度較大，結(jié)合表2中下調(diào)表達(dá)的circRNAs FC較大。因此，在結(jié)腸癌中低表達(dá)的circRNAs FC可能更大。

注：FDR表示偽發(fā)現(xiàn)率。

表2 在結(jié)腸癌組織中表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的circRNA(前8個(gè))

2.3在結(jié)腸癌組織中驗(yàn)證低表達(dá)circRNAs 在結(jié)腸癌組織和癌旁組織中對(duì)所篩選的circRNAs表達(dá)量進(jìn)行聚類分析，研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌中以低表達(dá)circRNAs為主，筆者挑選了其中FC較大的8個(gè)表達(dá)下調(diào)的circRNAs,見表2。將它們的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，聚類熱圖見圖3A：右邊代表該基因在組織中高表達(dá)，左邊代表該基因在組織中低表達(dá)，顏色越深代表差異表達(dá)的程度越大。結(jié)果顯示，hsa_circRNA_404686、hsa_circRNA_102293、hsa_circRNA_000367、hsa_circRNA_104270、hsa_circRNA_001729、hsa_circRNA_100790、hsa_circRNA_105039、hsa_circRNA_102049在結(jié)腸癌組織中比癌旁組織中表達(dá)明顯下調(diào)，這與之前分析得到的結(jié)果相一致。接著筆者從納入研究的病例中，隨機(jī)選取了9例結(jié)腸癌組織及配對(duì)癌旁組織標(biāo)本進(jìn)行qPCR檢測(cè)驗(yàn)證，見圖3B，顯示hsa_circRNA_404686、hsa_circRNA_102293、 hsa_circRNA_000367、 hsa_circRNA_104270、hsa_circRNA_001729、hsa_circRNA_100790、hsa_circRNA_105039、hsa_circRNA_102049 8個(gè)circRNA在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平相比在癌旁組織的中表達(dá)水平顯著下降，這與之前生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析的結(jié)果一致。

注：A為篩選的8個(gè)circRNA的熱圖分析結(jié)果；B是用qPCR方法驗(yàn)證8個(gè)circRNA在腫瘤組織中的表達(dá)；兩組間比較，*表示P<0.05，**表示P<0.001；C1～C3為癌組織標(biāo)本；P4～P6為癌旁組織標(biāo)本；C1與P4配對(duì)，C2與P5配對(duì)，C3與P6配對(duì)。

2.4差異表達(dá)circRNA的GO分析和KEGG分析 GO分析顯示：結(jié)腸癌組織下調(diào)表達(dá)的8個(gè)circRNA的宿主基因可能參與的生物學(xué)過程(BP)主要富集在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白TRK受體信號(hào)通路、表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路、基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控等；可能涉及的細(xì)胞成分(CC)主要富集在核質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、核仁等；可能參與的分子功能(MF)主要富集在RNA結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子激活、poly(A)RNA結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合等。KEGG分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織下調(diào)表達(dá)的這8個(gè)circRNA的宿主基因與病毒致癌作用、FOXO信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性的信號(hào)通路、蛋白多糖在腫瘤中的作用、細(xì)胞周期、結(jié)腸癌發(fā)生等相關(guān)。

3 討 論

circRNA是由5′和3′末端首尾環(huán)化形成一個(gè)特殊環(huán)狀結(jié)構(gòu)，通過套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化和內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)環(huán)化形成的環(huán)形RNA[4-5]。circRNA廣泛存在于不同生物的細(xì)胞質(zhì)中，具有多樣性和高度的穩(wěn)定性，在真核生物的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要的作用[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA還具有與RNA結(jié)合蛋白相互作用，作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、RNA媒介基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控產(chǎn)物等生物學(xué)功能[8-10]，參與腫瘤的生長(zhǎng)發(fā)育。

在結(jié)腸癌的研究發(fā)現(xiàn)，circRNA_104916可通過抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲作用[11]。circPIP5K1A可以抑制miR-1273a的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和遷移，調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)展[12]。circRNA在結(jié)腸癌中可通過“海綿”吸附作用調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)展，circPPP1R12A經(jīng)“海綿”吸附結(jié)合miR-375調(diào)節(jié)靶基因CTNNB1的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)展[13]；circRNA_100859可作為一個(gè)致癌基因經(jīng)“海綿”吸附作用于miR-217，調(diào)節(jié)靶基因HIF-1α的表達(dá)，因此通過circRNA_100859-miR-217-HIF-1α軸可調(diào)控結(jié)腸癌的發(fā)展[14]。研究發(fā)現(xiàn)circRNA不僅可以調(diào)控結(jié)腸癌的發(fā)展還可調(diào)節(jié)對(duì)藥物的抵抗作用，circ_0020095可直接與miR-487a-3p結(jié)合靶向調(diào)節(jié)SOX9基因活性，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展；增強(qiáng)結(jié)腸癌對(duì)順鉑藥物的抵抗[15]。circRNA在結(jié)腸癌中的生物功能多樣化，因此circRNA可作為結(jié)腸癌臨床診斷及預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物。

本研究通過3例配對(duì)結(jié)腸癌及癌旁組織樣本的circRNAs表達(dá)譜進(jìn)行全面測(cè)序，按FC>1.5且P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出114個(gè)差異表達(dá)circRNA，其中62個(gè)circRNA上調(diào)表達(dá)，52個(gè)circRNA下調(diào)表達(dá)。通過火山圖、聚類熱圖等分析，在結(jié)腸癌組織中篩選出差異表達(dá)顯著下調(diào)的前8個(gè)circRNA，并通過qPCR驗(yàn)證hsa_circRNA_404686、hsa_circRNA_102293、hsa_circRNA_000367、hsa_circRNA_104270、hsa_circRNA_001729、hsa_circRNA_100790、hsa_circRNA_105039、hsa_circRNA_102049在腫瘤組織中表達(dá)水平降低。

對(duì)這8個(gè)差異表達(dá)的circRNAs進(jìn)行GO和KEGG分析。GO分析顯示：BP主要富集在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白TRK受體信號(hào)通路、表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路等；CC主要富集在核質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜等；MF主要富集在RNA結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子激活等。KEGG分析顯示：主要與FOXO信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性的信號(hào)通路、蛋白多糖在腫瘤中的作用、細(xì)胞周期等相關(guān)。細(xì)胞周期是細(xì)胞分裂和復(fù)制的過程，與細(xì)胞的增殖分化密切相關(guān)，而不受控的細(xì)胞增殖是癌癥發(fā)生、發(fā)展的特征之一[16]。p53信號(hào)通路是細(xì)胞凋亡信號(hào)通路之一，與胃癌、宮頸癌、胰腺癌、結(jié)腸癌等的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[17-21]。

綜上所述，經(jīng)篩選與分析，本研究發(fā)現(xiàn)hsa_circRNA_404686、hsa_circRNA_102293、hsa_circRNA_000367、hsa_circRNA_104270、 hsa_circRNA_001729、 hsa_circRNA_100790、hsa_circRNA_105039、hsa_circRNA_102049 8個(gè)在結(jié)腸癌組織中表達(dá)下調(diào)的circRNA，可能影響結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展，有可能成為潛在的標(biāo)志物，為今后研究結(jié)腸癌發(fā)生機(jī)制提供理論依據(jù)。同時(shí)，本研究存在一些不足，由于臨床病例數(shù)和實(shí)驗(yàn)時(shí)間的限制，未進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證，相關(guān)作用機(jī)制僅為預(yù)測(cè)結(jié)果；實(shí)驗(yàn)分組還需要進(jìn)一步細(xì)化，納入各臨床病理分期的組織樣本；需要收集更多的臨床組織樣本。本研究對(duì)癌組織中上調(diào)表達(dá)的circRNAs沒有進(jìn)行初步驗(yàn)證，是因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)其FC沒有下調(diào)表達(dá)的circRNAs大,筆者認(rèn)為下調(diào)表達(dá)的circRNAs更值得去研究。