楊梅素類衍生物H10對肺癌細胞H460影響的體外實驗研究

李 艷，劉 靜，劉 健

(蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院婦瘤科，安徽 蚌埠 233000)

研究表明，楊梅素具有多種病理生理特性，包括抗氧化、抗病毒、抗微生物和抗血小板特性[1-2]。楊梅素可通過多種方式發(fā)揮抗腫瘤作用，如抑制異常細胞增殖、誘導凋亡；激活相關信號通路；抑制血管生成和腫瘤轉移[3-5]。在多種類黃酮化合物研究中，楊梅素抑制酶活性和細胞增殖活性作用最強[6]。本團隊一直致力于在研究楊梅素衍生物體外抗腫瘤活性，其中發(fā)現(xiàn)楊梅素衍生物H10[5,7-二甲氧基-3-(4-(4-(3-三氟甲基苯基)磺?；?哌嗪-1-基)丁氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮，結構式如圖1]表現(xiàn)出對人大細胞肺癌細胞H460有較好的體外抗腫瘤活性。研究證實天然產物在控制癌癥進展方面具有顯著效果。本團隊以天然產物楊梅素的衍生物H10為研究對象，檢測了該目標化合物對人大細胞肺癌細胞H460體外生物活性，以期為該類藥物的開發(fā)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料人類肺腺癌細胞(H460)購自普諾賽生命科技有限公司，RPMI medium1640培養(yǎng)基(美國GIBCO 公司)、DMEM培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、胰酶、細胞凋亡檢測試劑盒、DMSO、DAPI、ACTIN染色劑購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)H460細胞用含體積分數為10%胎牛血清的RPMI1640、DMEM培養(yǎng)液在37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 H10制備和儲存液及工作液的配制以楊梅苷為原料，碘甲烷為甲基化試劑，在酸性條件下脫苷得到3-羥基-5,7-二甲氧-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(楊梅素中間體1)，然后再與1,3-二溴丙烷或1,4-二溴丁烷反應生成中間體2。取代磺酰氯和哌嗪反應制得中間體6，根據活性拼接原理，然后中間體6與中間體2反應合成一系列含磺酰胺的楊梅素衍生物B，其合成路線如圖1。

圖1 含磺酰胺的楊梅素衍生物B系列的合成路線

本研究中的目標化合物H10(結構式如圖2)為楊梅素衍生物B系列之一。

圖2 楊梅素衍生物H10的結構式

以DMSO為溶劑、配制20 mM、10 mM、5 mM、2 mM、1 mM、0.5 mM、0.1 mM濃度的H10作為儲備溶液，并在4 ℃下儲存。在含有10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中進行進一步的稀釋液作為工作液。

1.4 四甲基偶氮唑鹽法(MTT比色法)取對數生長期細胞，接種于96孔板，細胞密度在每孔3000。板四周每孔各加100 μL的無菌水封邊，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，取20 mM、10 mM、5 mM、2 mM、1 mM、0.5 mM、0.1 mM濃度的H10儲存液在含有10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，按1∶1000配成工作液，每組6個復孔，DMSO按比例1∶1000稀釋作為陰性對照組。培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，隨后每孔加入10 μL的MTT工作溶液，放置保溫箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入DMSO溶解形成MTT在細胞內形成的甲瓚,酶標儀測定OD-592 nm，計算每個濃度的抑制率。抑制率(%)=[1-(處理組OD值-空白對照組OD值)/(陰性對照組OD值-空白對照組OD值)]×100%。

1.5 DAPI-Actin染色將H460細胞(3×104)接種于24孔板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，取10 mM的H10儲備液0.8 μL加入到0.8 mL的完全培養(yǎng)基中，DMSO作陰性對照，24 h后，PBS洗兩遍，4%多聚甲醛固定30 min。加入Actin-tracker-green染色液，每孔200 μL，孵育30 min，PBS洗兩遍，每次5 min。加入1 μg/mL DAPI染色工作液，每孔200 μL，孵育10 min。PBS洗兩遍，每次5 min。熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.6 細胞克隆形成實驗取對數生長期的細胞，于6孔培養(yǎng)板中接種細胞，每孔500個細胞，置37 ℃、5% CO2及飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，取2 mM、5 mM、10 mM的H10儲備液2 μL加入到2 mL的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，DMSO作陰性對照，根據細胞狀態(tài)更換培養(yǎng)基,培養(yǎng)2～3周。當培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加入甲醇1 mL/孔，固定25 min。去固定液，加適量結晶紫染色液，染色10 min。用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。

1.7 細胞成像將細胞暴露于10 μM的H10藥物48 h，并通過倒置顯微鏡觀察藥物作用后細胞的形態(tài)學變化。

1.8 傷口愈合實驗取對數生長期細胞，預先在6孔板底畫直線，間距為0.5 cm，接種細胞密度每孔8×105。保溫箱培養(yǎng)24 h后，用200 μL的黃色槍頭垂直于直線，刮出劃痕，PBS清洗兩次，于倒置顯微鏡下觀察拍照(0 h拍照)，取10 mM的H10儲存液2 μL加入到2 mL的完全培養(yǎng)基中，DMSO作陰性對照，24 h后取出，PBS清洗兩次，倒置顯微鏡下觀察拍照，利用 Image J計算劃痕面積值。遷移率(%)=[(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積]×100%

1.9 流式分析細胞凋亡將H460細胞(2×105)接種于6孔板中，保溫箱過夜，取10 mM的H10儲存液2 μL加入到2 mL的完全培養(yǎng)基中，同上，DMSO作陰性對照，保溫箱培養(yǎng)48 h。收集細胞，懸浮在結合緩沖液中。加入2.5 μL FITC Annexin V和1 μL碘化丙啶(PI)，室溫黑暗中孵育30 min。流式細胞儀檢測，使用FlowJo-V 10軟件分析細胞凋亡率。

1.10 數據分析計量數據用“均數±標準差”表示，使用Graphpad Prism 8.0軟件分析作圖，統(tǒng)計方法采用兩樣本t檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 H10抑制H460細胞的增殖能力MTT比色法結果如圖3，將40 mM、20 mM、10 mM、5 mM、2 mM、1 mM、0.5 mM、0.1 mM H10儲存液在RPMI-1640完全培養(yǎng)基中進一步稀釋，作用肺癌細胞H460細胞48 h，與對照組相比，隨著濃度的升高，細胞抑制率逐漸增加，P<0.001，具有統(tǒng)計學意義。

圖3 H10在肺癌細胞H460中IC50值

2.2 H10處理H460細胞后，促使細胞形態(tài)皺縮、變圓及碎裂倒置顯微鏡下觀察，結果如圖4，將80 mM、40 mM、10 mM、5 mM、1 mM的H10儲存液在RPMI-1640完全培養(yǎng)基中按1∶1000進一步稀釋。隨著H10藥物濃度增加，H460細胞數目明顯減少，細胞縮小，變圓變亮,周圍出現(xiàn)細胞碎片。

圖4 H10處理肺癌細胞H460后形態(tài)學變化

2.3 H10抑制H460細胞形成克隆斑結果如圖5，將濃度為10 mM、5 mM、2 mM的H10按1∶1000配成工作液作用肺癌細胞H460細胞，與DMSO對照組相比，實驗組細胞隨著H10藥物濃度的升高，克隆細胞團的數目明顯減少。DMSO組的克隆形成率為(101.93±8.86)%；2 μM濃度組：(39.67±4.64)%；5 μM濃度組：(21.67±1.7)%；10 μM濃度組：(4.13±0.5)%；P<0.001。

圖5 H10處理肺癌細胞H460后的克隆斑形成結果

2.4 H10促使H460細胞結構改變結果如圖6，將濃度為10 μM的H10作用肺癌細胞H460細胞24 h，觀察到對照組細胞形態(tài)呈近橢圓形，外觀較大，染色均勻，實驗組細胞數量減少,細胞骨架結構發(fā)生改變，形態(tài)呈近不規(guī)則，外觀較小，染色不均勻，胞核開始出現(xiàn)明顯的固縮或分裂，多可看到胞質及核碎塊狀熒光，即典型的凋亡細胞核特征。

圖6 H10處理肺癌細胞H460后的免疫熒光染色結果

2.5 H10抑制H460遷移結果如圖7，將濃度為10 μM的H10作用肺癌細胞H460細胞24 h，與對照組相比，實驗組細胞的遷移率明顯被抑制。對照組遷移率為(14.82±1.82)%，實驗組遷移率為(10.00±1.32)%，P=0.02。

圖7 H10處理肺癌細胞H460后的細胞遷移結果

2.6 H10誘導H460凋亡Annexin V-FITC/PI雙標記法檢測細胞凋亡結果如圖8，使用濃度為10 μM的H10處理H460細胞48 h后，與對照組相比，對照組的總凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡)：(10.22±0.82)%；實驗組細胞凋亡率明顯增加，總凋亡率:(50.27±5.05)%；P=0.00038。

圖8 H10處理肺癌細胞H460后的凋亡結果

3 討論

肺癌是最常見的腫瘤死亡原因。治療手段主要以手術為主，輔以放化療治療[1]。然而放化療的不良反應嚴重，目前急需一種有效方法，減輕癌癥患者癥狀，加強治療療效。自然界中，多酚類物質種類繁多，人類飲食中最常見的多酚類物質是類黃酮[2]。黃酮類化合物具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、低毒等特性[3-4]。研究表明，黃酮類化合物可增強化療療效，改善患者預后[1,5-6]。其中楊梅素是一種作用較強的黃酮類化合物，在多種腫瘤中均可影響腫瘤的惡性進程，如肝癌、乳腺癌、甲狀腺乳頭狀癌等[4-10]。目前楊梅素類藥物是否使患者獲益的相關臨床研究數量較少，臨床前研究數據的增加支持了楊梅素的有益作用[2]。因此，研究這類藥物在抗腫瘤、輔助放化療等方面的作用值得我們進行的深入研究。

本課題組一直致力于研究楊梅素類衍生物的抗腫瘤活性篩選。本研究以肺癌細胞H460細胞為篩選模型，使用MTT比色法進行篩選，結果表明楊梅素類衍生物H10表現(xiàn)出較強體外抗腫瘤作用。因為在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，細胞增殖、遷移等行為學變化，細胞畸形、細胞膜泡的形成、凋亡小體的出現(xiàn)和核碎裂等形態(tài)學變化是十分重要的[11]。因此H10對細胞的影響具有潛在的研究價值。本研究將不同濃度H10作用肺癌細胞H460細胞后，不僅測出細胞的吸光度值隨濃度增加而減小，還觀察到細胞形態(tài)隨濃度增加而縮小、皺縮。取濃度為10 μM的H10處理肺癌細胞H460細胞，通過細胞傷口愈合實驗及流式分析凋亡實驗，觀察到H10可明顯抑制肺癌細胞H460細胞的遷移及誘導細胞凋亡。有研究表明，楊梅素可通過抑制BRCA1-GADD45信號通路誘導乳腺癌細胞凋亡[12]；抑制PI3K/Akt/mTOR信號轉導誘導人結腸癌細胞凋亡[13]。下調基質金屬蛋白酶-2/9活性抑制乳腺癌細胞轉移；抑制PIM1和干擾PIM1/CXCR4的相互作用可有效抑制前列腺癌的轉移。下調YAP的表達抑制肝細胞癌的生長。根據楊梅素的抗腫瘤機制中，PI3K/Akt是誘導凋亡的明星途徑，下調基質金屬蛋白酶是研究遷移的主要機制，楊梅素衍生物H10發(fā)揮抗腫瘤作用是否同楊梅素，還需要進一步的實驗驗證。本研究在肺癌H460中，證實H10具有顯著的抗腫瘤作用，不僅影響H460細胞形態(tài)和結構變化，還可抑制細胞增殖、遷移及誘導凋亡，其中誘導凋亡具有顯著結果。鑒于此，我們下一步將研究楊梅素衍生物H10在體外誘導凋亡的分子通路，由于H10可影響H460形態(tài)和結構的改變，因此我們可從此方面研究H10是否通過影響細胞膜蛋白的傳導激活其下游蛋白，引發(fā)結構發(fā)生改變及誘導細胞走向凋亡。