瑞舒伐他汀對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化APOE-/-小鼠VCAM-1、VEGF和TNF-α表達(dá)的影響

張俊華，馬永賓，蘇建華，陳玉芳，孫亞云，曹 明

(1.江蘇大學(xué)附屬金壇醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；2.常州市第四人民醫(yī)院病理科，江蘇 常州 213000)

心腦血管疾病具有發(fā)病率高和致死率高的特點(diǎn)，對(duì)人類健康產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。作為心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣。在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等多種因素作用下，脂質(zhì)斑塊在血管內(nèi)皮生成和黏附，導(dǎo)致血管硬化及管腔狹窄，影響遠(yuǎn)端組織的血液供應(yīng)[1]。他汀類藥物除了降脂作用外，研究發(fā)現(xiàn)其有抗炎和抗AS的作用，但是其抗AS的作用機(jī)制尚缺乏系統(tǒng)的報(bào)道[2]。本研究旨在通過觀察瑞舒伐他汀對(duì)載脂蛋白E敲除基因(APOE-/-)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的治療作用及其對(duì)VCAM-1、VEGF和TNF-α表達(dá)的影響，探討瑞舒伐他汀的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物18只8周齡SPF級(jí)健康雄性APOE-/-小鼠(品系為C57BL/6)，6只8周齡SPF級(jí)健康雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量為18～24 g，均購(gòu)自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)為202013565。

1.2 主要藥品、試劑與儀器本研究所用藥品為魯南貝特制藥有限公司生產(chǎn)的瑞舒伐他汀鈣片(5 mg/片，藥品批號(hào)44211101)，主要試劑為Affinity VCAM-1抗體(江蘇親科生物研究中心有限公司)、Proteintech VEGF抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)、Affinity TNF-α抗體(江蘇親科生物研究中心有限公司)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司)、ECL試劑盒(上海滬震實(shí)業(yè)有限公司)。主要儀器：倒置相差顯微鏡(Nikon公司)、離心機(jī)(Eppendorf公司)、組織勻漿儀(Servicebio公司)、電泳儀(Bio-Rad公司)、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Tanon公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組、喂養(yǎng)及給藥 在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)1周后，按隨機(jī)化原則將18只APOE-/-小鼠分為模型組、低劑量治療組和高劑量治療組，每組6只。6只C57BL/6小鼠作為對(duì)照組。均在屏障環(huán)境下喂養(yǎng)，APOE-/-小鼠采用高脂飼料(Rodent Diet，含1.25%膽固醇)喂養(yǎng)，C57BL/6小鼠采用普通顆粒飼料和自來水喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)室室溫維持在(21±2)℃，濕度控制在50%～70%，每天更換墊料。實(shí)驗(yàn)室喂養(yǎng)8周后，按不同劑量的瑞舒伐他汀依次對(duì)低、高劑量組小鼠進(jìn)行灌胃給藥，低劑量治療組按1.5 mg/kg給藥、高劑量治療組按5 mg/kg給藥，對(duì)照組和模型組用相同量的蒸餾水灌胃，1次/d，共給藥8周。

1.3.2 取材 4組小鼠最后一次灌胃后均禁食不禁水12 h，腹腔注射10%水合氯醛(4.5 mL/kg)進(jìn)行麻醉，分離出主動(dòng)脈弓，用4%甲醛予以固定，取胸主動(dòng)脈置于-80 ℃冰箱中保存待用。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 主動(dòng)脈病理學(xué)觀察及管腔相關(guān)指標(biāo)和AS斑塊面積比較 常規(guī)脫水固定胸主動(dòng)脈標(biāo)本后浸蠟包埋，切片后用蒸餾水浸泡，然后經(jīng)蘇木精水溶液染色，酸水及氨水分色，流水沖洗，酒精水化和分化，伊紅染色液染色及純酒精脫水等步驟后，加入二甲苯和樹膠，中性樹脂封固。200倍光學(xué)顯微鏡觀察主動(dòng)脈的病理形態(tài)學(xué)變化，用Image Tool 圖像分析儀和IPP軟件分析計(jì)算主動(dòng)脈內(nèi)彈力板周長(zhǎng)、外彈力板周長(zhǎng)、殘腔周長(zhǎng)和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的面積。

1.4.2 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot,WB)法檢測(cè)主動(dòng)脈VCAM-1、VEGF和TNF-α的蛋白表達(dá) 稱取25 mg的胸主動(dòng)脈，加入0.5 mL RIPA裂解液，勻漿3次，每次間隔30 s。勻漿液4 ℃ 3000×g，離心15 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的微量離心管中，裂解完成后4 ℃ 1200×g，離心15 min。采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白定量，嚴(yán)格按照其說明書要求測(cè)量各樣本蛋白的濃度。根據(jù)各樣本蛋白濃度，計(jì)算各樣品相同蛋白量所需體積。蛋白樣品于變性儀95 ℃下變性5 min，室溫下冷卻后上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電壓為80 V 30 min，120 V 1 h。轉(zhuǎn)膜后將其置于5%脫脂奶粉的TBST封閉液室溫?fù)u床上封閉1 h，震蕩洗滌3次，每次5 min。加入特異性一抗4 ℃冰箱中過夜孵育，搖床上搖30 min，震蕩洗滌3次，每次5 min，再加入相應(yīng)的二抗室溫孵育1 h，震蕩洗滌3次，每次5 min。最后用ECL試劑盒顯色，凝膠成像儀拍照，經(jīng)計(jì)算機(jī)圖像分析儀掃描，用Image J軟件進(jìn)行灰度值測(cè)定及分析，將VCAM-1、VEGF和TNF-α條帶灰度值與GAPDH之比作為目的蛋白表達(dá)的相對(duì)數(shù)值。

1.4.3 免疫組化檢測(cè)VCAM-1、VEGF及TNF-α在主動(dòng)脈組織中的表達(dá) 取主動(dòng)脈，冰生理鹽水沖洗后用4%甲醛固定，石蠟包埋后切成5 μm厚度的切片，然后用二甲苯和乙醇脫蠟，蒸餾水水化2 min后，進(jìn)行抗原修復(fù)；隨后加入3%的過氧化氫室溫避光25 min，3% BSA室溫封閉30 min，吸去封閉液，滴加相應(yīng)一抗，置于4 ℃濕盒孵育過夜；滴加與一抗相應(yīng)種屬HRP 標(biāo)記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50 min；棄去二抗，DAB染色10 min，自來水沖洗后分化10 s，最后脫水封片；顯微鏡鏡檢，采集記錄圖像進(jìn)行分析。用Image J軟件計(jì)算各組免疫組化檢測(cè)VCAM-1、VEGF和TNF-α的光密度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，P<0.05示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠胸主動(dòng)脈病理形態(tài)學(xué)觀察模型組、低劑量治療組和高劑量治療組主動(dòng)脈根部均有明顯的AS斑塊。與對(duì)照組相比，模型組主動(dòng)脈內(nèi)膜明顯增厚；與模型組相比，低劑量治療組和高劑量治療組的內(nèi)膜厚度均明顯降低，且藥物劑量依賴性降低內(nèi)膜厚度,見圖1。

圖1 各組小鼠主動(dòng)脈病理形態(tài)學(xué)改變(HE染色，200×)

2.2 主動(dòng)脈管腔相關(guān)指標(biāo)和AS斑塊面積比較與對(duì)照組相比，模型組的內(nèi)彈力板周長(zhǎng)明顯增加；與模型組比較，低劑量治療組內(nèi)彈力板周長(zhǎng)仍有增加，但高劑量治療組較模型組和低劑量治療組明顯降低(P<0.01)。與對(duì)照組相比，模型組的外彈力板周長(zhǎng)明顯增加，高劑量治療組外彈力板周長(zhǎng)較模型組和低劑量治療組明顯降低(P<0.01)。與對(duì)照組相比，模型組的殘腔周長(zhǎng)明顯降低，低劑量治療組和高劑量治療組殘腔周長(zhǎng)均明顯增加(P<0.01)。與模型組相比，低劑量治療組和高劑量治療組斑塊面積縮小；與低劑量治療組相比，高劑量治療組斑塊面積縮小更明顯(P<0.01)。見表1。

表1 各組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)彈力板周長(zhǎng)、外彈力板周長(zhǎng)、殘腔周長(zhǎng)及斑塊面積比較

2.3 各組小鼠WB法檢測(cè)主動(dòng)脈VCAM-1、VEGF和TNF-α蛋白條帶的相對(duì)灰度值比較與對(duì)照組相比，模型組VCAM-1、VEGF和TNF-α相對(duì)灰度值均升高(P<0.01)；與模型組相比，低劑量治療組VCAM-1和TNF-α的相對(duì)灰度值無(wú)明顯變化，VEGF的相對(duì)灰度值降低(P<0.01)；與模型組相比，高劑量治療組VCAM-1、VEGF和TNF-α的相對(duì)灰度值降低(P<0.01)。見圖2和表2。

圖2 各組小鼠主動(dòng)脈VCAM-1、VEGF和TNF-α蛋白條帶

表2 各組小鼠主動(dòng)脈VCAM-1、VEGF和TNF-α蛋白條帶灰度值比較

2.4 各組小鼠免疫組化檢測(cè)VCAM-1、VEGF及TNF-α在主動(dòng)脈組織中的表達(dá)如圖3所示，其中黃褐色部分為陽(yáng)性表達(dá)。APOE-/-小鼠陽(yáng)性表達(dá)數(shù)高于對(duì)照組小鼠，低劑量治療組和高劑量治療組的陽(yáng)性表達(dá)數(shù)明顯降低，且藥物劑量依賴性降低陽(yáng)性表達(dá)數(shù)。光密度值反映對(duì)應(yīng)蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率，各組光密度值(IOD)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果如表3所示。與對(duì)照組相比，模型組VCAM-1、VEGF、TNF-α光密度值均升高(P<0.01)；與模型組相比，低劑量治療組VCAM-1和VEGF蛋白表達(dá)陽(yáng)性率略有降低，其光密度值無(wú)顯著性差異(P>0.05)。TNF-α光密度值明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，高劑量治療組VCAM-1、VEGF和TNF-α光密度值均降低(P<0.01)。

表3 各組小鼠免疫組化VCAM-1、VEGF和TNF-α光度值比較

圖3 各組小鼠免疫組化檢測(cè)VCAM-1、VEGF及TNF-α在主動(dòng)脈組織的表達(dá)

3 討論

AS是一種多因素導(dǎo)致的慢性炎癥性疾病，常累及全身大、中動(dòng)脈內(nèi)膜，AS的主要危險(xiǎn)因素是炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)代謝異常[3]。在多種因素作用下，單核細(xì)胞大量聚集，激活巨噬細(xì)胞，吞噬氧化型低密度脂蛋白，分泌的炎癥介質(zhì)損傷血管壁，促進(jìn)AS的發(fā)生和發(fā)展，出現(xiàn)血管狹窄、血栓形成、甚至出現(xiàn)粥樣斑塊破裂，嚴(yán)重影響人類健康。因此，如何有效控制AS成為眾多學(xué)者的研究方向[4]。作為臨床常用的降脂藥物，瑞舒伐他汀能通過抑制 HMG-CoA 還原酶降低低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白的合成[5]。研究發(fā)現(xiàn)，瑞舒伐他汀除了能降脂外，還有抗炎、改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能、抗氧化、抑制細(xì)胞凋亡等作用，但其對(duì)AS作用的具體機(jī)制仍不明確[6]。

VCAM-1是一種在內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、白細(xì)胞及血小板表面表達(dá)的膜表面糖蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞與細(xì)胞間黏附及相互作用[7]。有研究表明，在炎癥因素作用下，VCAM-1、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)等黏附分子明顯增加，單核細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞遷移和增殖，巨噬細(xì)胞聚集在血管內(nèi)膜。巨噬細(xì)胞表面的清道夫受體結(jié)合氧化型低密度脂蛋白后，轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞，在動(dòng)脈管壁上形成脂肪條紋，促進(jìn)AS 的發(fā)生發(fā)展[8]。本研究用高脂飲食喂養(yǎng)APOE-/-小鼠，制造動(dòng)脈粥樣硬化的模型，然后使用不同劑量的瑞舒伐他汀進(jìn)行干預(yù)治療。WB法和免疫組化法檢測(cè)結(jié)果表明，高劑量治療組VCAM-1的相對(duì)灰度值和光密度值較模型組均降低。

TNF-α是一種由組織固有免疫細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，具有廣泛的生物學(xué)活性[9]。內(nèi)皮細(xì)胞在TNF-α誘導(dǎo)作用下，通過激活NF-κB 通路，促進(jìn)各種趨化因子和粘附分子的表達(dá)[10]。研究表明，TNF-α能調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，并刺激IL-l、IL-6等炎癥因子的表達(dá)，對(duì)單核巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞均有激活、趨化、促生長(zhǎng)等作用，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，在AS病理變化中起著重要作用[11]。本研究顯示高劑量治療組TNF-α的相對(duì)灰度值明顯降低。免疫組化檢測(cè)也顯示使用高劑量的瑞舒伐他汀干預(yù)后其TNF-α光密度值明顯降低。

VEGF是目前所知的最關(guān)鍵的血管生成促進(jìn)因子，目前發(fā)現(xiàn)有3種VEGF受體：VEGFR-1、VEGFR-2 和VEGFR-3[12]。VEGF 的水平與缺血缺氧程度有關(guān)，在血管硬化和狹窄導(dǎo)致的心肌的缺血、缺氧環(huán)境中，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)是對(duì)VEGF 起主要調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，上調(diào)下游促血管形成物質(zhì)VEGF 的表達(dá)，刺激VEGF 保護(hù)性的分泌[13]。研究表明，VEGF是一種能夠特異性地作用于血管內(nèi)皮的多功能細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)AS斑塊中血管新生，同時(shí)通過改變血管滲透性而引起血管壁水腫，從而加重AS[14]。本研究結(jié)果顯示W(wǎng)B檢測(cè)模型組VEGF相對(duì)灰度值高于對(duì)照組，經(jīng)過瑞舒伐他汀干預(yù)后，低劑量組和高劑量組VEGF的相對(duì)灰度值均明顯降低。免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示模型組VEGF光密度值較對(duì)照組升高，經(jīng)瑞舒伐他汀治療后VEGF光密度值降低。

本研究結(jié)果表明，模型組的內(nèi)彈力板周長(zhǎng)和外彈力板周長(zhǎng)較對(duì)照組明顯增加，殘腔周長(zhǎng)降低。低劑量治療組和高劑量治療組殘腔周長(zhǎng)較模型組均明顯增加。低劑量治療組和高劑量治療組斑塊面積較模型組縮小，高劑量治療組斑塊面積縮小更明顯。說明瑞舒伐他汀能增加AS殘腔周長(zhǎng)，縮小斑塊面積，且高劑量?jī)?yōu)于低劑量。

綜上所述，瑞舒伐他汀能通過對(duì)主動(dòng)脈VCAM-1、TNF-α和VEGF表達(dá)的影響，降低其蛋白表達(dá)陽(yáng)性率，從而增加AS殘腔周長(zhǎng)，縮小斑塊面積，起抗AS的作用，且高劑量?jī)?yōu)于低劑量。這為臨床上運(yùn)用瑞舒伐他汀治療以動(dòng)脈粥樣硬化為病理基礎(chǔ)的心腦血管疾病提供理論依據(jù)。