DNA甲基化調(diào)控年齡相關(guān)性白內(nèi)障的研究進(jìn)展

張高波，崔亭松，鄭貴倩，劉善賀，胡姍姍

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院眼科，黑龍江 牡丹江 157011)

Wadding在1939年提出“表觀遺傳”這一概念，引入了“表觀遺傳景觀”，用來描述將遺傳特征轉(zhuǎn)化為可視化表型的分子和生物學(xué)機(jī)制，涵蓋了基因型和表型的概念[1]。目前，表觀遺傳學(xué)主要的調(diào)控機(jī)制是DNA甲基化沉默基因的表達(dá)，DNA甲基化可以改變DNA分子的活性，而不改變堿基序列。通過一組DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,Dnmts)催化DNA來影響基因活性，發(fā)揮重要的生物學(xué)功能[2]。年齡相關(guān)性白內(nèi)障(age-related cataract,ARC)是由晶狀體渾濁導(dǎo)致的全球首位致盲性眼病，發(fā)病機(jī)制尚未明確，與遺傳和環(huán)境的交互作用密切相關(guān)。研究表明，ARC除了與一些基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)相關(guān)，晶狀體相關(guān)基因的DNA甲基化對它的發(fā)病機(jī)制也起到重要作用[3]。為了對進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)，本文就近年來DNA甲基化在ARC的發(fā)病機(jī)制中的作用進(jìn)行綜述。

1 DNA甲基化

對于哺乳動物而言，DNA甲基化是指在Dnmts的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)作為甲基(-CH3)供體，將甲基基團(tuán)選擇性地轉(zhuǎn)移并添加到CpG(Cytosine-phosphate-Guanine,CpG)二核苷酸的胞嘧啶5號碳原子上的過程，變成5-甲基胞嘧啶。這是一個非常重要的表觀遺傳修飾事件，DNA甲基化修飾可以改變DNA分子的活性，而不改變基因的堿基序列。以此來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，即甲基化去除之后就像基因解開封印，用完之后通過甲基化再封印起來。并且影響許多關(guān)鍵過程，例如基因組印記和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等[4]。

CpG島是指CpG二核苷酸位于并富集在一個集群，即富含CG序列的區(qū)域，存在于大多數(shù)哺乳動物的啟動子區(qū)，是DNA發(fā)生甲基化的位置。CpG里的C是DNA四種堿基之中的胞嘧啶的縮寫，p代表磷酸，G是堿基鳥嘌呤。CpG島的長度要大于500bp，CG含量超過55%，CpG比值大于0.65。人類基因組大概有4萬個CpG島，大部分位于啟動子區(qū)域，研究一個基因啟動子DNA甲基化就是找CpG島的位置，啟動子CpG島甲基化之后會誘發(fā)基因沉默，啟動子CpG島甲基化與轉(zhuǎn)錄活性呈負(fù)相關(guān)[5]。

DNA甲基化是可逆的酶促反應(yīng)，目前已知哺乳動物的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶有6種：DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3C和DNMT3L。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能上的差異分為：維持甲基化和從頭甲基化。DNMT1主要起維持甲基化的作用，它使僅有1條鏈甲基化的DNA雙鏈完全甲基化，參與DNA復(fù)制雙鏈中新合成子鏈的的甲基化；DNMT3A和DNMT3B主要負(fù)責(zé)從頭甲基化，即是指對DNA鏈甲基化狀態(tài)的重構(gòu)，不依賴與DNA雙鏈的復(fù)制過程，是在完全非甲基化的位點(diǎn)上添加甲基基團(tuán)，使未甲基化的DNA變成甲基化狀態(tài)的DNA[6]。

目前，在癌癥的研究中表明，某些腫瘤抑癌基因的失活是由于啟動子區(qū)域內(nèi)的高甲基化導(dǎo)致的，原癌基因的激活則相反；在不同類型的癌癥中，幾乎都發(fā)現(xiàn)全身廣泛的基因被DNA甲基化沉默。DNA甲基化與去甲基化過程是動態(tài)可逆的，以此來沉默和激活基因。因此，針對DNA甲基化狀態(tài)改變?yōu)榘悬c(diǎn)的疾病治療方法有重大研究價值。

2 年齡相關(guān)性白內(nèi)障

ARC由晶狀體混濁導(dǎo)致的全球首位致盲性眼病，據(jù)估計全球有1600萬人受到影響[2]?；疾÷屎桶l(fā)病率都在較高水平，存在年齡、性別、地區(qū)、受教育程度和種族等差異，同時ARC是導(dǎo)致中老年人住院的最常見眼病[7]。環(huán)境因素和遺傳因素是其共同的致病因素，與衰老密切相關(guān)，隨著世界人口的增長和老齡化加劇，ARC的患病率正在逐年上升[8]。目前，ARC的具體發(fā)病原因尚不明確，由活性氧(active oxygen species,ROS)介導(dǎo)的氧化應(yīng)激被認(rèn)為是ARC發(fā)病的主要啟動因素。而且，年齡相關(guān)性白內(nèi)障治療手段單一，以手術(shù)治療為主，但是手術(shù)治療的并發(fā)癥嚴(yán)重，是目前困擾年齡相關(guān)性白內(nèi)障治療的主要難題；同時手術(shù)治療水平也參差不齊，也是影響手術(shù)治療效果的重要因素[2,7]。為了找到治療和預(yù)防ARC的更多新途徑，近年來針對年齡相關(guān)性白內(nèi)障的表觀遺傳學(xué)研究也在積極開展。

3 年齡相關(guān)性白內(nèi)障中相關(guān)基因的甲基化

3.1 ARC相關(guān)基因的甲基化測序近年來，晶狀體相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)改變與白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制研究成為探索疾病機(jī)制的新途徑。You等[9]對3只白內(nèi)障大熊貓和3只健康大熊貓進(jìn)行了全基因組甲基化測序，分別鑒定出兩組之間的116和242個差異甲基化基因(Differentially Methylated Genes,DMG)。進(jìn)一步的KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)和GO(Gene Ontology,GO)富集分析確定了110個差異甲基化基因，其中EEA1、GARS、SLITRK4、GSTM3、CASP3和EGLN3在內(nèi)的6種DMG與ARC有關(guān)。該研究對象是大型哺乳動物，分析結(jié)果對于人類ARC的研究也有重要意義。Wang[10]等收集了50歲以上ARC患者的晶狀體前囊膜樣品，進(jìn)行甲基化微陣列分析，并且通過高通量測序方法鑒定甲基化基因。和對照組相比，發(fā)現(xiàn)843個位點(diǎn)甲基化，其中包括802個高甲基化位點(diǎn)和542個對應(yīng)基因，41個去甲基化位點(diǎn)和29個對應(yīng)基因。篩選出一些與ARC相關(guān)的基因，代表性基因有COL4A1、GJA3和SIPA1L3[10]。DNA甲基化微陣列對差異甲基化基因的有效篩選，對這些基因在ARC中的進(jìn)一步研究意義重大。Wang等[11]研究調(diào)查了ARC患者晶狀體上皮細(xì)胞(Lens Epithelial Cells,LECs)中DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)基因的表達(dá)譜。通過微陣列分析評估基因的表達(dá)水平；通過定量實(shí)時PCR(qRT-PCR)和Western印跡分析進(jìn)一步證實(shí)了結(jié)果，與對照相比，ARC患者的LECs中5種基因(DNMT3B、HDAC1、HDAC4、HDAC9和MBD3)的mRNA和蛋白質(zhì)水平增加，該研究為LECs中的表觀遺傳修飾與ARC的形成提供了依據(jù)[8]。

3.2 DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因雖然ARC的發(fā)病機(jī)制并未明確，但是氧化損傷導(dǎo)致的DNA雙鏈破壞，所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是主要原因。而且DNA損傷和DNA修復(fù)功能異常被認(rèn)為是ARC的發(fā)病機(jī)理，LECs的DNA損傷修復(fù)基因功能是否完整與ARC的發(fā)生密切相關(guān)[12-13]。Li等[12]調(diào)查了ARC患者LECs中DNA修復(fù)基因的表達(dá)水平，并且檢測了基因差異化表達(dá)是否與基因啟動子區(qū)域的DNA甲基化改變相關(guān)。通過qRT-PCR和亞硫酸氫鹽特異性PCR(bisulfite sequencing PCR,BSP)，確定了差異表達(dá)基因的DNA甲基化水平，與對照組相比，ARC患者的LECs中10個DNA修復(fù)基因的mRNA水平降低；而1個DNA修復(fù)基因表達(dá)水平升高，其中MGMT基因的啟動子區(qū)域在ARC組織中被高度甲基化，參與調(diào)節(jié)該基因的表達(dá)，并影響ARC的形成，該研究證實(shí)了DNA修復(fù)基因?qū)τ诰S持晶狀體透明性的重要作用，修復(fù)基因的改變與ARC的發(fā)病有關(guān)[8]。

8-氧代鳥嘌呤DNA糖基化酶1(8-oxoguanine DNA glycosylase 1,OGG1)是堿基切除修復(fù)(Base Excision Repair,BER)途徑中含的一種修復(fù)蛋白[14]。Wang等[14]選取臨床病例ARC患者和對照組各15例15眼，與對照組相比，發(fā)現(xiàn)OGG1第一外顯子中的CpG島在ARC晶狀體DNA中顯示出高度甲基化，OGG1在晶狀體皮質(zhì)中mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低，免疫熒光顯示OGG1陽性細(xì)胞比例明顯降低。發(fā)現(xiàn)OGG1表達(dá)降低與ARC晶狀體皮質(zhì)中的OGG1的CpG島的甲基化有關(guān)，而且用5-氮雜-20脫氧胞苷(5-aza-20 deoxycytidine,5-AZA -DC)誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞B-3(human lens epithelial cell B-3,HLEB-3)去甲基化可上調(diào)OGG1的表達(dá)[14]。

WRN(Werner綜合征基因)是一種DNA修復(fù)基因[15]。Zhu等研究了WRN啟動子甲基化水平與ARC患者晶狀體中基因表達(dá)水平的關(guān)系，選取了117例ARC患者和39例非ARC患者為對照，與對照組相比，ARC患者前晶狀體囊中的WRN表達(dá)明顯降低，ARC患者前晶狀體囊中的WRN啟動子的CpG島顯示出高甲基化。因此，WRN啟動子中的高甲基化，降低了晶狀體細(xì)胞DNA修復(fù)能力，調(diào)控ARC的形成[15]。此外，DNA甲基化調(diào)控的WRN通過ATM/p53信號通路抑制LECs的凋亡和氧化應(yīng)激，WRN受到異常甲基化調(diào)控時，會影響ARC的發(fā)生[16]。Jiang等發(fā)現(xiàn)在ARC患者的晶狀體前囊組織中，WRN被下調(diào)，WRN啟動子區(qū)的甲基化水平升高。研究表明WRN過表達(dá)和5-AZA -DC去甲基化作用，通過抑制ATM/p53信號通路，可以增強(qiáng)LECs的增值并能抑制其凋亡和氧化應(yīng)激；WRN的過表達(dá)還能消除氯喹激活的P53凋亡通路的作用，當(dāng)WRN被抑制時，則起到相反的作用[16]。

這些研究表面DNA修復(fù)基因的表觀遺傳修飾與ARC的發(fā)生機(jī)理相關(guān)。目前，對于DNA損傷修復(fù)基因的表觀修飾與ARC的關(guān)系研究，主要是檢測基因啟動子區(qū)的CpG島甲基化水平改變，具體的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

3.3 氧化平衡系統(tǒng)相關(guān)基因氧化應(yīng)激和抗氧化系統(tǒng)的失效是導(dǎo)致晶狀體氧化損傷的主要因素。ARC的發(fā)生與氧化應(yīng)激相關(guān)，而白內(nèi)障相關(guān)的氧化應(yīng)激相關(guān)基因的全基因組篩選尚未得到徹底研究[17]。

αA-晶狀體蛋白(CRYAA)的伴侶狀活性對維持晶狀體透明性必不可少。Liu等[18]的研究分析CRYAA甲基化修飾的潛在機(jī)制，首先預(yù)測CRYAA啟動子CpG島的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，再分析CpG位點(diǎn)甲基化對轉(zhuǎn)錄因子的影響，又用不同階梯濃度的Zebularine和不同的給藥時間來處理HLEB-3細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)了CRYAA啟動子的低甲基化抑制轉(zhuǎn)錄因子Sp1的DNA結(jié)合能力，導(dǎo)致CRYAA在HLECs中的表達(dá)下降，Zebularine治療通過劑量依賴性和時間依賴性的方式恢復(fù)CRYAA在HLECs中的水平[18]。未來，DNA甲基化可能提供CRYAA的靶向治療，減輕ARC患者中晶狀體的渾濁程度。

人LECs中存在核因子-類胡蘿卜素2-相關(guān)因子2(Nuclear factor-carotenoid2 related factor 2,Nrf2)，一種針對應(yīng)激的具有細(xì)胞保護(hù)作用的核轉(zhuǎn)錄因子，Nrf2可以激活近600個細(xì)胞保護(hù)性靶基因[19]。凱爾奇樣相關(guān)蛋白1(Keap1)是一種氧傳感器蛋白，通過蛋白酶體降解來調(diào)節(jié)Nrf2的水平；過表達(dá)的Keap1會降低Nrf2的水平，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化還原失衡，喪失晶狀體細(xì)胞抗氧化保護(hù)功能[19]。Gao等[17]研究不同年齡組的人晶狀體中Nrf2/Keap1的蛋白質(zhì)水平和基因表達(dá)及基因啟動子區(qū)的CpG島的甲基化狀態(tài)。結(jié)果顯示Keap1啟動子區(qū)的去甲基化上調(diào)了Keap1蛋白的表達(dá)，從而增加了Nrf2的降解，導(dǎo)致Nrf2下游抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄活性受到抑制，最終導(dǎo)致該抗氧化系統(tǒng)失衡，形成ARC[17]。另一些研究也證明，由于Keap1基因啟動子區(qū)的CpG島的去甲基化，同時也還發(fā)現(xiàn)該去甲基化過程是由于激活DNA脫甲基途徑酶(Tet1)導(dǎo)致，最終使過表達(dá)的Keap1降低了Nrf2的水平，從而廢除依賴于Nrf2的抗氧化劑保護(hù)。

3.4 抗衰老相關(guān)基因衰老是與年齡有關(guān)眼病的主要危險因素，尤其是ARC的發(fā)生與衰老關(guān)系密切。Klotho基因是抗衰老基因，表達(dá)水平與年齡密切相關(guān)，其編碼的Klotho蛋白可能在哺乳動物中起到抗衰老作用，影響與年齡有關(guān)的疾病。Jin等[20]通過對青年正常人，中年ARC患者和老年ARC患者各30例分3組，分別進(jìn)行了Klotho基因RT-PCR，免疫組化染色，甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(methylation-specific polymerase chain reaction,MSP )檢測。研究首次發(fā)現(xiàn)Klotho基因在正常人晶體上皮細(xì)胞有表達(dá)，且青年組表達(dá)呈強(qiáng)陽性(100%)，中年組弱陽性(36.7%)，老年組陰性(0%)；Klotho基因在老年人群中甲基化程度高(93.3%)，在中年組中弱甲基化(56.7%)?？梢园l(fā)現(xiàn)mRNA及蛋白的表達(dá)均隨著年齡增加而下降，而Klotho啟動子區(qū)CpG島甲基化程度隨年齡增加而增加，且該啟動子區(qū)的超甲基化會導(dǎo)致Klotho基因沉默以及Klotho蛋白的表達(dá)下調(diào)或無表達(dá)，最終影響ARC的形成。

4 總結(jié)與展望

目前的研究可以證明DNA甲基化水平是ARC發(fā)生的重要影響力量，將來需要更全面地探索DNA甲基化修飾的完整范圍。ARC是由環(huán)境風(fēng)險因素和遺傳風(fēng)險因素共同引起的[8]。DNA甲基化與環(huán)境和衰老的變化關(guān)系密切，通過DNA甲基化改變影響基因表達(dá)，而基因表達(dá)變化為疾病的發(fā)展或進(jìn)程奠定了基礎(chǔ)。目前，已在疾病中鑒定出與ARC有關(guān)的潛在DNA甲基化位點(diǎn)。然而，對該疾病產(chǎn)生作用的所有的DNA甲基化位點(diǎn)及位點(diǎn)之間的內(nèi)在聯(lián)系仍需要深入探索。盡管已證明DNMTs抑制劑在癌癥中特別有效，但這些藥物尚未應(yīng)用于包括白內(nèi)障在內(nèi)的人類眼科疾病。將來，更深入的研究需要集中于ARC的早期生物標(biāo)記物和新的治療靶點(diǎn)。