地參總黃酮的提取及抗氧化活性研究*

湯承浩，胡秀虹，文廷珊

(凱里學(xué)院大健康學(xué)院，貴州 凱里 556011)

地參(LycopuslucidusTurcz.)屬唇形科(Labiatae)多年生草本植物，別名蟲(chóng)草參、地蠶子、草石蠶，因其形狀、營(yíng)養(yǎng)成分與人參相似而得名。植株主要分布于云南、江西、江蘇、四川、湖南、湖北、貴州等地[1]。地參全草均可以入藥，具有利尿、活血、滋陽(yáng)、利關(guān)節(jié)同時(shí)還有多種生物活性，如增強(qiáng)免疫功能，抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血脂等作用[2-3]。

楊書(shū)良等[4]首先用溫浸的方法提取北豆根中蝙蝠葛堿的含量，接著用滲漉法，最后采用超聲波法，在其他條件不變的情況下對(duì)提取率進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲提取法用時(shí)較短，提取率比其他的兩種方法高效。高岐[5]等人運(yùn)用微波提取金銀花中總黃酮，提取率為2.73%；向極遷等[6]運(yùn)用超聲法從金銀花中提取總黃酮，提取率高達(dá)8.84%，可見(jiàn)同種植物超聲提取的提取率比較高。劉華等[7]在提取因素不變情況下，同時(shí)采用超聲法及微波法，提取韭菜中總黃酮，超聲各個(gè)方面均優(yōu)于微波法。郭文娟等[8-10]用超聲方法分別從山楂核、藏藥刀豆、廣豆根中提取總黃酮，與對(duì)照品進(jìn)行比較，黃酮提取液用于清除DPPH·效果較好，清除率越高抗氧化能力越強(qiáng)。植物總黃酮提取含量測(cè)定常采用紫外分光光度法[11]，利用黃酮類物質(zhì)可被亞硝酸鈉還原和硝酸鋁絡(luò)合在堿性條件下會(huì)顯紅色的性質(zhì)，以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品，在最大波長(zhǎng)處可以測(cè)定植物中總黃酮含量。

超聲技術(shù)提取地參總黃酮，工藝簡(jiǎn)便、高效、快速、成本低，所用的提取溶劑乙醇較其他工藝用量少。在黃酮研究中選取地參為提取物較少報(bào)道，選用價(jià)格相對(duì)較低的乙醇為提取劑可以降低實(shí)驗(yàn)成本。地參抗氧化劑能有效清除體內(nèi)多余自由基，不但能延緩衰老還能減少和預(yù)防疾病。

1 材料與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料選取黔東南州凱里市萬(wàn)潮鎮(zhèn)培植的地參。采摘時(shí)間2016年11月。將新鮮的地參的根部分洗凈，瀝干表面水分，切成小塊，置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中，設(shè)置溫度80 ℃。干燥好后用粉碎機(jī)將其粉碎，過(guò)40目篩，作為供試樣品。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與設(shè)備

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品鑒定所，批號(hào)：NACC-60013)、亞硝酸鈉(畢得醫(yī)藥)、硝酸鋁(畢得醫(yī)藥)、氫氧化鈉(畢得醫(yī)藥)、1，1-二苯基-2-2苯肼基自由基(梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司)、VC(上海山浦化工有限公司)、無(wú)水乙醇(探索平臺(tái))，實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、小型高速粉碎機(jī)(青州市精誠(chéng)醫(yī)藥裝備制造有限公司)、分樣篩(湖南長(zhǎng)沙思科儀器沙篩廠)、電子天平(奧豪斯儀器(常州)有限公司)、超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)、超純水機(jī)(艾柯成都康氏康寧科技有限公司)、紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品制備

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品25 mg置于小燒杯中，加70%乙醇溶液3 mL，用玻璃棒攪拌至完全溶解，再將其轉(zhuǎn)至50 mL容量瓶中，用70%的乙醇溶液定容，搖勻，得到50 mg·mL-1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

2.2 樣品提取液制備

稱取地參粉末1.0048 g(過(guò)40目篩)，置于50 mL錐形瓶中，加入70%乙醇溶液20 mL，蓋上玻璃塞，搖勻。超聲15 min，超聲功率100 W，冷卻抽濾，將濾液轉(zhuǎn)至50 mL容量瓶中，加70%乙醇溶液定容，得到地參提取液，備用。

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)

取以上蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液4 mL和地參提取溶液1 mL，置于50 mL容量瓶中，加入70%乙醇溶液10 mL，然后加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，再加入10 %的硝酸鋁溶液1 mL，搖勻后靜置7 min后，最后加入5%氫氧化鈉溶液10 mL，用70%乙醇溶液定容至刻度，搖勻后靜置15 min，以相應(yīng)試劑做空白，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)200～800 nm之間進(jìn)行掃描，掃描結(jié)果顯示，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和地參提取液在510 nm處有最大波長(zhǎng)。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密移取標(biāo)準(zhǔn)品溶液4.00 mL、6.00 mL、8.00 mL、10.00 mL于50 mL容量瓶中，分別加入70%乙醇溶液10 mL并加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，靜置6 min；然后加入10%硝酸鋁溶液1 mL，靜置7 min；最后加入5%氫氧化鈉溶液10 mL，用70%乙醇溶液定容，搖勻后靜置15 min。于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

2.5 單因素實(shí)驗(yàn)

2.5.1 乙醇濃度的選擇

稱取1.0019 g地參粉末，分別加入不同濃度(40%、50%、60%、70%、80%、90%)的乙醇溶液20 mL，超聲功率100 W，時(shí)間15 min。

2.5.2 超聲功率的選擇

稱取1.0041 g地參粉末，加入70%的乙醇溶液20 mL，設(shè)置超聲時(shí)間15 min，超聲功率分別為100 W、137.5 W、175 W、212.5 W、250 W。

2.5.3 超聲時(shí)間的選擇

稱取1.0048 g處理好的地參粉末，加入70%乙醇溶液20 mL，設(shè)置超聲功率175 W，超聲時(shí)間分別為10 min、15 min、20 min、25 min、30 min。

2.5.4 料液比的選擇

稱取1.0052 g地參粉末5份，分別加入70%乙醇溶液20 mL、25 mL、30 mL、35 mL、40 mL，超聲功率175 W，超聲時(shí)間20 min。

2.6 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，得出單個(gè)因素最佳水平，為了進(jìn)一步考察各實(shí)驗(yàn)因素對(duì)總黃酮提取率的影響，以乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、超聲功率(B)、超聲時(shí)間(C)、料液比(D)為總黃酮提取率(Y)的評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)。

2.7 抗氧化活性研究

2.7.1 DPPH·溶液配制

精密稱取4.4 mg DPPH·粉末置于小燒杯中，溶解后轉(zhuǎn)到100 mL棕色容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容至刻度，搖勻，避光保存，備用。

2.7.2 樣品提取液配制

配制方法與2.7.1相似，將提取液稀釋為0.1924 mg·mL-1，避光保存，備用。

2.7.3 VC溶液配制

精密稱取48.1 mg VC粉末，置于小燒杯中，加入3 mL無(wú)水乙醇攪拌溶解。將其轉(zhuǎn)入100 mL棕色容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容。精密移取1 mL置于25 mL容量瓶中用無(wú)水乙醇定容，搖勻，避光保存，備用。

2.7.4 地參總黃酮對(duì)DPPH·清除作用的研究

方法參考了文獻(xiàn)[8-10]。提前準(zhǔn)備好10 mL棕色容量瓶，第一瓶加入5 mL DPPH·，第二瓶加入地參提取液及DPPH·，第三瓶加入地參提取液，分別用無(wú)水乙醇定容。按照此法加入DPPH·體積不變，地參提取液依次加入量為1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL、3.00 mL。無(wú)水乙醇作為空白，在517 nm處分別測(cè)定DPPH·(A0)，DPPH·加地參提取液(A1)，以及加入的地參提取液(A2)吸光度值。算出清除率。

2.7.5 VC對(duì)DPPH·清除作用的研究

同等體積地參提取液溶液換成VC，依次算出不同濃度下VC對(duì)DPPH·的清除率，再和地參提取液做比較。

DPPH·清除率公式：DPPH·清除率(%)=[A0-(A1-A2)/A0]×100%

A0：DPPH·+無(wú)水乙醇；

A1：地參提取液+DPPH·；

A2：地參提取液+無(wú)水乙醇。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以蘆丁濃度作為橫坐標(biāo)，測(cè)得的吸光度為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1，蘆丁在0.04～0.10 mg·mL-1之間線性關(guān)系良好。

圖1 蘆丁溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

3.2 單因素實(shí)驗(yàn)

3.2.1 乙醇濃度的影響

由圖2可以看出，乙醇濃度從50%增長(zhǎng)到70%，提取率增高，乙醇濃度為70%時(shí)達(dá)到最大值；繼續(xù)增加乙醇濃度，提取率迅速下降。從成本和提取量來(lái)考慮，乙醇濃度最好控制在70%左右。

圖2 不同乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of different ethanol concentration on theextraction rate of total flavonoids

3.2.2 超聲功率的影響

從圖3可見(jiàn)，超聲功率在100 W到175 W時(shí)提取率逐漸提高，隨后功率增大提取率漸漸降低。可見(jiàn)功率太低不能將所需成分提取出來(lái)；而功率過(guò)高則會(huì)破壞有效成分，由此選取功率175 W為宜。

圖3 不同超聲功率對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of different ultrasonic power on theextraction rate of total flavonoids

3.2.3 超聲時(shí)間的影響

從圖4可見(jiàn)，從超聲10 min開(kāi)始每間隔5 min提取率上升，20 min后提取率逐漸下降，可見(jiàn)超聲時(shí)間太短無(wú)法提取出黃酮類化合物；時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)被破壞，因此選擇超聲時(shí)間20 min相對(duì)較好。

圖4 不同超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of different ultrasonic time on theextraction rate of total flavonoids

3.2.4 料液比的影響

料液比對(duì)地參總黃酮提取率的影響如圖5所示，在料液比為1∶30 g·mL-1時(shí)，地參總黃酮提取率最好，當(dāng)料液比小于1∶30 g·mL-1時(shí)，活性物質(zhì)不能完全被析出；當(dāng)料液比大于1∶30 g·mL-1后，提取率逐漸下降。綜合提取效果和減少溶劑用量等方面考慮，選取料液比1∶30 g·mL-1較合適。

圖5 不同料液比對(duì)總黃酮提取率影響Fig.5 Effect of different solid-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids

3.3 正交實(shí)驗(yàn)

選擇的因素見(jiàn)表1，組成的正交實(shí)驗(yàn)見(jiàn)表2。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平Tab.1 Factors and levels of the orthogonal experiment

表2 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 L9(34) orthogonal test results

續(xù)表2

由表2可看出，各個(gè)因素對(duì)地參總黃酮提取率的影響依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)>料液比>超聲時(shí)間>超聲功率。得到的最佳條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)70 %、超聲功率175 W、超聲時(shí)間20 min、料液比1∶30 g·mL-1，此條件下平行測(cè)定三次，提取率為96.25 mg·g-1。

3.4 抗氧化活性研究

比較相同體積濃度下地參提取液及VC對(duì)DPPH·的影響，見(jiàn)圖6。

圖6 總黃酮及VC對(duì)DPPH·的清除作用Fig.6 Scavenging effect of total flavonoids and Vc on DPPH·

由圖6可知，在以上選定濃度范圍內(nèi)，地參總黃酮濃度越高，清除能力越強(qiáng)，與VC相比，通過(guò)回歸方程可以計(jì)算出地參總黃酮IC50=0.00272 mg·mL-1；VC的IC50=0.00455 mg·mL-1，地參總黃酮提取液對(duì)DPPH·表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除能力，地參提取液對(duì)DPPH·的清除能力強(qiáng)于VC。

4 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)研究利用超聲法提取地參總黃酮化合物工藝并對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行測(cè)試?？疾炝艘掖俭w積分?jǐn)?shù)、超聲功率、超聲時(shí)間、料液比四個(gè)因素對(duì)總黃酮提取率的影響，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得出最佳提取工藝，并采用DPPH·法對(duì)地參總黃酮的自由基清除能力和總抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：地參總黃酮最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，超聲功率為175 W，超聲時(shí)間為20 min，料液比為1∶30?？傸S酮提取率高達(dá)96.25 mg·g-1。且超聲提取法得到的地參提取物對(duì)DPPH·有很好清除作用，IC50值為0.00272 mg·mL-1。