松果菊苷通過(guò)上調(diào)PGC-1/NFR 信號(hào)通路促進(jìn)線粒體生物合成抑制心肌細(xì)胞凋亡

倪雅娟，白鴻遠(yuǎn)，朱文靜，劉 暢，王小芳

（西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，陜西西安 710004）

心肌細(xì)胞凋亡是心力衰竭發(fā)生的重要病理機(jī)制之一[1]。線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是凋亡的重要途徑，而線粒體生物合成受到抑制可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[2-4]。線粒體生物合成是一個(gè)嚴(yán)格調(diào)控的生物過(guò)程[5]，過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體γ共活化劑-1（peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator-1,PGC-1）是調(diào)控該過(guò)程的重要因子[6]，PGC-1 的表達(dá)變化與線粒體生物合成功能直接相關(guān)。核呼吸因子（nuclear respiratory factor, NRFs）作為 PGC-1 下游轉(zhuǎn)錄因子靶標(biāo)，是連接核編碼基因和線粒體生物合成主要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子；線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochondrial transcription factor, TFAM）是 mtDNA 轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所必需的，通過(guò)序列特異性方式與線粒體啟動(dòng)子序列（包括重鏈和輕鏈特異性啟動(dòng)子）結(jié)合，從而有效激活mtDNA 轉(zhuǎn)錄[7-8]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)中藥肉蓯蓉提取物松果菊苷（echinacoside, ECH）可抑制大鼠心肌重構(gòu)，改善心功能[9]，然而具體機(jī)制并不十分清楚。本研究觀察ECH 通過(guò)PGC-1/NFR 信號(hào)通路對(duì)線粒體生物合成和心肌細(xì)胞凋亡的影響，以闡明ECH 的作用機(jī)制，并為進(jìn)一步研發(fā)防治心力衰竭新藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及儀器與試劑

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠，遺傳基本組成為遠(yuǎn)交群大鼠，系雜合的雄性大鼠和Wistar 雌性大鼠雜交后育成的一個(gè)白化封閉群大鼠，5 周齡，體質(zhì)量140～160 g，購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(陜)2012-003。

THONOS 2500心臟彩色超聲診斷儀(美國(guó)惠普公司)，透射電鏡（H-7650，日本日立公司），超微量分光光度計(jì)（美國(guó)NanoDrop 公司），PCR 擴(kuò)增儀、Real-time PCR 儀（美國(guó)Bio-Rad公司），F(xiàn)ermentas反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó) Fermentas 公司），SYBR?PrimeScriptTMRTPCR Kit（日本TaKaRa公司），ECH（美國(guó)MCE 公司），Bax、Bcl-2、β-actin 兔抗大鼠多克隆抗體（美國(guó) Santa Cruz 公司)、羊抗兔IgG.FITC(武漢博士德生物工程有限公司)，微型凝膠電泳系統(tǒng)、Chemi-Doc XRS 化學(xué)發(fā)光熒光成像儀(美國(guó) Bio-Rad 公司)，ECL 發(fā)光液(美國(guó)Pierce 公司)，BCA 蛋白定量試劑盒、單去污裂解液(美國(guó) Biotech 公司)，蛋白酶抑制劑混合物(cocktail，美國(guó) Roche 公司)。

1.2 ISO 誘導(dǎo)大鼠心力衰竭模型的建立及評(píng)價(jià)

SD大鼠隨機(jī)分為Ctrl組、HF組和ECH組，均為n=7。Ctrl組無(wú)干預(yù)；HF 組采用腹腔注射 10 mg/（kg·d）異丙腎上腺素（ISO），持續(xù)2周；ECH組在注射ISO前30 min予ECH 20 mg/（kg·d）腹腔注射預(yù)處理。給藥干預(yù)持續(xù)2周后，行心臟超聲檢查，評(píng)價(jià)各組大鼠心功能。

1.3 Western blotting 檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

左心室心肌組織取材、勻漿，提取總蛋白，具體參照文獻(xiàn)方法[10]。BCA 法測(cè)定蛋白濃度后，95 ℃煮沸5 min 變性，上樣、電泳，100 V 恒壓轉(zhuǎn)膜 90 min 轉(zhuǎn)膜，在50 g/L 脫脂奶粉的TBST 中4 ℃過(guò)夜封閉，孵育一抗（Bax、Bcl-2，1∶200），洗滌后滴加二抗（羊抗兔IgG HRP 抗體）孵育，ECL 試劑盒顯色，ChemiDoc XRS 化學(xué)發(fā)光熒光成像儀采集圖像，Quality One 軟件分析結(jié)果，以目的蛋白條帶累計(jì)吸光度值／內(nèi)參β-actin 累計(jì)吸光度值評(píng)價(jià)蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.4 透射電鏡觀察心肌線粒體數(shù)量及質(zhì)量

100 mL/L 水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠并取出心臟，左心室心肌組織取材，4 ℃固定于25 mL/L 戊二醛中，剪碎為約1 mm3的立方體，再固定2 h 后洗滌，10 g/L 鋨酸固定，丙酮脫水，包埋，37 ℃烘箱過(guò)夜，制作 0.8 μm 超薄切片，透射電鏡下（30 000 倍）計(jì)數(shù)線粒體個(gè)數(shù)及空泡化變性的線粒體（空泡化線粒體有雙層膜結(jié)構(gòu)，有殘存的嵴結(jié)構(gòu)，形狀不異常大）。線粒體空泡化率=（空泡化線粒體個(gè)數(shù)／所觀察到的線粒體總數(shù))×100%，線粒體密度=(正常形態(tài)的線粒體個(gè)數(shù)/100 μm2視野)。每張切片共計(jì)數(shù)10 個(gè)不同視野，每組觀察3 張切片。

1.5 檢測(cè)線粒體生物合成相關(guān)基因PGC-1、NFR-1、NFR-2、TFAM 的 mRNA 表達(dá)

左心室心肌組織取材同1.3 項(xiàng)，勻漿后Trizol法提取總RNA，紫外分光光度法測(cè)定RNA 的純度及濃度，按照Fermentas 公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 后，構(gòu)建Real-time PCR 反應(yīng)體系，加入引物（表 1）并擴(kuò)增，94 ℃ 3 min 預(yù)變性，94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s（循環(huán) 45 次）；72 ℃ 10 min，Realtime PCR IQ5TM 采集擴(kuò)增信號(hào)，獲得循環(huán)閾值（CT值），以 2-ΔΔCT法分析結(jié)果。

表1 RT-PCR 的基因引物序列Tab.1 Primer sequence of genes

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 15.0 軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布，方差齊性，3 組間比較用單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 超聲心動(dòng)圖觀察心功能情況

超聲心動(dòng)圖觀察結(jié)果顯示，HF 組大鼠LVEDs、LVEDd 較對(duì)照組增加, LVEF 與LVFS 較對(duì)照組明顯降低，提示HF 組大鼠心功能明顯降低；而ECH 干預(yù)組 LVEF 及 LVFS 明顯提高，LVEDs 及 LVEDd 降低(均P＜0.01，表 2)。這提示 ECH 可明顯改善 HF 大鼠心功能。

表2 各組大鼠超聲心動(dòng)圖觀察指標(biāo)的比較Tab.2 Comparison of echocardiographieal results among the three groups(n=7)

2.2 ECH 對(duì)HF 大鼠心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western bloting 檢測(cè)結(jié)果表明，HF 組大鼠心肌組織促凋亡蛋白Bax 表達(dá)明顯升高，而ECH 組Bax表達(dá)明顯下調(diào)，HF 組抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)明顯下調(diào)，而ECH 組Bcl-2 表達(dá)上調(diào)，證實(shí)ECH 明顯下調(diào)Bax，且上調(diào) Bcl-2（均P＜0.01，圖 1）。提示 ECH 可能抑制HF 大鼠心肌細(xì)胞凋亡。

圖1 ECH 抑制Bax 蛋白表達(dá)并上調(diào)Bcl-2 蛋白表達(dá)Fig.1 ECH inhibited the expression of bax and up-regulated the expression of Bcl-2

2.3 透射電鏡觀察結(jié)果

透射電鏡下可見(jiàn)，HF 組形態(tài)、結(jié)構(gòu)異常（大小不均一、結(jié)構(gòu)模糊）的線粒體密度較Ctrl 組明顯增加，出現(xiàn)大量線粒體腫脹、嵴模糊、崩塌或凝集、壞死、空泡化等改變，而形態(tài)規(guī)整線粒體密度明顯減少；ECH 組形態(tài)正常的線粒體較HF 組明顯增加，變性的線粒體明顯減少。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果示，三組間線粒體密度及線粒體空泡化率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，HF 組形態(tài)規(guī)整的線粒體密度較Ctrl 組明顯減少，而線粒體變性率較Ctrl 組明顯增加；ECH 組線粒體變性較HF 組明顯減輕，正常形態(tài)的線粒體密度明顯增加，線粒體變性率減少（P＜0.05，圖2）。結(jié)果提示，ECH 可能促進(jìn)線粒體生物合成，抑制線粒體變性。

圖2 透射電鏡觀察各組心肌細(xì)胞線粒體變化及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果Fig.2 The changes of mitochondria in myocardium were observerd with transmission electron microscopy in the three groups and statistical histogram

2.4 各組心肌組織 PGC-1、NFR-1、NFR-2、TFAM的mRNA 表達(dá)情況

Real-time PCR 結(jié)果顯示，HF 組心肌組織中PGC-1、NFR-1、NFR-2、TFAM 的 mRNA 較 Ctrl 組明顯下調(diào)，ECH 干預(yù)可明顯上調(diào)各基因mRNA 表達(dá)（P＜0.05，圖 3）。這提示 ECH 通過(guò)上調(diào) PGC-1/NFRs 信號(hào)通路而促進(jìn)線粒體生物合成。

圖3 Real-time PCR 檢測(cè)各組心肌組織中線粒體生物合成相關(guān)基因的mRNA 表達(dá)情況Fig. 3 The mRNA expressions of genes promoting mitochondrial biosynthesis in myocardium were detected by Real-time PCR

3 討 論

心肌細(xì)胞凋亡導(dǎo)致心肌細(xì)胞丟失是心力衰竭的重要病理機(jī)制之一[11]。研究顯示心衰代償期腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活，引起線粒體生物合成增強(qiáng)，線粒體密度增加，以代償性滿足心肌代謝的能量需求，然而隨著心衰進(jìn)展，線粒體生物合成鈍化、受損，線粒體形態(tài)異常、變性、壞死，心衰轉(zhuǎn)為失代償[12]。線粒體生物合成是一種自我保護(hù)機(jī)制，通過(guò)合成線粒體維持自身結(jié)構(gòu)、功能和數(shù)量的穩(wěn)定,以保證細(xì)胞線粒體正常的代謝過(guò)程[13]。線粒體生物合成與凋亡的關(guān)系密切，促進(jìn)線粒體生物合成可抑制細(xì)胞凋亡，反之，抑制線粒體生物合成可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是重要的凋亡機(jī)制之一[2-4]。近期研究表明，促進(jìn)線粒體生物合成的策略可明顯防治心力衰竭[14-15]。

ECH 是苯乙醇苷類(lèi)化合物，從我國(guó)傳統(tǒng)中藥肉蓯蓉中提取，近來(lái)大量研究證實(shí)其具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗腫瘤等藥理作用[16-17]，但研究主要集中于神經(jīng)系統(tǒng)及腫瘤。本研究證實(shí)ECH 可改善心力衰竭大鼠心功能，與文獻(xiàn)結(jié)果具有一致性，且補(bǔ)充了ECH治療心力衰竭研究的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。如前所述，線粒體生物合成及凋亡與心力衰竭關(guān)系密切，而信號(hào)通路PGC-1/NRFs 及其下游分子TFAM 是線粒體生物合成的關(guān)鍵通路。因此，本研究進(jìn)一步探討了ECH對(duì)凋亡相關(guān)蛋白及信號(hào)通路PGC-1/NRFs 的表達(dá)影響，結(jié)果顯示HF 組凋亡保護(hù)蛋白Bcl-2 的表達(dá)明顯減低，促凋亡蛋白Bax 明顯上調(diào)，且線粒體生物合成相關(guān)基因 PGC-1、NFR-1、NFR-2、TFAM 的 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，而ECH 干預(yù)時(shí)可逆轉(zhuǎn)HF 模型中的這種改變。與HF 組相比，ECH 組凋亡保護(hù)蛋白Bcl-2的表達(dá)明顯上調(diào)，促凋亡蛋白Bax 下調(diào)，且明顯上調(diào)線粒體生物合成相關(guān)基因的表達(dá)，并且形態(tài)規(guī)則的線粒體增加，線粒體變性率減少。這些結(jié)果提示，ECH可能通過(guò)上調(diào)PGC-1/NRFs 信號(hào)通路促進(jìn)線粒體生物合成而抑制心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而改善心功能。然而，心力衰竭是一個(gè)極其復(fù)雜的病理生理過(guò)程，ECH改善心功能及其對(duì)凋亡及線粒體生物合成的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究，闡明ECH 的作用機(jī)制將為研發(fā)新型的抗心力衰竭藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。