牛膝多糖通過Notch1 通路影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向髓核樣細(xì)胞分化的機(jī)制

岳宗進(jìn)，劉汝銀，于 露，王新立，徐向陽

（河南省中醫(yī)院/河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院脊柱科，河南鄭州 450000）

椎間盤退變（intervertebral disc degeneration,IDD）是中老年人的常見病和多發(fā)病，源于髓核組織退變，特點(diǎn)為髓核細(xì)胞數(shù)量、髓核含水量及蛋白多糖含量減少等[1]。IDD 加重引起腰痛、下肢疼痛麻木、腰椎支撐功能下降、間歇性跛行，甚至導(dǎo)致尿便失禁及性功能障礙[2]。臨床通過手術(shù)和保守方法治療IDD 具有一定效果，但不能逆轉(zhuǎn)病理進(jìn)程、恢復(fù)椎間盤組織。目前，通過注射椎間盤細(xì)胞、軟骨細(xì)胞或干細(xì)胞治療IDD 的再生醫(yī)學(xué)在各種動(dòng)物模型中得到廣泛研究[3]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells, BMSCs）可在不同誘導(dǎo)條件下分化為髓核樣細(xì)胞[4]，BMSCs 向髓核樣細(xì)胞分化的誘導(dǎo)劑及作用機(jī)制研究對(duì)治療IDD 具有重要意義。牛膝多糖（achyranthes bidentata polysaccharides, ABPS）是從牛膝中提取的多糖類化合物，具有抗腫瘤、抗衰老、抗凝血及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[5]。近年研究顯示，ABPS 可以影響骨髓源破骨細(xì)胞的分化[6]。Notch 通路是一條高度保守的信號(hào)通路，在骨骼發(fā)育過程中起重要作用。Notch1 是Notch 家族中重要成員之一，既往研究顯示，Notch1敲低后，可促進(jìn)新西蘭兔間充質(zhì)干細(xì)胞向髓核樣細(xì)胞分化[7]?；谝陨涎芯浚茰y(cè)ABPS可影響B(tài)MSCs向髓核樣細(xì)胞分化，但其具體作用機(jī)制報(bào)道甚少。因此，本研究以BMSCs 為對(duì)象，探討ABPS 是否可通過調(diào)控Notch 通路，進(jìn)而影響B(tài)MSCs 向髓核樣細(xì)胞分化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí) SD 雄性大鼠 5 只，4 周齡，體質(zhì)量80～100 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)為SCXK（京）2016-0011。飼養(yǎng)條件：溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度45%～55%，明暗循環(huán)時(shí)間比1∶1，按照國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例喂養(yǎng)。

1.1.2 藥品、主要試劑和儀器 ABPS（純度99.9%）由中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所提供，脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 購自美國(guó) Invitrogen 公司，編碼Notch1 胞內(nèi)域的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1（+）及空載質(zhì)粒由廣州銳博生物合成，MTT、阿爾新藍(lán)購自美國(guó)Sigma 公司，兔抗鼠Ⅱ型膠原（collagenⅡ）、聚集蛋白聚糖（aggrecan）、Notch1 抗體、Hes1、β-actin 抗體、山羊抗兔辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記二抗購自英國(guó)Abcam 公司，Hes1 抗體購自美國(guó)Santa Cruz 公司，酶標(biāo)儀購自美國(guó)BioTek 公司，熒光定量PCR 儀購自美國(guó)Bio Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs 的分離與培養(yǎng)[8]取 5 只 SD 大鼠，頸椎脫臼法處死，750 mL/L 乙醇中浸泡5 min，剝?nèi)〈笫箅p側(cè)后肢，750 mL/L 乙醇中浸泡2 min。無菌操作剔除大鼠后肢肌肉及骨膜，取出股骨和脛骨，無菌骨鉗剪開兩端骨骺使骨髓腔暴露。用不含血清的DMEM 沖洗骨髓數(shù)次至骨色發(fā)白，收集沖洗液至無菌離心管中，1 800 r/min（離心半徑10 cm）離心10 min，用含100 mL/L 胎牛血清的干細(xì)胞專用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL 接種至培養(yǎng)皿，恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中 37 ℃、50 mL/L CO2、95% 濕度條件下培養(yǎng)。24 h 后全量更換細(xì)胞培養(yǎng)液，之后每3 d換液1 次。貼壁細(xì)胞融合度達(dá)90%，按1∶3 傳代培養(yǎng)，反復(fù)貼壁純化。取生長(zhǎng)良好的干細(xì)胞，胰酶消化，1 000 r/min（離心半徑10 cm）4 ℃離心5 min，PBS洗滌3 次，不同流式管分別加入FITC 標(biāo)記的CD34、CD44、CD45 和CD90 抗體，同時(shí)設(shè)置同型陰性對(duì)照，冰上避光孵育 45 min，PBS 洗滌 3 次，500 μL PBS 重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果顯示細(xì)胞CD44、CD90 陽性表達(dá)率分別為99.27%、98.15%，CD34、CD45 陽性表達(dá)率分別為3.39%、2.52%，證實(shí)所分離細(xì)胞為BMSCs。

1.2.2 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取第3 代BMSCs，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL 接種至96 孔板，每孔180 μL，培 養(yǎng) 過 夜 ，加 20 μL 不 同 濃 度 ABPS 使 其終質(zhì)量濃度分別為 0、6.25、12.5、25、50、100、200、400 mg/L，每組設(shè)置 3 個(gè)復(fù)孔培養(yǎng) 48 h，不加 ABPS 作為空白組。每孔加20 μL MTT（5 mg/mL），培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄上清，每孔加150 μL DMSO，室溫避光孵育5 min。酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 波長(zhǎng)各孔吸光度A 值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）＝實(shí)驗(yàn)組A 值/空白組A 值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，選擇對(duì)BMSCs 生長(zhǎng)無毒性的ABPS最高濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)干預(yù)濃度。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 將BMSCs 使用胰酶消化，按1×106/mL 密度接種到6 孔板，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染：將50 nmol/L 編碼Notch1 胞內(nèi)域的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1（+）及空載質(zhì)粒用50 μL Opti-MEM 稀釋混勻，室溫孵育5 min，另外將 3 μL LipofectamineTM2000 使用 50 μL Opti-MEM 稀釋混勻，室溫孵育5 min；之后將兩種稀釋液混勻，室溫孵育20 min，加入6 孔板中，混勻后放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，根據(jù)轉(zhuǎn)染物質(zhì)不同，分別設(shè)為Notch1 組和Notch1 陰性對(duì)照組。另設(shè)對(duì)照組（常規(guī)培養(yǎng)）、ABPS 組（200 mg/L ABPS）、ABPS+Notch1組（轉(zhuǎn)染Notch1后加入200 mg/L ABPS）。培養(yǎng)48 h 后按照1.2.2 項(xiàng)方法用MTT 法檢測(cè)各組細(xì)胞A 值。

1.2.4 阿爾新藍(lán)法檢測(cè)培養(yǎng)基內(nèi)葡糖胺聚糖（glucosaminoglycan，GAG）含量 收集第1、4、7、10、14 天各組細(xì)胞培養(yǎng)基，阿爾新藍(lán)法檢測(cè)培養(yǎng)基內(nèi)GAG 含量。配制不同濃度硫酸軟骨素分別加50 μL/孔于96孔板中，設(shè)置 3 個(gè)復(fù)孔，再加 50 μL 阿爾新藍(lán)溶液，振蕩混勻，酶標(biāo)儀激發(fā)光波長(zhǎng)490 nm 檢測(cè)各孔吸光度（A）值，以硫酸軟骨素為橫坐標(biāo)，相對(duì)應(yīng)濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將不同時(shí)間點(diǎn)收集的培養(yǎng)基按照上述方法檢測(cè)培養(yǎng)基A 值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)基內(nèi)GAG 含量。

1.2.5 qPCR 檢測(cè) collagenⅡ、aggrecan 和 Notch1 通路相關(guān)基因mRNA 表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞，PBS清洗，Trizol 試劑提取RNA，超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 濃度和純度。反轉(zhuǎn)錄體系：4 μL 5×Mix，1 μg RNA，RNase-free ddH2O 補(bǔ) 齊 20 μL。 反 應(yīng) 程 序 ：25℃，10 min；42℃，30 min；85℃，5 min，產(chǎn)物稀釋至1 mL 作為模板。熒光定量 PCR 反應(yīng)體系：10 μL 2×SYBR Green Master Mix，1 μL 2.5 μmol/L 上、下游引物，2 μL 模板 cDNA，6 μL RNase-free ddH2O。反應(yīng) 程 序 ：95 ℃ 預(yù) 變 性 60 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，循環(huán) 40 次。Primer3.0 軟件設(shè)計(jì)目的基因qPCR 引物，序列見表 1。

表1 qPCR 引物序列Tab. 1 Primer sequences for qPCR

1.2.6 Western blotting 檢測(cè) collagenⅡ、aggrecan 和Notch1通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞，提取總蛋白，BCA 法檢測(cè)蛋白濃度，蛋白變性，100 mL/L SDS-PAGE 電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)至PVDF 膜，50 mL/L 脫脂牛奶室溫封閉 1 h，分別加 1∶1 000 稀釋的 collagen Ⅱ、aggrecan、Notch1、Hes 和 β-actin 抗體4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜 10 min×3 次，再加 1∶2 000稀釋的HRP 標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜10 min×3 次，加ECL 化學(xué)液，于暗室曝光顯影，Image 軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參β-actin 蛋白條帶灰度值的比值，作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量資料的比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析。P＜0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ABPS 對(duì) BMSCs 增 殖 的 影 響

MTT 結(jié) 果 顯 示 ，400 mg/L ABPS 作 用 BMSCs 48 h，與空白組比較細(xì)胞存活率降低（P＜0.05）。ABPS濃度≤200 mg/L 時(shí)，細(xì)胞存活率與空白組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。因此，選擇200 mg/L ABPS 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖1）。

圖1 ABPS 對(duì) BMSCs 增殖的影響Fig.1 Effect of ABPS on the proliferation of BMSCs

2.2 各組BMSCs 細(xì)胞增殖能力的比較

MTT 結(jié)果顯示，BMSCs 細(xì)胞 A 值組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與對(duì)照組比較，Notch1組細(xì)胞 A 值降低，ABPS 組細(xì)胞 A 值升高（P＜0.05）；ABPS+Notch1 組細(xì)胞 A 值高于 Notch1 組而低于ABPS 組（P＜0.05）；Notch1 組細(xì)胞 A 值較 Notch1 陰性對(duì)照組降低（P＜0.05，表2）。

表2 各組BMSCs 細(xì)胞A 值的比較Tab. 2 A value of BMSCs in various groups （）

表2 各組BMSCs 細(xì)胞A 值的比較Tab. 2 A value of BMSCs in various groups （）

與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與Notch1 陰性對(duì)照組比較，#P＜0.05；與Notch1 組比較，△P＜0.05；與 ABPS 組比較，▽P＜0.05。

A 值0.79±0.13 0.76±0.11 0.37±0.09*#0.96±0.18*0.51±0.13△▽16.05＜0.001組別對(duì)照組Notch1 陰性對(duì)照組Notch1 組ABPS 組ABPS+Notch1 組F P

2.3 各組BMSCs 培養(yǎng)基內(nèi)GAG 含量

隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，各組BMSCs 培養(yǎng)基內(nèi)GAG 含量增加。第 1、4 天各組 BMSCs 培養(yǎng)基內(nèi)GAG 含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），第7、10、14 天 BMSCs 培養(yǎng)基內(nèi) GAG 含量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，Notch1 組培養(yǎng)基內(nèi)GAG 含量減少，ABPS 組培養(yǎng)基內(nèi)GAG 含量增加（P＜0.05）；ABPS+Notch1 組培養(yǎng)基內(nèi) GAG含量較 Notch1 組增加，而較ABPS 組減少（P＜0.05）；Notch1 組培養(yǎng)基內(nèi)GAG 含量較Notch1 陰性對(duì)照組減少（P＜0.05，圖2）。

圖2 各組BMSCs 培養(yǎng)基內(nèi)GAG 含量的比較Fig.2 GAG content in the medium of BMSCs in various groups

2.4 各 組 BMSCs 中 collagen Ⅱ 、aggrecan、Notch1和Hes1 mRNA 表達(dá)水平

qPCR 結(jié) 果 顯 示 ，BMSCs 中 collagen Ⅱ 、aggrecan、Notch1 和 Hes1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，Notch1組collagen Ⅱ、aggrecan mRNA 相對(duì)表達(dá)量降低，Notch1 和 Hes1 mRNA 相 對(duì) 表 達(dá) 量 升 高 ，ABPS 組collagenⅡ、aggrecan mRNA 相對(duì)表達(dá)量升高，Notch1和 Hes1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05）；ABPS+Notch1 組 collagenⅡ、aggrecan mRNA 相對(duì)表達(dá)量高于 Notch1 組而低于 ABPS 組，Notch1 和 Hes1 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于Notch1組而高于ABPS 組（P＜0.05）；與 Notch1 陰性對(duì)照比較，Notch1 組 collagenⅡ、aggrecan mRNA 相對(duì)表達(dá)量降低，Notch1 和Hes1 mRNA相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05，圖3）。

圖3 各組 BMSCs 中 collagenⅡ、aggrecan、Notch1 和 Hes1 mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig. 3 Relative expressions of collagenⅡ,aggrecan,Notch1 and Hes1 mRNA in BMSCs of various groups

2.5 各 組 BMSCs 中 collagen Ⅱ 、aggrecan、Notch1和Hes1 蛋白表達(dá)水平

Western blotting結(jié)果顯示，BMSCs 中 collagenⅡ、aggrecan、Notch1 和 Hes1 蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，Notch1 組collagenⅡ、aggrecan 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，Notch1 和Hes1 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，ABPS 組collagen Ⅱ 、aggrecan 蛋 白 相 對(duì) 表 達(dá) 量 升 高 ，Notch1 和Hes1 蛋白 相 對(duì)表 達(dá) 量降 低（P＜0.05）；ABPS+Notch1 組collagenⅡ、aggrecan 蛋白相對(duì)表達(dá)量高于Notch1 組 而 低 于 ABPS 組，Notch1 和 Hes1 蛋 白 相對(duì)表達(dá)量低于 Notch1 組而高于 ABPS 組（P＜0.05）；與Notch1 陰性對(duì)照比較，Notch1 組 collagenⅡ、aggrecan蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，Notch1 和Hes1 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05，圖4）。

圖4 各組 BMSCs 中 collagenⅡ、aggrecan、Notch1 和 Hes1 蛋白表達(dá)Fig.4 Protein expressions of collagenⅡ, aggrecan, Notch1 and Hes1 in BMSCs of various groups

3 討 論

椎間盤（intervertebral disk，IVD）在生命早期即表現(xiàn)出退化、衰老的狀態(tài)，隨年齡增長(zhǎng)IDD 患病率增加[9]。IDD 發(fā)病機(jī)制主要包括髓核和纖維環(huán)含水量、膠原、蛋白多糖等減少，張力下降，彈性減小，韌性降低以及椎間隙變窄等[10]。隨著組織工程和再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，修復(fù)和再生IVD 組織成為可能[11]。其中，髓核細(xì)胞移植為IDD 治療提供了良好的前景[12]。髓核細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，體外培養(yǎng)難度較大。研究顯示，BMSCs 可在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)向髓核樣表型分化[13]，為臨床IDD 治療提供新的思路和方法。

牛膝是一種中草藥，常用于治療骨質(zhì)疏松癥和骨不連，其提取物經(jīng)研究證實(shí)可發(fā)揮抗炎、解熱、抗風(fēng)濕病、利尿和抗骨質(zhì)疏松癥等多種藥理作用[14]。MA等[15]研究表明，牛膝提取物可通過抑制糖酵解途徑和促分裂原活化的蛋白激酶/蛋白激酶B 信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡保護(hù)軟骨細(xì)胞功能。ABPS 是牛膝的主要有效成分之一，具有多種生物學(xué)活性且毒副作用小。XU 等[16]研究顯示，ABPS 可以誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞的分化和成熟。SONG 等[6]研究表明，ABPS 可以通過抑制核因子κB 受體激活蛋白配體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制破骨細(xì)胞的分化和骨吸收活性，從而預(yù)防骨質(zhì)流失。目前，ABPS 對(duì)BMSCs 向髓核樣細(xì)胞分化的影響及作用機(jī)制研究較少。本研究以BMSCs 為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，經(jīng)ABPS 誘導(dǎo)培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞增殖能力升高，培養(yǎng)基中 GAG 含量增加，collagenⅡ、aggrecan mRNA 和蛋白表達(dá)水平上調(diào)。collagenⅡ、aggrecan 是髓核樣細(xì)胞的特征性表面標(biāo)志，胞外基質(zhì)中GAG 含量可作為體外培養(yǎng)擴(kuò)增髓核樣細(xì)胞分泌基質(zhì)功能的判斷依據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，ABPS 可以誘導(dǎo)BMSCs 向髓核樣細(xì)胞分化。

BMSCs 向髓核樣細(xì)胞分化過程涉及多條通路。多 項(xiàng) 研 究 顯 示 ，NAMPT-Sirt1 通 路[17]、ERK1/2 通路[18]均與BMSCs 向髓核樣細(xì)胞分化有關(guān)。Notch 通路參與細(xì)胞增殖、遷移、分化等多種生物學(xué)行為，在細(xì)胞分化發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[19]。Notch 家族包含4 種受體（Notch1-4），Notch1 受體是一個(gè)跨膜蛋白，配體和受體結(jié)合后，Notch1 蛋白被γ-分泌酶切并釋放出胞內(nèi)活性片段，入核后與Rbp-jκ 結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，啟動(dòng)靶基因如Hes1 的轉(zhuǎn)錄，Hes1 作為信號(hào)通路下游基因的轉(zhuǎn)錄阻遏物發(fā)揮作用。Notch信號(hào)通路參與BMSCs 分化已被多次證實(shí)。GUO等[20]研究顯示，來那度胺可通過激活Notch 信號(hào)通路恢復(fù)多發(fā)性骨髓瘤患者BMSCs 的成骨分化。LONG等[21]研究表明，抑制Notch 信號(hào)通路可促進(jìn)BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。SEMENOVA 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，Notch 通路關(guān)鍵分子劑量依賴性促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)ABPS 處理后，BMSCs 中 Notch1、Hes1 mRNA 和 蛋白的表達(dá)水平降低，而過表達(dá)轉(zhuǎn)染Notch1 后則呈相反的作用效果，過表達(dá)Notch1 后再用ABPS 處理后，Notch1 對(duì)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用被逆轉(zhuǎn)，證實(shí)ABPS對(duì)Ntoch1 的調(diào)控作用，提示ABPS 可能通過抑制Notch 通路促進(jìn)BMSCs 向髓核樣細(xì)胞分化。

綜上所述，ABPS 可以促進(jìn)BMSCs 向髓核樣細(xì)胞分化，作用機(jī)制可能與調(diào)控Notch 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)，為ABPS 相關(guān)藥物的研發(fā)及應(yīng)用于IDD 治療提供理論支持。