Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化厚樸溫中湯提取工藝△

申若男，羅菊元，張晴，劉雪純，胡文均，張澤康，王昌海，陸洋，2*，白潔*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488；2.深圳北京中醫(yī)藥大學(xué)研究院，廣東 深圳 518000

《內(nèi)外傷辨惑論》中記載，厚樸溫中湯是由姜厚樸、橘紅、炙甘草、草豆蔻、木香、茯苓、干姜、生姜8 味中藥組成[1]，功效主要為溫中行氣、燥濕除螨，現(xiàn)代臨床上常用于治療脾胃虛寒型胃痛等[2-3]。將經(jīng)典名方開(kāi)發(fā)為顆粒劑等現(xiàn)代制劑，不僅能推動(dòng)經(jīng)典名方的傳承與發(fā)展，也能方便臨床用藥。

與傳統(tǒng)中藥新藥研究以指標(biāo)性成分最優(yōu)為目的的工藝不同，在經(jīng)典名方顆粒劑的制備工藝中，不是以參數(shù)值最大為目標(biāo)，而是要保證關(guān)鍵質(zhì)量屬性符合基準(zhǔn)樣品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的范圍[4]。而指紋圖譜、指標(biāo)性成分、出膏率作為關(guān)鍵質(zhì)量屬性，需同時(shí)滿(mǎn)足基準(zhǔn)樣品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)范圍。

本研究制備了15 批厚樸溫中湯基準(zhǔn)樣品對(duì)應(yīng)實(shí)物，并確定了關(guān)鍵質(zhì)量屬性的范圍。響應(yīng)面法可以確定因素水平在其相應(yīng)的范圍之內(nèi)[5]，使其最終得到的工藝參數(shù)符合基準(zhǔn)樣品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)范圍。因此，本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，為后續(xù)現(xiàn)代制劑的開(kāi)發(fā)研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

BSA 224S 型萬(wàn)分之一電子分析天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；JM-B100002 型十萬(wàn)分之一電子天平（余姚市紀(jì)銘稱(chēng)重校驗(yàn)設(shè)備有限公司）；KQ5200DA型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FD-2A 型真空冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；SHB-Ⅲ型循環(huán)真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；HH-6型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；UltiMate U3000型高效液相色譜儀［賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司］；DZF-6051 型真空干燥器（北京利康達(dá)圣科技有限公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品厚樸酚（批號(hào)：110729-201714，純度：100.0%）、橙皮苷（批號(hào)：110721-201818，純度：96.2%）、甘草酸銨（批號(hào)：110731-201720，純度：97.7%）、喬松素（批號(hào)：111829-201703，純度：99.5%）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇、磷酸（Fisher 公司，色譜純）；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

姜厚樸飲片（批號(hào)：YP-HP-201801-2，產(chǎn)地：四川綿陽(yáng)）；橘紅飲片（批號(hào)：201920-4，產(chǎn)地：福建龍巖）；炙甘草飲片（批號(hào)：YP-GC-201804-1，產(chǎn)地：甘肅武威）；木香飲片（批號(hào)：YP-MX-DL-5，產(chǎn)地：云南大理）；草豆蔻飲片（批號(hào)：CDK-201804-5，產(chǎn)地：海南萬(wàn)寧）；茯苓飲片（批號(hào)：FL-201802-1，產(chǎn)地：安徽六安）；干姜飲片（批號(hào)：201802-1，產(chǎn)地：山東臨沂）；生姜（批號(hào)：SJ-202009-5，產(chǎn)地：山東煙臺(tái)），以上飲片均由億帆醫(yī)藥股份有限公司提供，均經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 厚樸溫中湯基準(zhǔn)樣品對(duì)應(yīng)實(shí)物的制備

按厚樸溫中湯處方量分別稱(chēng)取7味飲片最粗粉及生姜3片（總質(zhì)量4～5 g）于陶瓷鍋中，加入水300 mL，武火加熱至沸騰后轉(zhuǎn)文火煎煮30 min，以4層脫脂紗布作為濾材進(jìn)行濾過(guò)，濾液放涼后調(diào)整至250 mL。精密移取水煎液5 mL 至西林瓶中，-20 ℃預(yù)冷凍24 h后轉(zhuǎn)移至真空冷凍干燥機(jī)（-80 ℃，10 Pa），冷凍2 d，即得厚樸溫中湯基準(zhǔn)樣品對(duì)應(yīng)實(shí)物[6]。

2.2 橙皮苷、甘草酸、喬松素及厚樸酚含量測(cè)定方法的建立

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取適量的橙皮苷、甘草酸、喬松素、厚樸酚對(duì)照品，分別加甲醇定容至質(zhì)量濃度分別為1040、1346、133、1070 μg·mL-1的對(duì)照品母液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取1 份凍干粉樣品，加70%甲醇5 mL，超聲15 min（200 W，40 kHz），搖勻后取樣，用于測(cè)定橙皮苷、甘草酸、喬松素、厚樸酚含量。

按照處方量稱(chēng)取飲片，同法分別制備姜厚樸、草豆蔻、橘紅、炙甘草陰性樣品溶液。

2.2.3 色譜條件 Thermo Acclaim?120-C18120 ?（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～6 min，2%～7%A；6～10 min，7%～9%A；10～15 min，9%A；15～35 min，9%～13%A；35～40 min，13%A；40～54 min，13%～19%A；54～66 min，19%～29%A；66～103 min，29%～80%A；103～108min，80%A）；流速：1mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.4 指標(biāo)性成分含量測(cè)定方法學(xué)考察 根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版[7]，按照2.2.3項(xiàng)下色譜條件對(duì)橙皮苷、甘草酸、喬松素、厚樸酚進(jìn)行含量測(cè)定方法學(xué)考察，結(jié)果見(jiàn)表1、圖1～4。結(jié)果可以得出各考察指標(biāo)均符合實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 厚樸溫中湯中橘紅飲片特征峰

表1 厚樸溫中湯指標(biāo)性成分含量測(cè)定方法學(xué)考察

2.3 基準(zhǔn)樣品出膏率的測(cè)定

按2.1項(xiàng)下方法制備基準(zhǔn)樣品后，取剩余水煎液樣品245 mL 移入蒸發(fā)皿中，常壓恒溫水浴100 ℃濃縮至近干后，置減壓真空干燥箱中60 ℃干燥24 h，得藥材干膏，按公式（1）計(jì)算得出膏率。

圖2 厚樸溫中湯中炙甘草飲片特征峰

圖3 厚樸溫中湯中草豆蔻飲片特征峰

圖4 厚樸溫中湯中姜厚樸飲片特征峰

2.4 單因素試驗(yàn)初步篩選提取工藝

為客觀反映各個(gè)因素對(duì)提取工藝的影響，以橙皮苷、甘草酸、喬松素、厚樸酚含量及出膏率為指標(biāo)，并設(shè)立綜合評(píng)分進(jìn)行考察。按公式（2）計(jì)算綜合評(píng)分。

固定提取時(shí)間為30 min，考察不同的加水量（300、600、900、1200 mL）及固定加水量600 mL，考察不同的提取時(shí)間（15、30、60、90 min）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2～3。由表2可知，隨著加水量的增加，指標(biāo)性成分的含量、出膏率及綜合評(píng)分增加漸緩，所以將響應(yīng)面加水量高水平定為1200 mL；由表3 可知，隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)，橙皮苷、甘草酸、喬松素及厚樸酚的含量增加漸緩，所以將提取時(shí)間高水平定為90 min。

表2 不同加水量對(duì)指標(biāo)性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、出膏率及綜合評(píng)分的影響

表3 不同提取時(shí)間對(duì)指標(biāo)性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、出膏率及綜合評(píng)分的影響

2.5 Box-Behnken法優(yōu)化厚樸溫中湯提取工藝

因厚樸溫中湯處方中除炙甘草和茯苓外，其余藥味均為芳香類(lèi)中藥，含小極性成分較多，其在水中溶解度較低，若直接測(cè)定厚樸溫中湯水煎液，則樣品中多個(gè)藥味的特征峰無(wú)法得到體現(xiàn)。為了盡可能全面地反映厚樸溫中湯樣品的質(zhì)量信息，參照基準(zhǔn)樣品水煎液測(cè)定前處理方法，采用凍干粉復(fù)溶后進(jìn)樣。

利用Design Expert 10 軟件進(jìn)行四因素三水平的27 次試驗(yàn)（中心點(diǎn)選擇重復(fù)3 次），因素水平見(jiàn)表4。

表4 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化厚樸溫中湯提取工藝的四因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.5.1 試驗(yàn)結(jié)果 27 組試驗(yàn)提取液凍干粉中的指標(biāo)性成分含量和出膏率見(jiàn)表5。

表5 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化厚樸溫中湯提取工藝的試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.5.2 模型的建立與評(píng)價(jià) 根據(jù)上述27 組的試驗(yàn)結(jié)果，采用二階多項(xiàng)式模型進(jìn)行方程擬合，回歸方程：綜合評(píng)分=0.77+0.067A -0.053B+0.14C+0.32D -0.062AB -0.043AC+0.20AD+0.057BC+0.073BD+0.37CD。對(duì)擬合模型進(jìn)行ANOVA方差分析，由表6 可知，模型方差差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。失擬項(xiàng)是用來(lái)評(píng)估模型是否可靠的重要數(shù)據(jù)，本次模型的失擬項(xiàng)P值為0.383 6＞0.05，失擬值不顯著，表明所建模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以較好地將模型與實(shí)際值擬合在一起[8]。模型相關(guān)系數(shù)為0.750 5，說(shuō)明絕大部分響應(yīng)值的變化均可由該模型來(lái)進(jìn)行解釋?zhuān)梢赃\(yùn)用該模型進(jìn)行分析。

由表6 可知，因素C 的P＜0.05，說(shuō)明提取時(shí)間對(duì)綜合評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且各影響因素之間還存在交互作用，不同交互因素與綜合評(píng)分的響應(yīng)面分析見(jiàn)圖5～10。而因素D、CD 的P＜0.001，且圖10 中響應(yīng)面圖坡度較陡，更加表明了提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)綜合評(píng)分有非常顯著的影響。

圖5 加水量和浸泡時(shí)間對(duì)厚樸溫中湯最優(yōu)提取工藝綜合評(píng)分影響的響應(yīng)面圖及等高線(xiàn)圖

表6 Box-Behnken響應(yīng)面法預(yù)測(cè)厚樸溫中湯最優(yōu)提取工藝回歸模型方差分析結(jié)果

2.5.3 預(yù)測(cè)最優(yōu)工藝 經(jīng)過(guò)預(yù)測(cè)得到的厚樸溫中湯最優(yōu)提取工藝為加水13.155 倍，浸泡32.486 min，提取30 min，提取3 次。此條件下的綜合評(píng)分為0.486。根據(jù)實(shí)際情況為了方便后續(xù)實(shí)驗(yàn)，將工藝調(diào)整為加水13 倍（780 mL），浸泡30 min，提取30 min，提取3 次，驗(yàn)證優(yōu)選工藝的可行性。

2.5.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按照預(yù)測(cè)的工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)分，結(jié)果見(jiàn)表7。由表7 可知，按照預(yù)測(cè)工藝提取后，其結(jié)果均能接近預(yù)測(cè)值，甚至較響應(yīng)面法預(yù)測(cè)值更低，同時(shí)可保證指標(biāo)性成分橙皮苷、甘草酸、喬松素和厚樸酚的含量在基準(zhǔn)樣品值的70%～130%，更好地確保了制劑與基準(zhǔn)樣品質(zhì)量的一致性。且驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)與基準(zhǔn)樣品對(duì)應(yīng)實(shí)物的對(duì)照?qǐng)D譜的相似度為0.999（圖11），相似度良好。

圖11 厚樸溫中湯基準(zhǔn)樣品與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)圖譜

表7 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化預(yù)測(cè)厚樸溫中湯最優(yōu)提取工藝的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

《古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑及其物質(zhì)基準(zhǔn)的申報(bào)資料要求（征求意見(jiàn)稿）》指出，研究飲片到基準(zhǔn)樣品的量值傳遞關(guān)系應(yīng)從指紋圖譜、浸出物或特征圖譜、含量測(cè)定等方面切入[9]。同樣，在將經(jīng)典名方制備為顆粒劑的過(guò)程中，也應(yīng)比較研究基準(zhǔn)樣品與顆粒劑之間的量值傳遞關(guān)系，主要對(duì)基準(zhǔn)樣品指標(biāo)性成分含量、特征圖譜相似度及出膏率這3 個(gè)指標(biāo)進(jìn)行質(zhì)量控制。

圖6 加水量和提取時(shí)間對(duì)厚樸溫中湯最優(yōu)提取工藝綜合評(píng)分影響的響應(yīng)面圖及等高線(xiàn)圖

圖7 加水量和提取次數(shù)對(duì)厚樸溫中湯最優(yōu)提取工藝綜合評(píng)分影響的響應(yīng)面圖及等高線(xiàn)圖

采用了層次分析法（AHP）確定綜合評(píng)分時(shí)各個(gè)指標(biāo)分配的比例，AHP 是一種非常方便、靈活的數(shù)學(xué)決策方法，具有多維準(zhǔn)則。其充分利用了人類(lèi)的經(jīng)驗(yàn)和判斷能力，將復(fù)雜的問(wèn)題系統(tǒng)化、量化，從而對(duì)決策方案進(jìn)行排序。AHP 主要將多個(gè)因素作為研究對(duì)象，每個(gè)因素又屬于不同層次，具有遞階性[10]。厚樸溫中湯主要有2 個(gè)層次：指標(biāo)性成分和出膏率。姜厚樸為處方主藥，厚樸酚作為姜厚樸中的主要藥效成分且含量最高；喬松素是方中臣藥草豆蔻的主要藥效成分；橙皮苷是方中佐藥橘紅的主要藥效成分；甘草酸是方中佐使藥炙甘草的主要藥效成分。在綜合評(píng)分的比例分配上，由于各指標(biāo)性成分在方中均起著重要作用，且出膏率也是作為衡量制劑質(zhì)量的重要指標(biāo)，所以對(duì)綜合評(píng)分的評(píng)價(jià)設(shè)立了5 個(gè)占比相同的指標(biāo)。

圖8 浸泡時(shí)間和提取時(shí)間對(duì)厚樸溫中湯最優(yōu)提取工藝綜合評(píng)分影響的響應(yīng)面圖及等高線(xiàn)圖

圖9 浸泡時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)厚樸溫中湯最優(yōu)提取工藝綜合評(píng)分影響的響應(yīng)面圖及等高線(xiàn)圖

圖10 提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)厚樸溫中湯最優(yōu)提取工藝綜合評(píng)分影響的響應(yīng)面圖及等高線(xiàn)圖

以提取時(shí)間、浸泡時(shí)間、提取次數(shù)、加水量4 個(gè)因素作為響應(yīng)面法中單因素試驗(yàn)的設(shè)計(jì)因素。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，有效成分也會(huì)逐漸被提取，再增加提取次數(shù)也難以較大地改變成分的含量[11]，所以直接將提取次數(shù)的3 個(gè)水平設(shè)定為1、2、3次。響應(yīng)面法可以快速、有效地減少試驗(yàn)次數(shù)，規(guī)定各個(gè)指標(biāo)均在其相應(yīng)范圍內(nèi)并且可以更加直觀地體現(xiàn)出各個(gè)因素之間的交互作用[12]。采用響應(yīng)面法來(lái)優(yōu)選提取工藝時(shí)，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均能達(dá)到預(yù)測(cè)值，表明該預(yù)測(cè)工藝能達(dá)到提取工藝的預(yù)期目標(biāo)。最終確定的厚樸溫中湯提取工藝：提取30 min，浸泡30 min，提取3 次，加水量780 mL。在此工藝條件下得到的厚樸溫中湯制劑中指標(biāo)性成分含量與基準(zhǔn)樣品對(duì)應(yīng)實(shí)物含量相接近，且在70%～130%離散范圍內(nèi)，說(shuō)明該工藝可行，可以作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中制劑的提取方法。