液相色譜-質(zhì)譜法分析磷酸蘆可替尼中強制降解后的產(chǎn)物

劉發(fā)貴，孫麗霞，李敏，劉思光，李鐵健，張貴民（.山東新時代藥業(yè)有限公司，山東 臨沂 273400；2.魯南制藥集團股份有限公司，山東 臨沂 276002）

骨髓纖維化實質(zhì)上是一種骨髓增殖性腫瘤[1]。磷酸蘆可替尼作為一種 JAK抑制劑[2-3]，具有潛在的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性，用于治療中間或高危骨髓纖維化，包括原發(fā)性骨髓纖維化，真性紅細胞增多癥后骨髓纖維化和原發(fā)性血小板增多癥后骨髓纖維化的治療[4-5]。磷酸蘆可替尼作為首個骨髓纖維化治療藥物（結構見圖1），也是目前唯一批準針對其發(fā)病機制的靶向藥物[6-7]。

圖1 磷酸蘆可替尼化學結構圖Fig 1 Chemical structure of ruxolitinib phosphate

本文主要采用高效液相色譜法（HPLC）和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術（LC-MS）研究磷酸蘆可替尼的強制降解產(chǎn)物，了解其穩(wěn)定性及降解途徑[8-10]，為藥品的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

安捷倫UPLC串聯(lián)6540B Q-TOF色譜-液質(zhì)聯(lián)用儀（安捷倫）；高效液相色譜儀Thermo Ultimate 3000，配DAD檢測器（Thermo）；高效液相色譜儀Waters ALLIANCE e2695，配PDA檢測器（Waters）；電子分析天平（XSR105U/A、XPR10）、pH計（S210）（Mettler Toledo）。

1.2 試藥

乙酸銨（Merck，LC-MS專用，50 g，批號：A1468804117）；氫氧化鈉（批號：2009172）、鹽酸（批號：2103151）、30%過氧化氫（批號：190826）（西隴科學，分析級）；乙腈（Merck，色譜級，批號：I1102930036）；磷酸蘆可替尼（佰麥生物，純度：99.9%，批號：BM20210111）。

2 方法

2.1 液相色譜條件

色譜柱：YMC Triart C18（4.6 mm×150 mm，3 μm）；以水為流動相A，甲醇為流動相B；梯度洗脫（0～5 min，45%B；5～20 min，45%～70%B；20～25 min，70%～75%B；25～26 min，75%～45%B；26～35 min，45%B）；柱溫40℃；流速1.0 mL·min-1；檢測波長230 nm，同時開啟3D數(shù)據(jù)采集（190～400 nm）；進樣量20 μL。

2.2 色譜-質(zhì)譜條件[11]

色譜柱：YMC Triart C18（2.1 mm×150 mm，1.9 μm）；以10 mmol·L-1乙酸銨水溶液為流動相A，乙腈為流動相B；梯度洗脫（0～2 min，20%B；2～14.5 min，20%～60%B；14.5～14.6 min，60%～20%B；14.6～20 min，20%B）；柱溫40℃；流速0.3 mL·min-1；檢測波長230 nm；進樣量10 μL。

電噴霧解吸電離源DESI，正離子檢測模式；離子源霧化溫度300℃；毛細管電壓400 V；錐孔電壓45 V；裂解電壓60 V（Fragmentor）；干燥氣流量8 L·min-1；MS掃描范圍50～1600m/z。

2.3 溶液配制

2.3.1 供試品溶液（未破壞溶液） 取本品約2 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加乙腈-水（20∶80）（以下簡稱溶劑）溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液（質(zhì)量濃度為 0.2 mg·mL-1）。

2.3.2 強制降解試驗 取本品約2 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，高溫破壞24 h（105℃條件下固體直接暴露）；取供試品溶液直接暴露于4500 lx強度光照10 d；氧化破壞（1 mL溶劑溶解后，加10%雙氧水1 mL，80℃水?。? h；酸破壞（1 mL溶劑溶解后，加2 mol·L-1鹽酸溶液1 mL，80℃水浴）2 h；堿破壞（1 mL溶劑溶解后，加1 mol·L-1氫氧化鈉溶液1 mL，80℃水?。? min。取上述各破壞樣品，加溶劑稀釋至刻度（酸堿破壞需中和至中性），搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為各條件下的強制降解溶液。同時做各條件下的空白試驗。

3 結果

3.1 強制降解結果

經(jīng)過液質(zhì)聯(lián)用的分析，初步鑒定出11個降解雜質(zhì)，分別命名為雜質(zhì)A～K，各破壞條件下降解雜質(zhì)及磷酸蘆可替尼含量見表1及圖2。

圖2 強制降解性試驗HPLC色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of the forced degradation

表1 磷酸蘆可替尼強制降解試驗結果 (%) Tab 1 Ruxolitinib phosphate forced degradation test (%)

3.2 磷酸蘆可替尼及降解產(chǎn)物母離子與特征離子

通過ESI＋-MS對上述破壞溶液進行測定，得到磷酸蘆可替尼降解雜質(zhì)一級質(zhì)譜圖的[M＋H]＋及主要特征離子，各降解雜質(zhì)可能的降解途徑及結構推理簡要如下。

3.2.1 雜質(zhì)A、雜質(zhì)B和雜質(zhì)C

① 對于雜質(zhì)A、雜質(zhì)B：ESI＋-MS測得的雜質(zhì)A的一級質(zhì)譜圖中m/z325為[M＋H]＋峰，相對分子質(zhì)量為324，比蘆可替尼多一個水分子。最有可能是-CN官能團被氧化，成為酰胺鍵。ESI＋-MS測得的雜質(zhì)B的一級質(zhì)譜圖中m/z326為[M＋H]＋峰，表明其相對分子質(zhì)量為325，比蘆可替尼多19，即-CN被氧化成-COOH。最有可能是在雜質(zhì)A的基礎上，-NH2被-OH取代（見圖3）。

② 對于雜質(zhì)C：ESI＋-MS測得的雜質(zhì)A的一級質(zhì)譜圖中m/z186為[M＋H]＋峰，相對分子質(zhì)量為185，正好是雜質(zhì)C的一個單元。從蘆可替尼中掉下的另一個五元環(huán)單位，紫外響應弱，本法無法有效檢出（見圖3）。

圖3 磷酸蘆可替尼降解產(chǎn)生雜質(zhì)A、B和C的可能途徑Fig 3 Possible degradation pathways for impurity A， B and C from ruxolitinib phosphate degradation

3.2.2 雜質(zhì)D、雜質(zhì)E和雜質(zhì)F

① 對于雜質(zhì)D：ESI＋-MS測得的雜質(zhì)D的一級質(zhì)譜圖中m/z311為[M＋H]＋峰，相對分子質(zhì)量為310，比蘆可替尼多4。最有可能是結構中含1個氮的五元環(huán)發(fā)生光自由基反應，從而開環(huán)，分別生成-NH2和-CHO，推測出雜質(zhì)D的結構（見圖4）。

② 對于雜質(zhì)E和雜質(zhì)F：ESI＋-MS測得的雜質(zhì)E的一級質(zhì)譜圖中m/z323為[M＋H]＋峰，相對分子質(zhì)量為322，比蘆可替尼多16?？赡苁翘J可替尼C14位和C15位形成環(huán)氧環(huán)，推測出雜質(zhì)E。ESI＋-MS測得的雜質(zhì)F的一級質(zhì)譜圖中m/z341為[M＋H]＋峰，相對分子質(zhì)量為340，比雜質(zhì)E多18。即比雜質(zhì)E的環(huán)氧環(huán)發(fā)生了開環(huán)，生成2個-OH，推測出雜質(zhì)F的結構（見圖4）。

圖4 磷酸蘆可替尼降解產(chǎn)生雜質(zhì)D、E和F的可能途徑Fig 4 Possible degradation pathway for impurity D，E and F from ruxolitinib phosphate

3.2.3 雜質(zhì)G、雜質(zhì)H和雜質(zhì)I

① 對于雜質(zhì)G：ESI＋-MS測得的雜質(zhì)G的一級質(zhì)譜圖中m/z305為[M＋H]＋峰，表明其相對分子質(zhì)量為304，比蘆可替尼少2。即最有可能是手性碳原子上形成雙鍵，即6號位和3號位形成雙鍵。推測出雜質(zhì)G的結構（見圖5）。

圖5 磷酸蘆可替尼降解產(chǎn)生雜質(zhì)G、H和I的可能途徑Fig 5 Possible degradation pathways for impurity G，H and I from ruxolitinib phosphate

② 對于雜質(zhì)H和雜質(zhì)I：ESI＋-MS測得雜質(zhì)H的一級質(zhì)譜圖中m/z373為[M＋H]＋峰，相對分子質(zhì)量為372，比雜質(zhì)A多48，可能是7、9、17號位等3個位置的氮形成了氮氧鍵，推測出雜質(zhì)H的結構。同理分析，ESI＋-MS測得雜質(zhì)I的一級質(zhì)譜圖中m/z357為[M＋H]＋峰，相對分子質(zhì)量為356，比雜質(zhì)A多32?？赡?號和17號位置氮形成氮氧鍵，但具體位置，目前的研究無法準確判定，需要進一步試驗進行確認。

3.2.4 雜質(zhì)J和雜質(zhì)K ESI＋-MS測得的一級質(zhì)譜圖中m/z323均為[M＋H]＋峰，相對分子質(zhì)量均為322，比雜質(zhì)A少2，可能是手性碳原子位置脫去2個氫形成雙鍵，即3號和6號位置間，6號和16號位置間，具體兩者如何區(qū)分，目前研究無法確認，有待進一步試驗確認，本文將3號和6號位置間形成雙鍵的化合物命名為雜質(zhì)K，另一結構命名為雜質(zhì)J（見圖6）。

圖6 磷酸蘆可替尼降解產(chǎn)生雜質(zhì)J和K的可能途徑Fig 6 Possible degradation pathways for impurity J and K from ruxolitinib phosphate

綜上將磷酸蘆可替尼可能的降解途徑歸納見圖7。

圖7 磷酸蘆可替尼可能的降解途徑Fig 7 Possible degradation pathways of ruxolitinib phosphate

4 結論

磷酸蘆可替尼在高溫和光照條件下，較為穩(wěn)定，但是在酸和堿條件下易降解，氧化條件下極易降解。經(jīng)過初步鑒定共得到11個降解雜質(zhì)（見表2及圖8），其結構還存在不確定性，本文提到的結構僅供參考[12-13]。雜質(zhì)H和雜質(zhì)I均為氮氧化合物，由于結構中存在較多氮原子，在無對照品的基礎上，很難確定其準確的氮氧鍵的位置，本文列出的結構為理論上最大可能性的結構。同時雜質(zhì)J和雜質(zhì)K為同分異構體結構，性質(zhì)類似，目前的研究無法判定其在本法中的出峰順序，有待進一步試驗證明。

圖8 磷酸蘆可替尼及其主要降解產(chǎn)物的推測結構Fig 8 Proposed chemical structures of ruxolitinib phosphate and its major degradation compounds

表2 磷酸蘆可替尼及其主要降解產(chǎn)物的質(zhì)譜特征 Tab 2 Mass spectrometry characteristics of ruxolitinib phosphate and its major degradation compounds

綜上所述，本文檢測方法簡便，能夠有效分離各降解雜質(zhì)，為磷酸蘆可替尼的質(zhì)量控制提供參考，同時對其降解雜質(zhì)的研究，也可為其存儲及質(zhì)量研究提供參考依據(jù)。