CLDN9與TYK2在無功能性垂體腺瘤的表達及與侵襲性的相關性

阿卜杜喀迪爾·牙森 巴 圖 張 誠 麥麥提依明·托合提 吳永剛

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院，新疆烏魯木齊 830001

無功能性垂體腺瘤（non-functioning pituitary adenoma，NFPA）是垂體腺瘤的常見類型，約占30%［1］。因其常侵襲至海綿竇、視神經等重要鄰近組織，手術難以全切，導致術后復發(fā)率高達58%［2］。由于NFPA侵襲性相關的病理機制尚未明確，缺乏有效的藥物或其他治療方法。放射治療的有效性和安全性也不容樂觀［3］。因此，深入研究NFPA侵襲性相關的病理分子機制和相關基因，對尋找更理想的治療方法意義深遠。

Claudins（CLDNs）包括27個家族成員，是作為細胞緊密連接（tight junction，TJ）的重要構成部分，對維持細胞穩(wěn)定性和極性至關重要［4］，其異常表達（下調或上調）可促進或抑制多種腫瘤的惡性進展［5-6］，如CLDN1、CLDN7、CLDN3、CLDN6 等在乳腺癌、食管癌、前列腺癌、肺癌等腫瘤組織中表達下調，而CLDN3、CLDN4、CLDN9、CLDN17 等在卵巢癌、子宮癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、肝癌等腫瘤組織中表達上調并促進其侵襲性，與不良預后有關［5-6］。因此，CLDNs 的異常表達被認為腫瘤惡性進展的重要機制之一［7］。此外，Janus 激酶（the Janus kinase，JAK）蛋白（包括JAK1/JAK2/JAK3 及TYK2 等4 個成員）在細胞信號轉導通路中起到“橋梁”作用，在相應細胞因子及受體的作用下將細胞外的信號傳遞到細胞內［8］。酪氨酸激酶2（tyrosine kinase 2，Tyk2）作為JAK蛋白的重要成員，在多種腫瘤發(fā)生、進展中可見其異常表達或激活，因此TYK2被認為與腫瘤進展有關的致癌基因［9-10］，如TYK2 在卵巢癌、前列腺癌、宮頸癌、肝癌等多種腫瘤中的表達增高與這些腫瘤惡性進展有關［9-10］。

相關研究表明，TYK2 的異常表達或激活與CLDNs 促進腫瘤侵襲性作用有關，如高表達的CLDN9/CLDN17/CLDN12促進肝癌、肺癌等腫瘤的浸潤性生長作用與高表達的TYK2有關［11-13］?？梢姡源私嵌葹榍腥朦c的研究可能為NFPA 侵襲性相關的病理機制及治療方向能夠提供有價值的研究基礎，但此方面的研究鮮見報道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)CLDN9 在垂體腺瘤中高表達［14］。本研究分析CLDN9、TYK2 在NFPA 組織中的表達量與侵襲性的相關性，初步探討CLDN9 在NFPA 中的過表達與TYK2的相關性。

1 材料與方法

1.1 NFPA組織標本及儲存垂體腺瘤組織標本來自2020-06—2021-05 在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院神經外科住院接受經鼻蝶垂體瘤切除術的24 例NFPA 患者，其中男14 例，女10 例，年齡27～82（49.3±16.7）歲。收集其基本信息、術前激素水平、術前垂體磁共振檢查、術中所見信息、術后病檢結果等。根據術前影像檢查及術中所見信息分為侵襲性NFPA 組和非侵襲性NFPA 組各12 例。納入標準：（1）術前未接受任何治療；（2）無內分泌疾病或長期激素服用史；（3）臨床表現(xiàn)、術前內分泌激素及術后病理免疫組化結果均支持NFPA 診斷標準；（4）由同一術者以同樣的方式獲取腫瘤組織。排除標準：（1）復發(fā)性PA 患者；（2）資料不全患者；（3）有其他腫瘤病史的患者。符合以下標準的任何一條可診斷為侵襲性PA：（1）術前MRI 檢查符合Knosp 分類Ⅳ級［15］；（2）術前MRI檢查符合Knosp分類Ⅲ級［15］和術中可見向鞍旁海綿竇或鞍底骨質或向鞍上的侵襲性生長情況。用于實時定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）和蛋白質印跡（Western blot，WB）的標本在—80 ℃冷凍后儲存于液氮中；用于免疫組化（immunohistochemistry，IHC）的標本以4%甲醛固定石蠟包埋后儲存于本院病理科。本研究符合《赫爾辛基宣言》原則（www.wma.net/en/30publications/10policies/b3/index.html）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及質粒轉染：大鼠垂體瘤GT1-1細胞株（Procell 中國武漢生命科技有限公司）培養(yǎng)于含10%胎牛血清（Gibco上海素爾生物科技有限公司）+1%的100 U/mL 青霉素和鏈霉素的基礎培養(yǎng)基（Procell 中國武漢生命科技有限公司）中，培養(yǎng)于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中。取15 μL 處于對數(shù)生長期的GT1-1 細胞懸液進行計數(shù)，分別以1.5×105個細胞/24 孔板的孔進行鋪板，鋪板過夜培養(yǎng)后，進行質粒轉染。按lipofectamine 3000 轉染試劑盒（美國Invitrogen 公司）將空載質粒（NC 組）和CLDN9 質粒（OE-CLDN9 組）（中國優(yōu)寶生物公司）分別轉染至GT1-1細胞，再培養(yǎng)48 h后備用。

1.2.2 qRT-PCR：使用Trizol 試劑盒（美國Invitrogen公司）提取各組組織和細胞的總RNA，按照逆轉錄試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）說明書將其逆轉錄為cDNA，按照SYBRGreen PCR 試劑盒（中國北京全式金生物技術有限公司）說明書對各基因進行擴增。反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，共循環(huán)40次。以β-action作為內參照。引物序列：CLDN9：正向5′-CCTTTCGACCTT GGCCTGAT-3′ ，反向5′-GGGGGAGAACATCAAAGG GG-3′ ；TYK2：正向5′-CAGCCCCGTGTTCTGGTAT G-3′ ，反向5′-GAAAGGACGCCTCTGTCTCC-3′ ；βactin：正向5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，反向5′-TTTAATGTCACGCACGA TTTC-3′。用2-△△CT法計算各組目的基因的mRNA表達量。

1.2.3 IHC：將厚度5 μm的石蠟切片放入68 ℃培養(yǎng)箱（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）30 min進行烤片，用二甲苯和乙醇進行脫蠟。在組織上滴加3%過氧化氫，室溫下孵育10 min。將切片加熱，冷卻后用蒸餾水沖洗2 次，用PBS 緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）洗3 次。將用5%胎牛血清（Gibco 上海素爾生物科技有限公司）和PBS 緩沖液配好的封閉液滴加到組織上，放入37 ℃培養(yǎng)箱封閉30 min。用封閉液稀釋的一抗（兔抗多克隆CLDN9 抗體，1 ∶200，美國NOVUSBIO 公司；兔抗多克隆TYK2 抗體，1∶200，武漢愛博泰克生物科技有限公司）加到組織切片上，4 ℃過夜孵育，用PBS 洗3 次。滴加用HRP 標記的二抗，37 ℃孵育30 min，用PBS 洗3 次。將配好的DAB顯色劑（上海Beyotime公司）滴加在組織切片上。將組織切片放入蘇木素（北京索萊寶科技有限公司）中染1～2 min，用自來水沖洗。梯度乙醇（北京索萊寶科技有限公司）脫水，用中性樹膠（北京索萊寶科技有限公司）封片，固化后拍片。采用Image Pro Plus6.0（Media Cybernetics）軟件，計算各組切片平均光密度值（AOD），進行定量分析。

1.2.4 WB：將在液氮下研磨后的各組腫瘤組織和轉染48 h 后的各組細胞加入到RIPA 高效組織/細胞裂解液（北京索萊寶科技有限公司）進行裂解，在4 ℃下以12 000 r/min 離心15 min，離心完成后取上清，用BCA 蛋白濃度測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）進行蛋白定量。取適量上樣量，進行PVDF（Millipore 上海玉博生物科技有限公司）轉模，用5%脫脂牛奶進行封閉，室溫下孵育1 h。加入到一抗（兔抗多克隆CLDN9 抗體，1 ∶10 000，美國NOVUSBIO 公司；兔抗多克隆TYK2 抗體，1∶10 000，武漢愛博泰克生物科技有限公司）孵育10 min，4 ℃過夜。用TBST（北京索萊寶科技有限公司）洗膜3次，每次10 min。加入到二抗（1∶20 000），室溫下孵育1 h。將ECL加到膜上后，用化學發(fā)光成像系統(tǒng)曝光，出現(xiàn)蛋白條帶，保存圖片，用Image J軟件分析各條帶灰度值，以目的蛋白和內參蛋白灰度值的比值進行蛋白水平的比較。

1.3 統(tǒng)計學分析使用SPSS 25.0 和GraphPad Prism 7.0軟件對數(shù)據進行統(tǒng)計學分析和相關分析圖的繪制。符合正態(tài)及近似正態(tài)分布的定量數(shù)據以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間兩兩比較采用獨立樣本t檢驗，多重比較采用雙因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CLDN9 在侵襲性NFPA 組織中的表達qRT-PCR 檢測結果顯示，CLDN9 在侵襲性NFPA 組織中的mRNA水平明顯高于非侵襲性NFPA組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；IHC、WB 檢測結果顯示，CLDN9 蛋白主要在細胞核表達，在侵襲性NFPA組織中的表達量明顯高于非侵襲性NFPA組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001 或0.05）。CLDN9 在NFPA組織中表達如表1和圖1所示。

圖1 CLDN9在NFPA組織中的表達Figure 1 The expression levels of CLDN9 in NFPA tissues

表1 CLDN9在2組NFPA組織中的表達水平 （±s）Table 1 CLDN9 expression level in two groups of NFPA （±s）

表1 CLDN9在2組NFPA組織中的表達水平 （±s）Table 1 CLDN9 expression level in two groups of NFPA （±s）

組別qRT-PCR IHC WB非侵襲性NFPA組侵襲性NFPA組t值P值1.04±0.03 2.23±0.23 12.63＜0.001 2 294.50±154.92 4 086.78±188.79 17.98＜0.001 0.85±0.17 1.24±0.34 2.45 0.032

2.2 TYK2 在侵襲性NFPA 組織中的表達qRT-PCR 檢測結果顯示，TYK2 在侵襲性NFPA 組織中的mRNA水平明顯低于非侵襲性NFPA組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。IHC、WB檢測結果顯示，TYK2主要在細胞質中表達，胞外基質也有少量表達，在侵襲性NFPA 組織中的表達量明顯低于非侵襲性NFPA 組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01 或0.05）。TYK2在NFPA組織中的表達如表2和圖2所示。

圖2 TYK2在NFPA組織中的表達Figure 2 The expression levels of TYK2 in NFPA tissues

表2 TYK2在2組NFPA組織中的表達水平 （±s）Table 2 TYK2 expression level in two groups of NFPA （±s）

表2 TYK2在2組NFPA組織中的表達水平 （±s）Table 2 TYK2 expression level in two groups of NFPA （±s）

組別qRT-PCR IHC WB非侵襲性NFPA組侵襲性NFPA組t值P值1.02±0.02 0.29±0.13 13.82＜0.001 6 380.89±714.23 4 884.89±468.32 4.29 0.002 0.78±0.19 0.57±0.12 2.26 0.047

2.3 CLDN9 過表達后的TYK2 表達量將空載質粒（NC）和CLDN9（OE-CLDN9）質粒轉染后用WB 和qRT-PCR 檢測2 組細胞中的CLDN9 水平，結果顯示OE-CLDN9組中的表達明顯高于NC組（P＜0.001，如表3和圖3A～B），表示CLDN9過表達成功。接下來用qRT-PCR檢測2組細胞中的TYK2水平，檢測結果顯示TYK2在OE-CLDN9組的表達量明顯低于NC組（P＜0.01，如表3和圖3C）。

表3 2組細胞中的CLDN9、TYK2表達水平 （±s）Table 3 CLDN9 and TYK2 expression levels in the two groups （±s）

表3 2組細胞中的CLDN9、TYK2表達水平 （±s）Table 3 CLDN9 and TYK2 expression levels in the two groups （±s）

組別CLDN9 TYK2 NC組OE-CLDN9組F值P值1.46±0.50 4 680.02±646.42 943.30＜0.001 1.03±0.14 0.85±0.12 13.64 0.004

3 討論

NFPA 雖然是良性腫瘤，但因其侵襲性使其成為治療棘手的神經外科疾病之一［16］。因此，NFPA侵襲性相關的研究是神經外科領域的熱點之一。NFPA 的發(fā)生和發(fā)展是像其余腫瘤一樣參與原癌基因的激活、抑癌基因的失活、激素的刺激、生長因子的增多、細胞信號通路的異常等復雜的過程［17-18］。本研究團隊在前期研究中發(fā)現(xiàn)，CLDN9 是與垂體腺瘤發(fā)生有關的基因，在垂體腺瘤中的表達高于正常垂體組織［14］。本研究在此基礎上進行進一步研究，以期為NFPA 侵襲性的病理機制提供有價值的參考。

CLDNs 蛋白作為維持上皮屏障的重要結構，異常表達與腫瘤發(fā)生和侵襲性增加密切相關［19］，如在前列腺癌中CLDN3/4 高表達，CLDN3/4 被敲除后前列腺癌細胞的侵襲能力和存活率降低［20］。此外，CLDNs 異常表達具有組織依賴性，在不同組織來源的腫瘤中出現(xiàn)不同的表達異常［21］，如在漿乳頭狀腺癌中，CLDN1 高表達，CLDN2 低表達。相反，在子宮內膜樣增生組織中，CLDN1 低表達，CLDN2 高表達［22］。然而，CLDNs 與垂體腺瘤侵襲性相關的研究很少有報道。本研究中，與非侵襲性NFPA 組織相比，在侵襲性NFPA中CLDN9高表達，與本課題組前期得到的結果一致，即CLDN9 在垂體腺瘤中的表達高于正常垂體組織，在侵襲性垂體腺瘤中的表達量高于非侵襲性垂體腺瘤［14］。此外，KIM 等［23］也通過生物信息學發(fā)現(xiàn)高表達的CLDN9能夠促進NFPA侵襲性。結合上述研究結果可以認為，過表達的CLDN9 與NFPA 侵襲性增加有關。CLDNs 蛋白的異常表達可能影響TJ 成分的正常組成比，導致其完整的構和功能發(fā)生變化，進一步導致細胞間隙增加，腫瘤細胞通過“松弛”的細胞間隙進行增殖［22］，從而導致NFPA 侵襲性增加。此外，異常表達的CLDNs 還通過誘導上皮向間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）促進腫瘤侵襲性和遠處轉移［24］。因此，敲除CLDN9 的異常表達是有望成為對NFPA 侵襲性的潛在治療方法。

根據以往研究報道，在多種腫瘤中TYK2在多種細胞因子受體的作用下表達上調并與腫瘤惡性進展有關［10］。而本研究中在侵襲性NFPA 中TYK2 低表達。通過進一步查閱文獻發(fā)現(xiàn)，在有些腫瘤樣本或切片中TYK2的低表達被認為是不良預后的標志物［25］。有文獻報道，TYK2的表達下調有助于乳腺癌局部轉移［26］。關于肝細胞癌的一篇薈萃分析中提示，正?；蚋弑磉_的TYK2 與患者更長的生存期有關［27］。相關文獻中提到，TYK2 除致癌作用外，還介導干擾素（IFNs）、白介素-12（IL-12）等細胞因子起到免疫監(jiān)視、促進凋亡、抗腫瘤增殖作用［28-35］?；谝陨衔墨I報道，考慮TYK2 在NFPA 中的表達可能與其免疫監(jiān)視、抗腫瘤增殖作用有關，而低表達的TYK2 可能與NFPA侵襲性及不良預后有關。

為觀察在NFPA 中高表達的CLDN9 與TYK2 有無關系，將CLDN9 和空載體穩(wěn)定轉染到垂體瘤GT1-1細胞系，構建CLDN9過表達的垂體瘤GT1-1細胞系。驗證結果顯示，在垂體瘤GT1-1 細胞系中CLDN9 過表達后TYK2 表達下調。因此，考慮在NFPA 中高表達的CLDN9 可能通過低表達的TYK2促進其侵襲性。相關研究表明，CLDNs 通過誘導EMT促進腫瘤侵襲性和遠處轉移［28，36］。EMT的發(fā)生依賴于TYK2 的異常表達/激活［28，37-38］。SUN 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，CLDN12 在肺癌中的高表達通過TYK2 的異常表達誘導EMT，從而促進肺癌的轉移。因此，在NFPA 中高表達的CLDN9 可能通過低表達的TYK2誘導EMT，從而促進NFPA 侵襲性，其具體機制需進一步研究證實。

高表達的CLDN9 與NFPA 侵襲性生長有關，其可能通過低表達的TYK2 促進NFPA 侵襲性。本研究具有樣本量較小且實驗內容較簡單等局限性，需要進一步研究證實。本文為NFPA 侵襲性機制的進一步探索提供了初步的線索，有望成為NFPA侵襲性生長的預測因子及治療靶點。