柱后衍生-液相色譜法測定蔬菜中克百威殘留量的不確定度評定

黃小清，王宇，劉佳，譚錦萍，林澤珊，王成龍，黃松，趙金利

(廣州市食品檢驗所，廣州 511400)

克百威，又名呋喃丹，屬于氨基甲酸酯類殺蟲劑，具有良好殺蟲、殺螨效果，在農(nóng)作物種植中被廣泛使用。按照中國農(nóng)藥毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，克百威屬于高毒農(nóng)藥，人體攝入后會改變膜的滲透性與流動性來破壞人體神經(jīng)環(huán)境平衡，進(jìn)而威脅生命安全[1]。農(nóng)業(yè)部禁止克百威在蔬菜中使用，但是偷用、濫用現(xiàn)象時有發(fā)生[2]。GB 2763—2021 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[3]規(guī)定，克百威殘留為克百威及3-羥基克百威之和，以克百威表示，殘留限量值為0.020 mg/kg，因此準(zhǔn)確測定蔬菜中的克百威殘留量尤為重要。

目前，克百威的檢測方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法[4-5]、熒光檢測器高效液相色譜法[6-7]、紫外檢測器高效液相色譜法[8-9]、液相色譜法-質(zhì)譜法[10-11]等。其中較常見的是熒光檢測器高效液相色譜法，該方法靈敏度高，儀器配備要求不高，但樣品處理過程較繁瑣，實驗周期較長，不利于大批量檢測[12]。

測量不確定度是對測量結(jié)果準(zhǔn)確度的定量表征[13-14]，當(dāng)測量結(jié)果處于限量值范圍時，方法的不確定度對于測量結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性評估具有重要指導(dǎo)作用。

筆者基于QuEChERS 原則進(jìn)行樣品處理，采用柱后衍生-液相色譜法測定蔬菜中克百威殘留量，該方法快速、簡便，適用于大批量檢測，能夠滿足蔬菜中克百威殘留的檢測要求。同時，為確保檢測結(jié)果和判定的準(zhǔn)確性、可靠性，根據(jù)測量不確定度的程序和方法[15-18]，對蔬菜中克百威及其殘留物3-羥基克百威含量的不確定度進(jìn)行評估。通過分析和評估不確定度來源，確定影響測定結(jié)果的主要因素，為檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性及可靠性提供了技術(shù)依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：SHIMADZU UFLC-CRB-6A 型，配備柱后衍生系統(tǒng)，日本島津公司。

電子分析天平：SECURA3102-1CN 型，感量為0.1 mg，德國賽多利斯公司。

高速離心機(jī)：2-16KL 型，德國Sigma 公司。

渦旋振蕩器：Multi Reax P/N545-10000 型，德國海道夫儀器設(shè)備有限公司。

克百威標(biāo)準(zhǔn)溶液：100 μg/mL，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所。

3-羥基克百威標(biāo)準(zhǔn)溶液：100 μg/mL，美國Accustandard 公司。

氯化鈉、氫氧化鈉、硼酸：分析純，廣州化學(xué)試劑廠。

乙腈、甲醇：色譜純，美國賽默飛世爾科技公司。

鄰苯二甲醛：分析純，上海安譜實驗科技股份有限公司。

3-巰基丙酸：分析純，阿法埃莎中國化學(xué)有限公司。

蔬菜樣品：番茄，市售。

0.05 mol/L 氫氧化鈉溶液：稱取2 g 氫氧化鈉，用水定容至1 000 mL。

柱后衍生試劑：稱取硼酸3.34 g 和氫氧化鈉0.18 g，用400 mL 水溶解，為溶液A；稱取0.015 g鄰苯二甲醛，用50 mL 甲醇溶解，為溶液B；將溶液A 和溶液B 混合均勻得到溶液C；吸取3-巰基丙酸11 μL 加入溶液C 中，混合均勻。

1.2 樣品處理

1.2.1 提取

稱量20 g(精確至0.01 g)蔬菜樣品于50 mL離心管中，加入20 mL 乙腈，振蕩提取20 min，放入冰箱冷凍10 min，加入陶瓷均質(zhì)子，再加入5～7 g氯化鈉，振蕩10 min 后，以6 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心3 min，得上清液。

1.2.2 凈化

移取6 mL 上清液于15 mL 離心管中，加入N-丙基乙二胺渦旋混合，振蕩5 min，以8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心3 min 后，再準(zhǔn)確移取4 mL 上清液，于40℃下氮吹至近干，然后準(zhǔn)確加入1 mL 甲醇復(fù)溶，過0.22 μm 有機(jī)相濾膜后，待測。

1.3 儀器工作條件

色譜柱：XSelect HSS T3 型柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國沃特世科技有限公司)；柱溫：42℃；檢測器：熒光檢測器；激發(fā)波長：330 nm；發(fā)射波長：465 nm；流動相：A 為一級水，B 為甲醇；洗脫方式：梯度洗脫；梯度洗脫程序：0.01～2 min，15%～25%B ；2～8 min，25%～25%B ；8～9 min，25%～40%B；9～10 min，40%～45%B；10～24 min，45%～80%B；24～29 min，80%～80%B；29～30 min，80%～15%B；流動相流量：0.5 mL/min；柱后衍生程序：0.05 mol/L氫氧化鈉溶液流量為0.3 mL/min，柱后衍生試劑流量為0.3 mL/min；反應(yīng)器水解溫度為100 ℃，衍生溫度為40 ℃。

2 數(shù)學(xué)模型

采用色譜峰面積外標(biāo)法定量，建立蔬菜中克百威、3-羥基克百威殘留量測定的計算公式(1)：

式中：X——樣品中被測組分的殘留量，mg/kg；

ρ——從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的樣品中被測物的質(zhì)量濃度，μg/mL；

V1——提取溶液體積，mL；

V2——用于檢測的提取溶液體積，mL；

V3——樣品溶液定容體積，mL；

m——稱取的樣品質(zhì)量，g。

3 測量不確定度來源

分析檢測過程和數(shù)學(xué)模型可知，樣品測量的不確定度主要來源于樣品的稱量、標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制、樣品處理、儀器測量等。每個過程又分別受多種因素影響，整個測定過程中不同階段的不確定度來源分類如表1 所示。

表1 蔬菜中克百威殘留量的不確定度來源分類

4 不確定度分量的評定

4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

4.1.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

克百威標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)值ρ1=100 μg/mL，擴(kuò)展不確定度α=0.09 μg/mL。假設(shè)呈均勻分布，包含因子k=，根據(jù)文獻(xiàn)[15-16]計算公式可得標(biāo)準(zhǔn)品定值引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3-羥基克百威標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)值ρ2=100 μg/mL，擴(kuò)展不確定度α2為2.0 μg/mL。假設(shè)呈均勻分布，k=，根據(jù)文獻(xiàn)[15-16]計算公式可得標(biāo)準(zhǔn)品定值引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

4.1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程引入的不確定度

稀釋過程中不確定度來源主要是容量瓶、移液器的體積和溶劑由于環(huán)境溫度波動等因素引起的不確定度。按照J(rèn)JG 196—2006 《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[19]和JJG 646—2006《移液器》[20]檢定規(guī)程，玻璃器和移液器均有相應(yīng)的允許誤差。

10 mL 容量瓶(A 級)最大允差α為±0.02 mL，假定為三角形分布，k=，根據(jù)文獻(xiàn)[15-16]計算公式可得10 mL 容量瓶容量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

甲醇的膨脹系數(shù)為0.001 10/℃，實驗室溫度為(20±5)℃，假設(shè)呈均勻分布，k=，則由溫度波動引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

吸取1 mL(量程為100～1 000 μL 的移液器)質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL 容量瓶中，配制成標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。根據(jù)校準(zhǔn)證書，1 mL 移液器最大允差α為±1.0%；按照均勻分布，k=，根據(jù)文獻(xiàn)[15-16]計算公式可得該過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

因此標(biāo)準(zhǔn)中間液定容至10 mL 引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

4.1.3 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過程引入的不確定度

分別用100 μL、1 mL 移液器吸取0.05、0.10、0.20、0.50 mL 和1.00 mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 μg/mL)于一系列10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至標(biāo)線，得到質(zhì)量濃度分別為0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，移液器和容量瓶引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度如表2 所示。

表2 移液器和容量瓶引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

由表2 數(shù)據(jù)合成得配制系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

由以上分析可知克百威配制過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3-羥基克百威配制過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

4.2 樣品稱量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

樣品稱樣量m為20 g(精確至0.01 g)，天平最大允許誤差α為±0.01 g，采用B 類方法評定，假設(shè)呈均勻分布，k=，根據(jù)文獻(xiàn)[15-16]計算公式可得稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

4.3 樣品稀釋過程引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

(1)提取溶液體積引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。樣品加入20 mL 乙腈去稀釋，使用10 mL 吸管2 次，引入的不確定度主要來源于10 mL 吸管(A 級)。10 mL 吸管允許誤差α為±0.05 mL，采用B 類方法評定，假設(shè)呈均勻分布，k=，根據(jù)文獻(xiàn)[15-16]計算公式可得吸管引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

乙腈的膨脹系數(shù)為0.001 37/℃，實驗室控制溫度為(20±5)℃，假設(shè)呈均勻分布，k=，則由溫度波動引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

因此該過程中引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

(2)吸取提取溶液體積引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。準(zhǔn)確吸取4.00 mL 液體，在濃縮過程中產(chǎn)生的不確定度主要來源于5 mL 吸管(A 級)。5 mL 吸管允許誤差α為±0.025 mL，假設(shè)呈均勻分布，k=，根據(jù)文獻(xiàn)[15-16]計算公式得吸管引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

乙腈由溫度波動引入的不確定度為0.003 95，因此該過程中引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

(3)樣品溶液定容體積引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。加入1.00 mL 甲醇復(fù)溶的過程所產(chǎn)生的不確定度主要來源于1 mL 移液槍。已知1 mL 移液槍移取1 mL 溶液時允許誤差α為±1.0%，假設(shè)呈均勻分布，k=，根據(jù)文獻(xiàn)[15-16]計算公式可得引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

已知甲醇由溫度波動引入的不確定度為0.003 18，因此該過程中引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

合成得樣品稀釋過程引起的相對不確定度：

4.4 重復(fù)性測量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

選取番茄為實驗樣品，克百威和3-羥基克百威在0.020 mg/kg濃度下進(jìn)行加標(biāo)，平行進(jìn)行6組試驗，其測定結(jié)果見表3。

表3 克百威和3-羥基克百威加標(biāo)回收試驗結(jié)果 mg/kg

由表3 數(shù)據(jù)計算可得，克百威重復(fù)性測量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3-羥基克百威重復(fù)性測量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.5 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

以上不確定度分量相互獨立，沒有相關(guān)性，因此該方法克百威的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3-羥基克百威的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

4.6 擴(kuò)展不確定度

在置信水平為95%下，取k=2，則克百威的擴(kuò)展不確定度：

Ux1=kux1=0.001 3 mg/kg

3-羥基克百威的擴(kuò)展不確定度：

Ux2=kux2=0.001 6 mg/kg

最終測量克百威的不確定度報告：

(0.020±0.001 3)mg/kg，k=2

測量3-羥基克百威的不確定度報告：

(0.020±0.001 6)mg/kg，k=2

4.7 數(shù)據(jù)分析

通過對克百威和3-羥基克百威的測定過程中各個不確定度來源進(jìn)行分析評定，各不確定度分量的貢獻(xiàn)見表4。

表4 相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量

由表4 可知，樣品的稀釋定容過程引入的不確定度分量和重復(fù)性測量引入的不確定度分量大于不確定度最大貢獻(xiàn)分量的1/3，而樣品的稱量過程引入的不確定度分量小于不確定度最大貢獻(xiàn)分量的1/3，該分量可以忽略[21]。不確定度分量最大貢獻(xiàn)來源于標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋過程引入的不確定度分量，因此在實際樣品分析測定中，應(yīng)配制適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，盡量減少稀釋的次數(shù)，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性。

5 結(jié)語

通過對克百威測定過程中各個不確定度分量進(jìn)行分析評定，發(fā)現(xiàn)液相色譜柱后衍生法測定蔬菜中的克百威的不確定度主要來源于標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋過程。因此在實際樣品分析測定中，應(yīng)配制適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，盡量減少稀釋的次數(shù)，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性。