丁硫克百威在豇豆不同時(shí)期施用的降解代謝研究

王 娣，狄珊珊，王新全，張昌朋，王祥云，*，王 萌

(1.農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(籌)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥殘留檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021；2.海南大學(xué) 園藝學(xué)院，海南 ?？?570228；3.海南大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，海南 ?？?570228)

豇豆(Vignaunguiculata)，俗稱豆角、長豆角、帶豆、裙豆等[1-2]，是我國重要的蔬菜品種之一。豇豆富含維生素B1、維生素B2、維生素C等多種維生素和植物蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分[3]，口感清脆，味道鮮美，深受消費(fèi)者喜愛。豇豆易栽培，經(jīng)濟(jì)效益穩(wěn)定，在全國范圍內(nèi)廣泛種植[1，4]。但豇豆屬于花果同期作物，生產(chǎn)過程中極易受到病蟲為害[5]，菜農(nóng)常常在豇豆收獲期施用農(nóng)藥，以控制病蟲害、提高產(chǎn)量，這使得豇豆噴施農(nóng)藥后的安全間隔期難以保證，加重了農(nóng)藥殘留隱患[4]。

丁硫克百威(carbosulfan，CAS登錄號(hào)55285-14-8)，分子式為C20H32N2O3S，是一種廣譜的氨基甲酸酯類殺蟲劑[6]，適用于蚜蟲[7]、薊馬[8]等蟲害防治。丁硫克百威在杧果[9]、蘋果[10]、白菜[11]、韭菜[7]等植物體可以代謝成為毒性較高的克百威和3-羥基克百威[12](其主要代謝途徑如圖1所示)，會(huì)導(dǎo)致更高的膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)。近年來，豇豆中克百威超標(biāo)的案例也時(shí)有報(bào)道，如2010年的海南豇豆質(zhì)量安全事件[13]。此外，在2013年對(duì)陜西省10個(gè)市的農(nóng)貿(mào)市場、超市和批發(fā)市場市售蔬菜的抽樣調(diào)查[14]和2017上半年對(duì)安徽省部分地區(qū)批發(fā)市場的抽樣調(diào)查中[15]，均有克百威檢出。據(jù)調(diào)查，丁硫克百威也是潛在的克百威殘留來源之一。因此，對(duì)丁硫克百威及其代謝產(chǎn)物——克百威和3-羥基克百威進(jìn)行膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是非常有必要的。

圖1 丁硫克百威的主要代謝途徑Fig.1 Major metabolism pathways of carbosulfan

為明確丁硫克百威在豇豆不同生長時(shí)期的使用風(fēng)險(xiǎn)，特開展相關(guān)研究。針對(duì)豇豆的生長特點(diǎn)，設(shè)置播種期、苗期、結(jié)莢期2次施藥和結(jié)莢期3次施藥4種情景，以及不同施藥劑量的田間試驗(yàn)，按照一定的時(shí)間間隔采集成熟豇豆樣品，以液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)的方法測定丁硫克百威、克百威和3-羥基克百威的殘留量。同時(shí)，針對(duì)丁硫克百威在結(jié)莢期2次和3次施藥進(jìn)行了慢性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)和急性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。總體上，本研究旨在對(duì)安全合理使用農(nóng)藥提供實(shí)用性依據(jù)，通過對(duì)丁硫克百威的降解代謝進(jìn)行研究，以掌握豇豆中丁硫克百威、克百威和3-羥基克百威的殘留水平，通過評(píng)估其膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)水平，探究消費(fèi)者因食用豇豆而攝入丁硫克百威、克百威和3-羥基克百威的潛在健康風(fēng)險(xiǎn)，從而為豇豆生產(chǎn)的質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)管理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-30AD液相色譜儀，日本島津公司；Triple Quad 4500質(zhì)譜儀，美國AB SCIEX公司；Heraeus biofuge primo R型離心機(jī)，美國Thermo Scientific公司；BSA2202S型電子天平，北京塞多利斯科學(xué)儀器有限公司；QT-2型旋渦混合器，上海琪特分析儀器有限公司；0.22 μm濾膜，天津博納艾杰爾科技有限公司；Millipore-Q超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司。

丁硫克百威、克百威和3-羥基克百威標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 mg·L-1)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(天津)；35%丁硫克百威種子處理粉劑，美國富美實(shí)公司；200 g·L-1丁硫克百威乳油，江蘇藍(lán)豐生物化工股份有限公司；乙腈(色譜純)，德國Merck公司；無水硫酸鎂(分析純)，永華化學(xué)科技(江蘇)有限公司；醋酸鈉(分析純)，廣東光華科技股份有限公司；C18凈化材料，天津博納艾杰爾科技有限公司。試驗(yàn)用水均系由Millipore-Q超純水系統(tǒng)制得的超純水，25 ℃條件下電阻率18.2 MΩ·cm。

1.2 分析方法

1.2.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取10 g樣品(精確至0.01 g)至50 mL離心管，加入20 mL乙腈，渦旋提取3 min，加入6 g無水硫酸鎂和1.5 g醋酸鈉后立即手動(dòng)劇烈振搖1 min，隨后以5 000 r·min-1離心5 min。取上清液1.5 mL至裝有50 mg C18凈化材料和200 mg無水硫酸鎂的2 mL離心管中，渦旋混勻30 s后以5 000 r·min-1離心5 min，取1.0 mL上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾至進(jìn)樣小瓶，待LC-MS/MS測定。

1.2.2 儀器條件

液相色譜條件：Inertsil ODS-3色譜柱(75 mm×2.10 mm，2 μm，日本島津公司)；流動(dòng)相，V(甲醇)∶V(水)=90∶10；流速，0.25 mL·min-1；柱溫，35 ℃；進(jìn)樣時(shí)間，8 min；進(jìn)樣體積，5 μL。

質(zhì)譜條件：多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)；離子源，正離子源模式(ESI+)；氣簾氣，40 psi(1 psi=0.070 3 kg·cm-2)；離子化電壓，+5 500 V；溫度，450 ℃；噴霧氣，30 psi；輔助加熱氣，30 psi。丁硫克百威、克百威和3-羥基克百威的監(jiān)測離子對(duì)和相關(guān)參數(shù)見表1。

表1 丁硫克百威、克百威和3-羥基克百威的MRM參數(shù)Table 1 MRM parameter of carbosulfan，carbofuran and 3-hydroxycarbofuran

1.2.3 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

經(jīng)預(yù)試驗(yàn)驗(yàn)證，基質(zhì)抑制效應(yīng)較強(qiáng)，為了保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，本試驗(yàn)采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。具體方法簡述如下：依次準(zhǔn)確吸取1 000 mg·L-1的丁硫克百威、克百威和3-羥基克百威標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.00 mL，以乙腈定容，配制為100 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。以1.2.1節(jié)獲得的空白豇豆提取液分別配制0.005、0.010、0.020、0.100、0.200、0.500 mg·L-1的丁硫克百威、克百威和3-羥基克百威基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法定量。

1.2.4 添加回收試驗(yàn)

在空白豇豆樣品中添加0.01、0.05、0.20、1.00 mg·kg-1的丁硫克百威、克百威和3-羥基克百威，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，渦旋混勻后靜置30 min，使化合物被豇豆樣品充分吸收。樣品前處理和儀器測定同1.2.1和1.2.2節(jié)，計(jì)算該方法的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.3 田間試驗(yàn)

田間試驗(yàn)于2016年7—9月在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院基地進(jìn)行。豇豆露地種植，土壤肥沃疏松，灌排方便。試驗(yàn)期間以晴好天氣為主，54 d的試驗(yàn)周期內(nèi)僅有18 d出現(xiàn)降雨。根據(jù)土壤墑情，適時(shí)通過溝灌的方式補(bǔ)水。該基地試驗(yàn)前3 a未種植過豆類作物。根據(jù)豇豆的生長特點(diǎn)，分別設(shè)置4塊試驗(yàn)田，分為播種期、苗期、結(jié)莢期2次施藥和結(jié)莢期3次施藥4種施藥情景，每種施藥情景下僅在對(duì)應(yīng)時(shí)期施藥。參照丁硫克百威農(nóng)藥產(chǎn)品的標(biāo)簽信息，播種期設(shè)最低劑量(2 250 g·hm-2，以有效成分計(jì)，下同)、最高劑量(3 750 g·hm-2)和最高劑量的1.5倍(5 625 g·hm-2)3個(gè)施藥劑量；苗期、結(jié)莢期2次施藥和結(jié)莢期3次施藥分別設(shè)最低劑量(225 g·hm-2)、最高劑量(375 g·hm-2)和最高劑量的1.5倍(562.5 g·hm-2)3個(gè)施藥劑量。每個(gè)處理重復(fù)3次。

播種期施藥情景下，采用土施的施藥方式，于播種后43、47、51 d采集豇豆樣品；苗期施藥情景下，于豇豆出苗10 d后，每隔7 d噴霧施藥1次，始花期最后1次施藥(共4次)，分別于距最后一次施藥后10 (豇豆成熟)、14 、18 d采集豇豆樣品。結(jié)莢期2次施藥情景下，于始花期第1次施藥，間隔5 d施第2次，分別于距最后一次施藥后1、3、5、7、10 d采集豇豆樣品。結(jié)莢期3次施藥情景下，于始花期第1次施藥，每間隔5 d依次施第2、3次，分別于距最后一次施藥后1、3、5、7、10 d采集豇豆樣品。

每個(gè)小區(qū)的邊行和每行兩邊0.5 m內(nèi)不進(jìn)行采樣，在小區(qū)內(nèi)設(shè)置10個(gè)以上的采樣點(diǎn)，隨機(jī)采集豇豆樣品，每個(gè)小區(qū)采集1 kg樣本裝入容器中包扎妥當(dāng)，帶回實(shí)驗(yàn)室處理。樣品用不銹鋼刀具切成2～4 cm的小段，用四分法縮分樣本，分取500 g樣品，經(jīng)勻漿后裝入封口樣品容器中，貼好標(biāo)簽，放入低溫冰箱(-20 ℃)中待測。

1.4 慢性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)和急性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

農(nóng)藥的慢性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)(%ADI)和急性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)(%ARfD)參照GB 2763—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》進(jìn)行評(píng)估，其中，某類食品一餐的最大消費(fèi)量、以可食部分計(jì)的產(chǎn)品單個(gè)質(zhì)量、變異因子，以及丁硫克百威、克百威、3-羥基克百威的急性參考劑量參照聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)的報(bào)告[16]，分別取值為0.5 487 kg、0.083 kg、3、0.02 mg·kg-1·d-1、0.001 mg·kg-1·d-1、0.001 mg·kg-1·d-1。

當(dāng)%ADI或%ARfD≤100%時(shí)，表示其風(fēng)險(xiǎn)為可接受，值越小，風(fēng)險(xiǎn)越?。划?dāng)%ADI或%ARfD>100%時(shí)，表示有不可接受的風(fēng)險(xiǎn)，值越大，風(fēng)險(xiǎn)越大。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的線性范圍、準(zhǔn)確度和精密度

在0.005～0.500 mg·L-1范圍內(nèi)，丁硫克百威、克百威和3-羥基克百威的峰面積(y)與質(zhì)量濃度(x)間具有良好的線性相關(guān)性，線性回歸方程分別為y=223 002x+28 710、y=106 142x+106和y=4 254.8x-19 699，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.99，方法定量限(LOQ)均為0.01 mg·kg-1。

添加回收試驗(yàn)結(jié)果(表2)顯示，0.01～1.00 mg·kg-1添加水平下：丁硫克百威的平均回收率為73%～105%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)低于20.1%；克百威的平均回收率為72%～94%，RSD低于12.5%；3-羥基克百威的平均回收率為82%～103%，RSD低于17.3%。以上指標(biāo)均符合NY/T 788—2018《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》中關(guān)于添加回收試驗(yàn)的要求。

表2 丁硫克百威、克百威和3-羥基克百威在豇豆中的平均添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table 2 Average recovery and relative standard deviation (RSD) of carbosulfan，carbofuran and 3-hydroxycarbofuran in cowbean under different spiking levels (n=5)

2.2 丁硫克百威在豇豆播種期使用后的殘留

按照推薦劑量的最低劑量、最高劑量和最高劑量的1.5倍在播種期使用丁硫克百威后，藥后43、47、51 d采集的豇豆中均無丁硫克百威及其代謝物檢出。

2.3 丁硫克百威在豇豆苗期使用后的殘留

據(jù)GB 2763—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》：丁硫克百威在豇豆上無最大殘留限量(MRL)，克百威在豇豆上的MRL為0.02 mg·kg-1，3-羥基克百威以克百威計(jì)。

豇豆始花期最后一次使用丁硫克百威后，于藥后10、14、18 d分別采集成熟的豇豆樣品，測定結(jié)果顯示：藥后10 d的豇豆中無丁硫克百威檢出，最高劑量藥后10 d克百威(含3-羥基克百威，將3-羥基克百威的殘留量乘以換算系數(shù)0.93折算成克百威的殘留量)的殘留量達(dá)0.019 mg·kg-1，最高劑量的1.5倍藥后10 d 克百威(含3-羥基克百威)的殘留量達(dá)0.040 mg·kg-1，高于MRL。

2.4 丁硫克百威在結(jié)莢期使用后的殘留及其風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

2.4.1 丁硫克百威在結(jié)莢期使用后的殘留

在結(jié)莢期2次使用丁硫克百威，在藥后1、3、5、7、10 d采集的豇豆中，丁硫克百威、克百威和3-羥基克百威均有檢出，檢出濃度隨時(shí)間推進(jìn)而降低。藥后1 d采集的豇豆中，丁硫克百威的殘留值較高；藥后1、3、5 d采集的豇豆中克百威(含3-羥基克百威)殘留量均高于GB 2763—2019規(guī)定的MRL；以最高劑量和最高劑量的1.5倍施藥后7 d，豇豆中的克百威(含3-羥基克百威)殘留量仍高于GB 2763—2019規(guī)定的MRL；直至藥后10 d，3種劑量下豇豆中的克百威(含3-羥基克百威)殘留量才降至GB 2763—2019規(guī)定的MRL以下(表3)。

表3 丁硫克百威結(jié)莢期2次施用后在豇豆中的殘留動(dòng)態(tài)Table 3 Residue dynamics of carbosulfan after double application during fruiting stage

在結(jié)莢期3次使用丁硫克百威，在藥后1、3、5、7、10 d采集的豇豆中，丁硫克百威、克百威和3-羥基克百威均有檢出，且檢出濃度隨時(shí)間推進(jìn)而降低。藥后1 d和3 d采集的豇豆中丁硫克百威的殘留量較高；藥后1、3、5 d的豇豆中克百威(含3-羥基克百威)殘留量均高于GB 2763—2019規(guī)定的MRL；最高劑量和最高劑量1.5倍藥后7 d，豇豆中的克百威(含3-羥基克百威)殘留量仍高于MRL；最低劑量和最高劑量藥后10 d，豇豆中的克百威(含3-羥基克百威)殘留量已低于MRL，但最高劑量1.5倍藥后10 d的豇豆中克百威(含3-羥基克百威)殘留量仍高于MRL(表4)。

表4 丁硫克百威結(jié)莢期3次施用后在豇豆中的殘留動(dòng)態(tài)Table 4 Residue dynamics of carbosulfan after triple application during fruiting stage

2.4.2 丁硫克百威在結(jié)莢期使用后的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

由于結(jié)莢期2次和3次施藥后丁硫克百威、克百威(含3-羥基克百威)殘留量較高，所以進(jìn)一步開展風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。如圖2、3所示，丁硫克百威的%ADI和%ARfD均在藥后1 d最高，分別為1.37%～16.9%和1.74%～19.6%；克百威(含3-羥基克百威)的%ADI和%ARfD也表現(xiàn)為藥后1 d最高，分別為45.8%～239%和110%～555%。結(jié)莢期2次施藥和3次施藥后丁硫克百威的%ADI和%ARfD均低于100%，表明其慢性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)和急性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)均可接受。但是，當(dāng)施用劑量為最高劑量的1.5倍時(shí)，結(jié)莢期2次施藥情景下，克百威(含3-羥基克百威)的%ADI在藥后1 d高于100%，其慢性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)不可接受；克百威(含3-羥基克百威)的%ARfD，在最低劑量施藥后1 d、最高劑量施藥后前3 d、最高劑量的1.5倍施藥后前5 d均高于100%，其急性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)均不可接受。結(jié)莢期3次施藥情景下，最低劑量和最高劑量施藥后1 d，最高劑量的1.5倍施藥后前3 d，克百威(含3-羥基克百威)的%ADI均高于100%，其慢性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)不可接受；最低劑量和最高劑量施藥后前3 d、最高劑量1.5倍施藥后前5 d，克百威(含3-羥基克百威)的%ARfD均高于100%，其急性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)不可接受。

3 討論

丁硫克百威使用后的超標(biāo)風(fēng)險(xiǎn)主要源于其代謝物——克百威(含3-羥基克百威)。本試驗(yàn)表明，苗期以最高劑量的1.5倍施用丁硫克百威將導(dǎo)致藥后10 d的豇豆中克百威(含3-羥基克百威)殘留量超標(biāo)，以最高劑量施藥后10 d的豇豆中克百威(含3-羥基克百威)殘留量也已接近GB 2763—2019規(guī)定的MRL；結(jié)莢期2次或3次施藥后7 d內(nèi)克百威(含3-羥基克百威)的殘留量超標(biāo)；結(jié)莢期以最高劑量的1.5倍3次施藥10 d后豇豆中克百威(含3-羥基克百威)的殘留量仍高于GB 2763—2019規(guī)定的MRL。這與宋禹等[11]的研究結(jié)果一致：在白菜中噴施丁硫克百威后，代謝產(chǎn)生的克百威和3-羥基克百威含量隨時(shí)間延長均呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，且半衰期遠(yuǎn)大于丁硫克百威。因此，從安全監(jiān)管的角度，播種期使用丁硫克百威不會(huì)導(dǎo)致豇豆中殘留超標(biāo)，可以安全使用；但苗期和結(jié)莢期使用丁硫克百威存在極高的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)考慮禁止其在播種期之外使用。此外，結(jié)莢期3次施藥情景的殘留量顯著高于2次施藥，其原因可能包括：一是部分來自于3次施藥殘留的疊加；二是2次施藥時(shí)豇豆正處于快速生長期[17]，而3次施藥時(shí)豇豆生長已較為緩慢，農(nóng)藥殘留代謝較慢。

膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果顯示：結(jié)莢期施藥，2次施藥和3次施藥后的膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)主要源于丁硫克百威的代謝物——克百威(含3-羥基克百威)。其中，丁硫克百威的慢性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)和急性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)均較低，小于100%。但當(dāng)以最高劑量的1.5倍在結(jié)莢期2次施藥后1 d，克百威(含3-羥基克百威)的%ADI高于100%，其慢性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)不可接受；在最低劑量施藥后1 d、最高劑量施藥后前3 d、最高劑量的1.5倍施藥后前5 d，克百威(含3-羥基克百威)的%ARfD均高于100%，其急性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)不可接受。結(jié)莢期3次施藥情景下，以最低劑量和最高劑量施藥后1 d、最高劑量的1.5倍施藥后前3 d，克百威(含3-羥基克百威)的%ADI均高于100%，其慢性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)不可接受；以最低劑量和最高劑量施藥后前3 d、最高劑量的1.5倍施藥后前5 d，克百威(含3-羥基克百威)的%ARfD均高于100%，其急性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)不可接受。因此，丁硫克百威在豇豆結(jié)莢期使用會(huì)產(chǎn)生極高的急性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)禁止丁硫克百威在結(jié)莢期的使用。

與其他類似的文獻(xiàn)相比，大部分研究丁硫克百威或者其他農(nóng)藥殘留的文獻(xiàn)只涉及農(nóng)藥的降解代謝[7，11]，而本文在分析降解代謝的基礎(chǔ)上加入了膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，旨在從食品安全的角度引起人們的重視，從而為農(nóng)藥的合理使用提供參考。

根據(jù)本研究的殘留數(shù)據(jù)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果，丁硫克百威在豇豆中的使用存在較大的質(zhì)量安全和膳食風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)對(duì)其使用加以嚴(yán)格的限制：建議不允許在豇豆播種期之外使用。

A～C的施藥劑量分別為最低劑量、最高劑量和最高劑量的1.5倍。圖中克百威的數(shù)據(jù)包含3-羥基克百威。下同。The application dosage in A-C was the lowest dose，the maximum dose，and 1.5 times the maximum dose according to the registration，respectively.The data for carbofuran included 3-hydroxycarbofuran.The same as bleow.圖2 結(jié)莢期2次施藥場景豇豆樣本的膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)Fig.2 Risk assessment of cowpea samples after double application during fruiting stage

圖3 結(jié)莢期3次施藥后豇豆樣本的膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)Fig.3 Risk assessment of cowpea samples after triple application during fruiting stage