小新月菱形藻的常壓室溫等離子體誘變及高產(chǎn)巖藻黃素藻株的篩選?

梁 英， 辛紅翠， 閆譯允， 田傳遠， 紀維瑋

(海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室(中國海洋大學)， 山東 青島 266003)

巖藻黃素是一種脂溶性類胡蘿卜素，為海洋藻類所特有，以大型褐藻和海洋硅藻為主[1]。因其功效顯著，應用價值高受到廣泛的關(guān)注[2]。研究表明，巖藻黃素具有降血糖、抗氧化、抗炎等多種功能[3-5]，其在海洋藥物方面利用價值較高[6]。目前，巖藻黃素主要從大型褐藻如裙帶菜、海帶中獲得[7]，因為在大型褐藻中巖藻黃素僅存在于表皮的表層細胞，所以其在大型褐藻中含量低[2]，一般為0.1～1.0 mg/g，且大型藻類細胞壁厚，藻膠含量豐富，導致巖藻黃素提取困難[7]。與大型藻類相比，海洋硅藻具有光合作用效率高、生長周期短、巖藻黃素含量高(其巖藻黃素含量是大型藻類的4倍以上[8-10])以及提取方便等優(yōu)點。因此，海洋硅藻在巖藻黃素大規(guī)模開發(fā)利用方面具有很大的潛力。

目前，有關(guān)通過優(yōu)化培養(yǎng)條件提高硅藻巖藻黃素含量的報道較多：臧正蓉等[2]研究結(jié)果表明，25 ℃、紅光條件下可使三角褐指藻(Phaeodactylumtricornu-tum)巖藻黃素含量顯著提高，但對藻細胞的光合活性有一定的抑制作用。宋培欽等[11]研究結(jié)果表明，鹽度20、pH 8.0、以碳銨為氮源更有利于促進藻細胞中巖藻黃素的積累。徐潤潔等[1]研究結(jié)果表明，紫光條件處理后三角褐指藻細胞巖藻黃素含量能極顯著提高，但會加速藻細胞的衰老。以上研究結(jié)果為優(yōu)化微藻培養(yǎng)條件、提高巖藻黃素產(chǎn)量奠定了理論基礎(chǔ)，但巖藻黃素產(chǎn)量的提高往往伴隨著藻細胞光合活性及生長指標的下降。因此，在提高硅藻巖藻黃素產(chǎn)量的同時又能促進藻細胞的生長、提高其光合活性的新方法成為研究熱點之一。

常壓室溫等離子體(Atmospheric and room temperature plasma, ARTP)誘變作為一種新型的誘變育種技術(shù)具有操作簡單、安全高效、不污染環(huán)境、得到的突變株具有較高的遺傳穩(wěn)定性等優(yōu)點，應用前景廣闊[12]。目前該技術(shù)已經(jīng)在微生物領(lǐng)域得到了廣泛應用[13-15]。但在微藻育種方面研究較少，主要應用在寇氏隱甲藻(Crypthecodiniumcohnii)[16]、雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)[17]、鈍頂螺旋藻(Spirulinaplatensis)[18]、蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoi-dosa)[19]、柵藻(Desmodesmussp.)[20]等育種研究中，用該技術(shù)獲得了具有高生物量、高油脂產(chǎn)量以及高多糖、高氨基酸、高蝦青素含量等優(yōu)良性狀的突變株，該技術(shù)的應用前景十分廣闊。

小新月菱形藻(Nitzschiaclosteriumf.minutissima)俗稱“小硅藻”，富含油脂、蛋白質(zhì)、二十碳五烯酸(EPA)多不飽和脂肪酸，是多種水產(chǎn)經(jīng)濟動物的優(yōu)良生物餌料[21]。在海洋硅藻中，小新月菱形藻作為巖藻黃素、EPA、金藻昆布糖等活性物質(zhì)的潛在生產(chǎn)者而得到廣泛研究，到目前為止，還沒有發(fā)現(xiàn)利用ARTP誘變技術(shù)獲取高產(chǎn)巖藻黃素小新月菱形藻的報道。

硫酸鈰銨是一種稀土誘導子，朱帥旗等[22]通過研究不同濃度硫酸鈰銨對三角褐指藻生長和巖藻黃素含量的影響發(fā)現(xiàn)，較低濃度的硫酸鈰銨能顯著促進藻細胞巖藻黃素的積累，但會抑制藻細胞的生長。由此可見，較低濃度的硫酸鈰銨對于巖藻黃素來說起誘導作用，但對于生長起脅迫作用，可將其作為生長的篩選壓力，選擇在添加了硫酸鈰銨的培養(yǎng)液中生長指標仍較好的突變株作為優(yōu)良突變株，從而使突變株的生長、光合作用、巖藻黃素含量同步提升。本文以小新月菱形藻B248為研究對象，通過ARTP技術(shù)對其進行誘變，獲得大量突變株，篩選出生長、光合活性及巖藻黃素含量均高于出發(fā)株的優(yōu)良突變株，為高產(chǎn)巖藻黃素小新月菱形藻株系開發(fā)提供了技術(shù)路線和優(yōu)良株系。

1 材料與方法

1.1 藻種及實驗設(shè)計

本實驗所用藻種小新月菱形藻(編號為MACC/B248)來源于中國海洋大學微藻種質(zhì)庫。藻種培養(yǎng)條件為f/2培養(yǎng)基[23]、溫度(20±1) ℃，鹽度31，光照周期12L∶12D，光照強度60 μmol·m-2·s-1。

待藻液達到指數(shù)生長期后進行ARTP誘變，通過計算小新月菱形藻B248的致死率確定最佳誘變時間。之后按照最佳誘變時間對B248再次進行誘變，將誘變后的藻液均勻涂布在f/2固體培養(yǎng)基中，暗處理24 h后置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。然后分別進行固體平板第一輪篩選、96孔板第二輪篩選、20 mL試管第三輪篩選、100 mL錐形瓶第四輪篩選。培養(yǎng)條件同藻種培養(yǎng)條件。

1.2 ARTP誘變方法

用f/2培養(yǎng)基將處于指數(shù)生長期的小新月菱形藻B248藻液密度稀釋至1×106個/mL左右，事先灼燒金屬載片30 s，冷卻后，取10 μL稀釋好的藻液在金屬載片上進行均勻涂布，再將涂有藻液的金屬載片置于ARTP-IIS常壓室溫等離子體誘變育種儀(無錫源清天木生物科技有限公司)操作室中，設(shè)置輸出功率為120 W，有效處理距離為2 mm，控制氣量為10 L/min，誘變時間分別設(shè)置為0、4、8、12、16、20、24和28 s，每個時間梯度設(shè)3個平行。ARTP誘變處理后，金屬載片自動落入預先加入1 mL f/2培養(yǎng)基的EP管內(nèi)，用渦旋震蕩器適當震蕩EP管將金屬載片上的藻細胞洗脫至培養(yǎng)液中。取適量已經(jīng)稀釋為原濃度1/10的藻液在固體平板上(其培養(yǎng)基是將1.5%的瓊脂加入f/2液體培養(yǎng)基中)進行均勻涂布，每個固體平板藻落數(shù)控制在50～100。黑暗培養(yǎng)24 h計算致死率(L)，其計算公式為：

L=(N-Nt)/N×100%。

式中：N為ARTP誘變處理0 s時藻落數(shù)；Nt為ARTP分別誘變處理4、8、12、16、20、24和28 s時藻落數(shù)。

1.3 突變株的篩選

將進行黑暗處理的固體平板上的小新月菱形藻B248藻細胞放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第一輪篩選在固體平板中進行，本輪篩選以藻落的顏色、形狀、大小等為指標，從固體平板中挑選圓潤、藻落生長較好且顏色較深的單藻落接種于96孔板中。第二輪篩選在96孔板中進行培養(yǎng)，本輪篩選以O(shè)D680值為指標，篩選出OD680值高于出發(fā)株的優(yōu)良突變株接種于20 mL試管中。第三輪篩選在20 mL試管中進行，當藻液長出顏色時向培養(yǎng)液添加硫酸鈰銨(終濃度為0.6 mg/L，現(xiàn)配現(xiàn)用)誘導藻細胞積累巖藻黃素，本輪篩選以藻液OD680值、葉綠素熒光參數(shù)(Fv/Fm和rETR值)為指標，篩選出上述參數(shù)均高于出發(fā)株的優(yōu)良突變株，然后接種于100 mL錐形瓶中。第四輪篩選在100 mL錐形瓶中進行，培養(yǎng)至藻液長出顏色，再用0.6 mg/L的硫酸鈰銨脅迫篩選，本輪篩選以O(shè)D680值、葉綠素熒光參數(shù)(Fv/Fm和rETR值)及巖藻黃素含量為指標，篩選出上述參數(shù)均高于出發(fā)株的優(yōu)良突變株。將經(jīng)過四輪篩選所獲得的突變株與出發(fā)株藻液分別接種于500 mL三角燒瓶中，培養(yǎng)液中不添加硫酸鈰銨，培養(yǎng)結(jié)束后測定其葉綠素熒光參數(shù)(Fv/Fm、rETR)、單位體積干質(zhì)量及巖藻黃素含量。

1.4 遺傳穩(wěn)定性研究

將經(jīng)過四輪篩選得到的突變株接種于1 000 mL三角燒瓶中傳代培養(yǎng)，傳至5代，對Fv/Fm、rETR、單位體積干質(zhì)量和巖藻黃素含量進行測定，確定其遺傳穩(wěn)定性。

1.5各項參數(shù)的測定

用全自動酶標儀(Bio Tek Synergy HTX)測定96孔板中藻細胞的OD680值；用紫外可見分光光度計(KXB-20W-IB)測定試管和錐形瓶中藻細胞的OD680值；采用Liang等[24]的方法，用Water-PAM水樣葉綠素熒光儀測定葉綠素熒光參數(shù)rETR(相對電子傳遞速率)和Fv/Fm(PSⅡ最大光能轉(zhuǎn)化效率)；按照Wang等[10]的方法測定巖藻黃素含量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

用Origin8.5軟件繪制圖形，用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因子方差分析和多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 小新月菱形藻B248誘變致死率

圖1表示小新月菱形藻B248誘變致死率。由圖1可知，B248致死率隨著誘變時間的增加而升高。突變體改變更多生理功能的關(guān)鍵因素是致死率[19]。在實驗條件下，等離子體誘變時間達到16和20 s后，B248藻細胞致死率分別為90.0%和97.4%；之后，隨著誘變時間的增加，B248死亡率高達100%。因此，在實驗條件下，確定小新月菱形藻B248產(chǎn)生有利突變株的最佳處理時間為16和20 s。

2.2 小新月菱形藻B248突變株的篩選

2.2.1 固體平板第一輪篩選結(jié)果 分別將ARTP誘變處理16和20 s后的小新月菱形藻B248藻細胞均勻涂布于f/2固體培養(yǎng)基平板上，15 d后獲得大量突變株單克隆，從中選出圓潤、藻落生長較好且顏色較深的單藻落接種于96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。本輪從大量小新月菱形藻突變株中篩選出220株優(yōu)良突變株。

圖1 小新月菱形藻B248誘變致死率

2.2.2 96孔板第二輪篩選結(jié)果 將平板初篩獲得的小新月菱形藻B248優(yōu)良突變株接種于96孔板中進行培養(yǎng)，待藻液長出顏色(10 d后)，測定OD680值。圖2表示B248出發(fā)株與220株突變株的OD680值。編號0表示出發(fā)株，以出發(fā)株的OD680值為基準添加輔助線，篩選出OD680值高于出發(fā)株的藻株作為優(yōu)良突變株進行擴大培養(yǎng)。由圖2可知，經(jīng)過ARTP誘變，雖有不少B248突變株的OD680值低于出發(fā)株，但仍有90株突變株的OD680值高于出發(fā)株。這可能是由于ARTP誘變損傷了大部分藻細胞的生長基因，藻細胞在短期內(nèi)無法修復，從而降低其生長速度；而一些自身修復能力較強的藻細胞會在修復的過程中產(chǎn)生正向突變，提高自身的生長、繁殖能力[18, 25-26]。本輪從220株小新月菱形藻突變株中篩選出90株OD680值高于出發(fā)株的優(yōu)良突變株。

圖2 小新月菱形藻B248第二輪篩選過程中出發(fā)株與220株突變株的OD680值

2.2.3 20 mL試管第三輪篩選結(jié)果 第三輪篩選使用硫酸鈰銨對小新月菱形藻B248突變株進行脅迫篩選。第二輪篩選獲得的優(yōu)良突變株接種于20 mL試管中進行培養(yǎng)，待藻液出現(xiàn)顏色(5 d后)，向培養(yǎng)液中添加硫酸鈰銨(濃度為0.6 mg/L)培養(yǎng)5 d后，測定藻液OD680值和葉綠素熒光參數(shù)(Fv/Fm和rETR值)，篩選出上述參數(shù)均高于出發(fā)株的突變株進行擴大培養(yǎng)。

圖3表示小新月菱形藻B248出發(fā)株與90株突變株的OD680、Fv/Fm和rETR值，編號0表示出發(fā)株，以出發(fā)株的OD680值為基準添加輔助線，高度超過輔助線代表突變株的OD680值高于出發(fā)株，反之則代表突變株的該參數(shù)低于出發(fā)株。由圖3A可知，90株B248突變株有33株OD680值低于出發(fā)株，這與第二輪篩選所得90株突變株OD680值全部高于出發(fā)株結(jié)果不一致，其原因可能是本輪篩選所用硫酸鈰銨誘導藻細胞產(chǎn)生巖藻黃素的同時也在一定程度上抑制了藻細胞的生長，從而降低了藻細胞的OD680值。由圖3B和3C可知，在硫酸鈰銨脅迫的情況下，部分B248突變株的Fv/Fm和rETR值雖有不同程度的降低，但大部分突變株能應對不良環(huán)境，表現(xiàn)出較強的光合活性，從圖3中可以看出，有53株小新月菱形藻突變株的Fv/Fm值高于出發(fā)株，60株的rETR值高于出發(fā)株。由圖3可知，共有35株突變株的OD680、Fv/Fm和rETR值均高于出發(fā)株，經(jīng)過本輪硫酸鈰銨脅迫篩選，共從90株小新月菱形藻突變株中獲得35株生長和光合活性均高于出發(fā)株的優(yōu)良突變株。

圖3 小新月菱形藻B248第三輪篩選過程中出發(fā)株與90株突變株的OD680、Fv/Fm和rETR值

2.2.4 100 mL錐形瓶第四輪篩選結(jié)果 將第三輪篩選得到的35株突變株接種于100 mL錐形瓶擴大培養(yǎng)，待藻液長出顏色(5 d后)，向培養(yǎng)液中添加硫酸鈰銨(濃度為0.6 mg/L)，培養(yǎng)5 d后，測定藻液OD680值、葉綠素熒光參數(shù)(Fv/Fm和rETR值)以及巖藻黃素含量，篩選出上述參數(shù)均高于出發(fā)株的突變株進行擴大培養(yǎng)。

第四輪篩選過程中小新月菱形藻B248出發(fā)株與35株突變株的OD680、Fv/Fm、rETR值和巖藻黃素含量如圖4所示，編號0表示B248的出發(fā)株，以出發(fā)株的OD680值為基準添加輔助線，高度超過輔助線代表突變株的OD680值高于出發(fā)株，反之則代表突變株的該參數(shù)低于出發(fā)株。由圖4A可知，35株突變株中僅6株突變株的OD680值低于出發(fā)株。這說明，經(jīng)過第三輪硫酸鈰銨脅迫篩選，大部分突變株對硫酸鈰銨產(chǎn)生了耐受能力，也說明經(jīng)過ARTP誘變處理得到的優(yōu)良突變株具有穩(wěn)定的環(huán)境適應能力，因此它們的OD680值高于出發(fā)株。由圖4B和4C可知，有8株突變株Fv/Fm低于出發(fā)株，13株突變株的rETR低于出發(fā)株，而第三輪篩選中選擇的突變株其Fv/Fm、rETR均高于出發(fā)株，可能是因為第三、四輪使用的硫酸鈰銨的累積作用降低了它們的光合活性。由圖4D可知，35株小新月菱形藻突變株中有20株突變株巖藻黃素含量比出發(fā)株高，由此證明，硫酸鈰銨脅迫篩選小新月菱形藻突變株獲得高產(chǎn)巖藻黃素藻株切實可行。

由圖4可知，共有6株突變株的OD680、Fv/Fm、rETR值和巖藻黃素含量均高于出發(fā)株。經(jīng)過本輪篩選，從35株小新月菱形藻突變株中篩選出6株生長、光合活性和巖藻黃素含量均高于出發(fā)株的優(yōu)良突變株，將其編號為Z-A1、Z-A2、Z-A3、Z-A4、Z-A5、Z-A6。

圖4 小新月菱形藻B248第四輪篩選過程中出發(fā)株與突變株的OD680、Fv/Fm、rETR值和巖藻黃素含量

2.2.5 去除篩選劑后小新月菱形藻B248突變株與出發(fā)株的比較 將篩選得到的6株小新月菱形藻B248優(yōu)良突變株和出發(fā)株于f/2培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)(培養(yǎng)基內(nèi)無硫酸鈰銨)，7 d后測定藻株的Fv/Fm、rETR、單位體積干質(zhì)量及巖藻黃素含量。去除篩選劑后B248出發(fā)株與突變株Fv/Fm、rETR、單位體積干質(zhì)量和巖藻黃素含量的比較如圖5所示。圖5A1～D1表示出發(fā)株與突變株的Fv/Fm、rETR、單位體積干質(zhì)量和巖藻黃素含量的具體數(shù)值，圖5A2～D2表示突變株各參數(shù)與出發(fā)株相比提高的百分比，Z0代表出發(fā)株，從圖5中可以看出，6株小新月菱形藻突變株的Fv/Fm、rETR、單位體積干質(zhì)量及巖藻黃素含量均比出發(fā)株高，各突變株的測定參數(shù)之間也有差異。6株突變株的Fv/Fm、rETR、單位體積干質(zhì)量和巖藻黃素含量分別為0.577～0.686、15.0～19.0、0.55～0.71 g/L和1.01～1.53 mg/L，與出發(fā)株相比，分別增加了9.8%～30.4%、15.1%～45.7%、33.4%～71.5%和14.7%～73.1%。

2.3 小新月菱形藻B248優(yōu)良突變株的遺傳穩(wěn)定性研究

將篩選獲得的6株突變株按照10%的接種量接種于1 000 mL錐形瓶中傳代培養(yǎng)。7 d后再次按照10%的接種量接種于1 000 mL錐形瓶再次培養(yǎng)，經(jīng)過5次傳代后，對其Fv/Fm、rETR、單位體積干質(zhì)量及巖藻黃素含量進行測定。

小新月菱形藻B248突變株第1代和第5代的葉綠素熒光參數(shù)(Fv/Fm、rETR)、單位體積干質(zhì)量及巖藻黃素含量見表1。從表1中可以得出，與第1代相比，第5代葉綠素熒光參數(shù)(Fv/Fm、rETR)下降在2%以內(nèi)，所以6株優(yōu)良突變株的光合活性傳代較穩(wěn)定；與第1代相比，第5代Z-A2突變株的單位體積干質(zhì)量降低了10.3%，Z-A3和Z-A5突變株的巖藻黃素分別降低了12.9%和14.1%，而Z-A1、Z-A4和Z-A6的單位體積干質(zhì)量和巖藻黃素含量下降均不超過3%。因此，篩選得到的6株突變株中有3株遺傳穩(wěn)定性較高，分別是Z-A1、Z-A4和Z-A6。

(左圖中abcde表示方差分析差異程度，相同字母表明處理組間差異不顯著，不同字母表明處理組間差異顯著(P<0.05)。右圖縱坐標表示，與出發(fā)株相比，突變株各參數(shù)提高的百分比。In the leftFigure abcde indicate variance analysis in the difference degree, the same letters are no significantly diffe-rent from each other; the different letters are significantly different from each other (P<0.05). The ordinate in the rightFigure shows the percentage increase in various parameters of the mutant compared with the original.)

表1 小新月菱形藻B248突變株的遺傳穩(wěn)定性

3 討論

巖藻黃素作為海洋藻類特有的脂溶性類胡蘿卜素，具有抗腫瘤、抗氧化、減肥、降脂、降糖等生理功能[3-5]，發(fā)展前景廣闊。提高巖藻黃素含量除了利用傳統(tǒng)方法外，還可采用誘變育種方法。ARTP誘變育種作為一種新型誘變育種技術(shù)具有操作簡單、不污染環(huán)境、突變率高等優(yōu)點，在細菌、真菌及微藻育種等方面應用廣泛且誘變效果顯著[15-16, 18, 20-21]。在ARTP誘變研究中，為了得到大量有效的突變株，首先應該考慮獲取ARTP誘變的最佳條件。大量研究表明，不同的誘變條件對生物體的致死率不同，相同的誘變條件對不同的生物體致死率也不同。本實驗結(jié)果顯示，在ARTP輸入功率為120 W、處理距離為2 mm、氣流速度為10 L/min條件下，小新月菱形藻B248產(chǎn)生有利突變的最佳處理時間為16和20 s，其致死率大于90%；而Cao等[20]研究發(fā)現(xiàn)，有利于蛋白核小球藻油脂積累的ARTP最佳誘變條件為輸入功率120 W、處理距離2 mm、氣體流速10 SLM、誘變時間為40、50和60 s，其致死率高達95%以上；Fang等[27]的結(jié)果表明，有利于提高鈍頂螺旋藻生長速度和碳水化合物含量的最佳誘變條件為輸入功率100 W、處理距離2 mm、處理時間為5、10、40和60 s，其致死率超過90%；Liu等[16]的研究結(jié)果表明，促進寇氏隱甲藻胞外多糖積累的ARTP最佳誘變條件為輸入功率150 W、處理距離2 mm、氣體流速10 SLM、處理時間為70 s，其致死率超過90%。以上實驗結(jié)果表明，不同種類的微藻進行ARTP誘變的最佳條件是有差異的，這與微藻的自身修復機制有關(guān)，即當?shù)入x子體破壞微藻細胞壁、細胞膜及蛋白質(zhì)時，不同種類的微藻進行基因修復的能力不同，從而表現(xiàn)出對ARTP誘變的敏感性不同[18]。

在微藻育種過程中，通過ARTP誘變技術(shù)得到的突變株存在正向突變和負向突變，獲得優(yōu)質(zhì)目標突變株的關(guān)鍵是要建立一套簡單便捷、行之有效的高通量篩選方法，節(jié)省篩選時間，提高篩選效率。目前有較多優(yōu)良突變株高通量篩選方法的報道，F(xiàn)ang等[27]利用ARTP誘變技術(shù)對鈍項螺旋進行誘變，采用96孔板和酶標儀高通量篩選出2株優(yōu)良突變株，與出發(fā)株相比，2株突變株的碳水化合物分別增加了40.3%和78.0%。李青等[28]以若夫小球藻(Chlorellazofingensis)為研究對象，將其紫外誘變后通過流式細胞儀高通量篩選得到1株總脂產(chǎn)量比野生株高出50%的突變株。魏婷婷[29]在96孔板中加入藻液和尼羅紅染液，利用酶標儀對5 000株蛋白核小球藻突變株進行熒光強度的高通量篩選，最終獲得4株高含油脂的突變株。陳建楠等[30]采用尼羅紅染色法高通量篩選出富含油脂的球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)突變株。在本實驗中，將小新月菱形藻B248進行ARTP誘變后，依次進行固體平板第一輪篩選、96孔板OD680值第二輪篩選、20 mL試管OD680值、Fv/Fm和rETR值第三輪篩選、100 mL三角燒瓶OD680值、Fv/Fm、rETR值和巖藻黃素含量第四輪篩選，最終獲得了生長快、光合活性強、高產(chǎn)巖藻黃素、遺傳穩(wěn)定性強的優(yōu)良突變株。本實驗在篩選過程中使用全自動酶標儀檢測突變株的OD680值，大大節(jié)省了篩選時間，提高了篩選效率。使用快速、靈敏、對細胞無損傷的Water-PAM水樣葉綠素熒光儀檢測突變株的葉綠素熒光參數(shù)，實現(xiàn)了對各突變株光合活性的快速判斷。實驗結(jié)果表明，本文建立的方法是一套簡單便捷、行之有效的高通量篩選方法。

ARTP產(chǎn)生的濃度較高的中性高濃度活性粒子能夠改變細胞膜的通透性，從而進一步損傷DNA分子，從而使基因發(fā)生突變[31]。由于藻細胞內(nèi)存在DNA修復機制，所以在基因受到損傷時，藻細胞自身的修復系統(tǒng)會不同程度的自行修復，一些修復能力較差的藻細胞在短期內(nèi)無法修復至正常狀態(tài)，表現(xiàn)為藻細胞的生長速度會不同程度地降低，本實驗在第二輪篩選中有130株突變株的OD680值低于出發(fā)株證明了這一觀點；而一些修復能力較強的藻細胞不僅能修復至正常狀態(tài)且會在修復的過程中產(chǎn)生正向突變，這種突變可抵御不良環(huán)境，從而表現(xiàn)出較高的生長繁殖能力和光合活性[18, 25-26]，所以在第三輪硫酸鈰銨脅迫篩選中能夠從90株突變株中篩選出35株OD680值和葉綠素熒光參數(shù)(Fv/Fm、rETR)均高于出發(fā)株的優(yōu)良突變株。有研究表明，當篩選劑去除后，突變株合成活性物質(zhì)的含量往往會有所提高[32]，本實驗結(jié)果表明，去除篩選劑后，突變株的Fv/Fm、rETR、單位體積干質(zhì)量及巖藻黃素含量均有所提高，這與江勝滔[32]的研究結(jié)論一致。ARTP誘變后的突變株經(jīng)過四輪篩選獲得6株突變株，其Fv/Fm、rETR、單位體積干質(zhì)量及巖藻黃素含量分別比出發(fā)株增加了9.8%～30.4%、15.1%～45.7%、33.4%～71.5%和14.7%～73.1%，其中3株突變株(編號分別為Z-A1、Z-A4和Z-A6)具有較高的遺傳穩(wěn)定性，這說明ARTP誘變不僅能夠提高藻細胞的光合活性和生長繁殖能力，而且也能獲得高產(chǎn)巖藻黃素藻株，這一研究結(jié)果為高產(chǎn)巖藻黃素小新月菱形藻株系開發(fā)提供了技術(shù)路線和優(yōu)良株系。

4 結(jié)語

本文使用ARTP誘變技術(shù)對小新月菱形藻B248進行誘變，以0.6 mg/L的硫酸鈰銨作為篩選劑，成功篩選出6株優(yōu)良突變株，其Fv/Fm、rETR、單位體積干質(zhì)量和巖藻黃素含量分別為0.577～0.686、15.0～19.0、0.55～0.71 g/L和1.01～1.53 mg/L，與出發(fā)株相比，分別增加了9.8%～30.4%、15.1%～45.7%、33.4%～71.5%和14.7%～73.1%；遺傳穩(wěn)定性研究表明，6株優(yōu)良突變株中有3株遺傳穩(wěn)定性較高，編號分別為Z-A1、Z-A4和Z-A6。