桿菌狀鏈霉菌甲殼素酶基因的克隆表達及重組酶酶學性質(zhì)研究?

邢愛佳， 馬 磊， 薛長湖,2， 孫建安??， 毛相朝,2

(1. 中國海洋大學食品科學與工程學院， 山東 青島 266003； 2. 青島海洋科學與技術(shù)試點國家實驗室 海洋藥物與生物制品功能實驗室， 山東 青島 266237)

甲殼素是由β-(1,4)-N-乙酰氨基葡萄糖組成的線性多糖，在自然界中含量僅次于纖維素，廣泛存在于甲殼類動物和昆蟲的外骨骼以及植物、真菌和霉菌的細胞壁[1]。這種多糖聚合物結(jié)構(gòu)致密，存在大量分子間和分子內(nèi)作用力，導致不可溶性限制了其廣泛利用[2]。而降解產(chǎn)物甲殼寡糖具有較好的水溶性和生物活性，可用于食品、生物醫(yī)藥、化妝品、農(nóng)業(yè)和環(huán)保等[3]。目前甲殼素的降解方法有化學法和酶解法，其中酶解法是一種可循環(huán)的、生態(tài)友好的、高效制備降解產(chǎn)物的方法，且酶解的專一性可以控制產(chǎn)品的一致性[4]。

甲殼素酶在甲殼素生物降解過程中起著重要作用，在碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(Carbohydrate-active enzymes，CAZy)中，根據(jù)氨基酸序列同源性將甲殼素酶分為糖苷水解酶18家族(GH18)和糖苷水解酶19家族(GH19)[5]，其中GH18家族由一個高度保守的(β-α)8桶結(jié)構(gòu)組成[6]。根據(jù)水解機理，甲殼素酶可分為三大類：內(nèi)切甲殼素酶(EC 3.2.1.14)、外切甲殼素酶(EC 3.2.1.29)和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.30)[7]。內(nèi)切甲殼素酶的水解產(chǎn)物是甲殼二糖[N,N′-diacetylchitobiose，(GlcNAc)2]為主的甲殼寡糖[8]。相比之下，外切甲殼素酶可以逐步釋放產(chǎn)物(GlcNAc)2。N-乙酰氨基葡萄糖苷酶可以進一步裂解內(nèi)切甲殼素酶和外切甲殼素酶水解生成的甲殼寡糖，生成單體N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetyl-D-glucosamine，GlcNAc)[9]。已報道的甲殼素酶多數(shù)來自鏈霉菌，如Streptomyceslividans[10]、S.olivaceoviridis[11]和S.albolongus[12]，但來自桿菌狀鏈霉菌(Streptomycesbacillaris)的甲殼素酶尚未有研究報道，且其他來源的甲殼素酶的酶解產(chǎn)物多數(shù)不單一，這限制了單一聚合度甲殼寡糖的活性開發(fā)與研究。桿狀鏈霉菌是鏈霉菌家族的重要組成部分，來自桿菌狀鏈霉菌的甲殼素酶可能具有制備單一聚合度甲殼寡糖的能力。同時，研究來自桿狀鏈霉菌的甲殼素酶，可豐富甲殼素酶庫，拓展甲殼素酶的性質(zhì)研究。

本研究從S.bacillarisCGMCC4.1584基因組中克隆出一條編碼甲殼素酶的基因，構(gòu)建大腸桿菌工程菌進行異源表達，通過鎳離子親和層析獲得純酶，探究該甲殼素酶的酶學性質(zhì)和水解產(chǎn)物。本實驗在可控條件下可制備出高純度甲殼二糖，為其工業(yè)制備提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料與試劑 甲殼素購自上海源葉生物科技有限公司；快速微型質(zhì)粒提取試劑盒(TIANprep Mini Plasmid, DP103-02)購自北京天根生物技術(shù)有限公司；KOD高保真酶購自日本TOYOBO公司；無縫連接試劑盒(ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit, C115)購自諾唯贊生物科技有限公司；Ni-NTA樹脂購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA和蛋白質(zhì)標準分子量Marker購自索萊寶生物科技有限公司；硅膠板購自德國Merck公司；甲殼寡糖(聚合度2-6)購自青島博智匯力生物科技有限公司；其他試劑均為分析級試劑，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 菌株與培養(yǎng)基 桿菌狀鏈霉菌(S.bacillaris)購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(菌株編號：CGMCC4.1584)，其培養(yǎng)基成分為：0.4%酵母粉、1%麥芽粉、0.4%葡萄糖、1.5%瓊脂(培養(yǎng)基調(diào)至pH為7.3)。

大腸桿菌(Escherichiacoli) DH5α用于質(zhì)粒構(gòu)建(固體培養(yǎng)基)和目的基因質(zhì)粒擴增(液體培養(yǎng)基)。其培養(yǎng)基成分為：0.5%酵母粉，1%胰蛋白胨，1.5%瓊脂(固體培養(yǎng)基)和1% NaCl。

大腸桿菌BL21為目的基因表達菌株，其培養(yǎng)基成分為：0.5%酵母粉、1.0%蛋白胨、0.2% MgSO4、5.0%混合液(1 mmol/L Na2HPO4、1 mmol/L KH2PO4、0.5 mmol/L(NH4)2SO4)、0.5%甘油、0.05%葡萄糖、0.2% α-半乳糖。

1.1.3 儀器與設(shè)備 BCM-1000型超凈工作臺購自蘇州凈化設(shè)備有限公司；GI80TW型全自動高壓蒸汽滅菌鍋購自廈門致微儀器有限公司；Mastercycler nexus型PCR儀、5420型高速小型離心機、5804R型高速冷凍離心機購自德國艾本德股份公司；MULTISKAN FC型酶標儀購自美國賽默飛世爾科技有限公司；SCIENTZ-IID型超聲波細胞粉碎機購自寧波新芝生物科技股份有限公司；HH-4A型數(shù)顯恒溫水浴鍋購自常州國華儀器制造有限公司；SPX型生化培養(yǎng)箱購自新江南儀器有限公司；DYY-6C型電泳儀購自北京市六一生物科技有限公司；LC-20AT型高效液相色譜儀購自日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 目的基因的生物信息學分析 利用SnapGene軟件對目的基因進行分析，分析其ORF長度和基因編碼理論蛋白量，通過NCBI和CAZy數(shù)據(jù)庫找到與SbChiAJ143相似的基因序列，并用MEGA6.0構(gòu)建進化樹。采用SMART軟件進行結(jié)構(gòu)域分析。利用ClustalW對目的蛋白序列與參考序列進行比對，并通過ESPript 3.0完成保守氨基酸分析。利用SWISS model和Pymol軟件預(yù)測并查看SbChiAJ143的碳水化合物結(jié)合模塊和催化結(jié)構(gòu)域的三維模型。

1.2.2 目的基因的克隆與重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以S.bacillarisCGMCC4.1584基因組為模板，設(shè)計上游引物(5’-GGCCGCAAGCTTCGGCAGGCTGCGGAC-3’)和下游引物(5’-CAAATGGGTCGCGGATCCATGGTGCAACGCTCCG-3’)利用KOD高保真酶克隆目的片段。PCR反應(yīng)的程序如下：預(yù)變性95 ℃ 10 min；30個擴增循環(huán)(98 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，68 ℃ 3 min)；最后延伸68 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離并對目的片段進行膠回收，與pET-28a(+)載體進行無縫連接，構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞大腸桿菌DH5α，涂布在抗性平板進行篩選并進行菌落PCR陽性克隆驗證，驗證成功后進一步測序鑒定。

1.2.3 重組蛋白的表達與純化 將含有目的基因的重組質(zhì)粒采用熱激法轉(zhuǎn)化到表達菌株大腸桿菌BL21(DE3)中，在20 ℃，220 r/min恒溫搖床培養(yǎng)48 h。發(fā)酵結(jié)束后，4 ℃,8 000g離心10 min，收集菌體。與裂解緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，pH=7.4)混合，超聲裂解后，再次4 ℃，8 000g離心20 min，收集的上清即為粗酶液。

粗酶液過0.45 μm濾膜后與Ni-NTA純化樹脂填料充分混合，在Ni-NTA柱中加入平衡緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑)以提高特異性結(jié)合，然后分別用含20、40、60、100、200和500 mmol/L咪唑、50 mmol/L Tris-HCl和500 mmol/L NaCl梯度的咪唑溶液清洗柱子。用考馬斯亮藍R-250染色的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測目的蛋白的純度。

1.2.4 蛋白質(zhì)定量與酶活測定 配制不同濃度的牛血清白蛋白(BSA)，用Bradford法定量，繪制蛋白定量的標準曲線。純化出的蛋白用10 kDa超濾管置換出咪唑溶液，根據(jù)標準曲線對目的蛋白溶液進行定量。單位酶活性(U)被定義為在特定條件下每分鐘生成1 μm還原糖所需要的酶量。SbChiAJ143具體反應(yīng)條件為10 μL純酶加到190 μL 1.0%(w/v)膠質(zhì)甲殼素(pH=6.0的磷酸鹽緩沖)，在55 ℃反應(yīng)30 min，然后在沸水浴中滅酶10 min，冷卻到室溫。采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測定反應(yīng)生成的還原糖含量。根據(jù)540 nm處測定不同濃度的N-乙酰氨基葡萄糖與DNS反應(yīng)吸光度繪制的還原糖定量標準曲線，計算出生成還原糖的量從而得出酶活。

1.2.5 SbChiAJ143酶學性質(zhì)表征

1.2.5.1 最適pH和pH穩(wěn)定性 為確定酶的最適pH，各取10 μL純酶加到190 μL不同pH緩沖溶液制備的1.0%(w/v)膠質(zhì)甲殼素中，在55 ℃下反應(yīng)30 min，利用DNS法測定純酶的活性。不同pH緩沖液(50 mmol/L)分別為檸檬酸緩沖液(pH為3.0～6.0)、磷酸鹽緩沖液(pH為6.0～8.0)、Tris-HCl緩沖液(pH為7.0～9.0)和甘氨酸-NaOH緩沖液(pH為9.0～10.0)。

pH穩(wěn)定性的測定方法：在上述緩沖液中加入等量的純酶，在25 ℃下放置不同時間間隔(0、12、24、36、48、60和72 h)后加入相應(yīng)的1.0%(w/v)膠質(zhì)甲殼素底物，55 ℃反應(yīng)30 min，采用DNS法測定酶的殘余活性。

1.2.5.2 最適溫度和溫度穩(wěn)定性 各取10 μL純酶加入190 μL 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH=6.0)配制的1.0%(w/v)膠質(zhì)甲殼素中，在溫度25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75和80 ℃下，反應(yīng)30 min，DNS法測定酶的殘余活性，從而確定最適反應(yīng)溫度。

熱穩(wěn)定性測定是將等量的酶置于溫度30、35、40、45、50、55和60 ℃下分別孵育0、30、60、90、120、150和180 min，加到1.0%(w/v)膠質(zhì)甲殼素(pH=6.0的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液)中，55 ℃反應(yīng)30 min，測定酶的殘余活性。所有實驗重復(fù)3次。

1.2.5.3 金屬離子對酶活的影響 不同金屬離子Na+(NaCl)、K+(KCl)、Mg2+(MgCl2)、Ba2+(BaCl2)、Zn2+(ZnSO4)、Ni2+(NiSO4)、Ca2+(CaCl2)、Fe3+(FeCl3)、Mn2+(MnCl2)、Cu2+(CuCl2)、Co2+(CoCl2)、十二烷基硫酸鈉(SDS)及Na2EDTA中加純酶至終濃度為1.4和14 mmol/L。將上述試劑作用的酶加到1.0%(w/v)膠質(zhì)甲殼素(pH=6.0的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液)中，55 ℃反應(yīng)30 min，對照組為不添加上述試劑的反應(yīng)體系，探究不同濃度、不同金屬離子條件下酶活的變化。

1.2.5.4 SbChiAJ143酶促反應(yīng)動力學參數(shù)測定 用pH=6.0的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液配制濃度分別為0.1、0.5、1.0、5、10、15、20、25、30、40、50、60、80和100 mg/mL的膠質(zhì)甲殼素，取10 μL純酶與190 μL上述不同濃度的底物混合，55 ℃下反應(yīng)5 min，終止反應(yīng)，測定OD540nm。利用米氏方程將所得數(shù)據(jù)進行非線性回歸擬合，計算Km和Vmax的值。

1.2.6 SbChiAJ143酶解產(chǎn)物的高效液相分析 SbChiAJ143與1.0%(w/v)膠質(zhì)甲殼素和甲殼寡糖(DP2-6)在55 ℃反應(yīng)0 min、2 min、15 min、30 min、60 min和24 h。取20 μL樣本注入到高效液相色譜系統(tǒng)(安捷倫1290，德國)，分析柱為Sugar Pak I色譜柱(6.5 mm×300 mm，10 μm)，流動相為50 mg/L乙二胺四乙酸鈣二鈉(EDTA-CaNa2)，流速為0.5 mL/min，柱溫為75 ℃，檢測器為示差檢測器。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的生物信息學分析

在桿菌狀鏈霉菌(S.bacillaris)基因組中發(fā)現(xiàn)一段甲殼素酶編碼基因序列，命名為SbChiAJ143(GenBank序列號CP029378.1)，全長1 734 bp， 編碼578個氨基酸，預(yù)測相對分子質(zhì)量為59.2 kDa，等電點為8.66。通過氨基酸序列比對，SbChiAJ143與來自GH18家族灰色鏈霉菌的甲殼素酶(S.griseus，BAB86375.1)呈現(xiàn)最高相似度(89.12%)，與來自同一家族的淺青紫鏈霉菌的甲殼素酶(S.lividans，BAA02918.1)的相似度次之(73.10%)。根據(jù)Neighbor-Joining進化樹分析(見圖1)，SbChiAJ143屬于GH18家族，與蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)的外切甲殼素酶(AAP10651.1)和橄欖綠鏈霉菌(S.olivaceoviridis)的外切甲殼素酶(CAA50398.1)有密切的親緣關(guān)系。

圖1 SbChiAJ143與GH18其他甲殼素酶 氨基酸序列的進化樹分析

基于SMART對蛋白結(jié)構(gòu)域的鑒定和注釋，預(yù)測SbChiAJ143中存在3個主要結(jié)構(gòu)域(見圖2a)：N端碳水化合物結(jié)合模塊(CBM49，47-168)，纖維連接蛋白型結(jié)構(gòu)域(FN3，193-263)，C端GH18催化結(jié)構(gòu)域(Glyco18，289-560)。在結(jié)合域CBM49中發(fā)現(xiàn)了保守的芳香族氨基酸，包括色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)和苯丙氨酸(Phe，F(xiàn))(見圖2b)，在其兩側(cè)分布帶負電的殘基(Glu-56，Asp-91，Asn-92，Gln-97，Asn-104，Gln-114，Asp-129)形成疏水的溝槽結(jié)構(gòu)，以促進與甲殼素底物結(jié)合，這樣的結(jié)構(gòu)更有利于該甲殼素酶作用于疏松結(jié)構(gòu)的膠質(zhì)甲殼素，而不是結(jié)構(gòu)致密的甲殼素粉末(見圖2c)[13-15]。緊挨著結(jié)合域的是纖維連接蛋白型結(jié)構(gòu)域FN3，該結(jié)構(gòu)域存在保守的芳香族氨基酸(Trp-213，Tyr-222，Tyr-225，Tyr-250)，在細菌甲殼素酶、纖維素酶和淀粉酶中存在同樣的結(jié)構(gòu)域，這可能與底物附著有關(guān)[16-19]。保守的谷氨酸(Glu，E)和天冬氨酸(Asp，D)在催化結(jié)構(gòu)域中是保守的，它們是參與甲殼素酶酸堿水解機理的關(guān)鍵氨基酸[20]。如圖2d所示，該催化結(jié)構(gòu)域帶有隧道狀裂隙的(β-α)8桶結(jié)構(gòu)，這是GH-18甲殼素酶典型特征[21-22]。

(a： SMART結(jié)構(gòu)域分析； b： 多序列比對結(jié)果； c： 結(jié)合域同源建模結(jié)構(gòu)； d： 催化結(jié)構(gòu)域同源建模結(jié)構(gòu)。a: Conserved domain analysis of SMART; b: Results of multiple sequence alignment; c: Homology modeling structure of binding domain; d: Homology modeling structure of catalytic domain.)

2.2 SbChiAJ143的表達與純化

重組質(zhì)粒pET28a-SbChiAJ143在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達。如圖3所示，SDS-PAGE顯示純化的SbChiAJ143為單一條帶，其大小約為59.2 kDa，高于一些鏈霉菌的甲殼素酶，如S.albolongusSaChiA4(47 kDa)[12]，Streptomysessp. CS495(41 kDa)[23]和S.roseolusChi40(40 kDa)[24]。以膠質(zhì)甲殼素為底物，純化酶的比酶活為5.29 U/mg，純化倍數(shù)為11，其粗酶的比酶活為0.48 U/mg。與來自S.olivaceoviridis(酶解產(chǎn)物相對單一)的外切甲殼素酶純化酶的比酶活(3.50 U/mg)相比，在純化倍數(shù)相當情況下[11]，桿菌狀鏈霉菌的甲殼素酶的純化酶具有較高比酶活。

(M： 蛋白的標準分子量；泳道1： 粗酶液；泳道2： 純酶液。M: Molecular mass marker of proteins; Lane 1: Crude enzyme liquid; Lane 2: Purified enzyme liquid.)

2.3 SbChiAJ143的酶學性質(zhì)測定

2.3.1最適pH和pH對酶活穩(wěn)定性的影響 如圖4a所示，SbChiAJ143在pH=6.0的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液中相對酶活最高，在pH=7.0的Tris-HCl中相對酶活超過80%，與S.chilikensis堿性甲殼素酶最適pH相似[25]。pH為5.0～9.0的相對酶活大于60%，pH=10.0的相對酶活高于pH=3.0，說明該酶在弱酸性和堿性環(huán)境中具有較高活性。最適pH為6.0接近中性，更適合工業(yè)生產(chǎn)。在pH穩(wěn)定性方面，在pH為3.0～10.0范圍內(nèi)，72 h后相對酶活仍保持在50%以上(見圖4b)，表明在廣泛的pH范圍內(nèi)SbChiAJ143是穩(wěn)定的，與報道的S.albolongus中甲殼素酶一致[12]，優(yōu)于其他細菌和真菌產(chǎn)生的甲殼素酶，如Sanguibacterantarcticus[26]，Stenotrophomonasmaltophilia[27]和S.anulatus[28]。

2.3.2 最適溫度和溫度對酶活穩(wěn)定性的影響 SbChiAJ143在55 ℃時相對酶活最高(見圖4c)，與來自S.albolongus菌株的甲殼素酶SaChiA4[12]和Paenibacillusbarengoltzii菌株的甲殼素酶PbChi70相當[29]，具有較高的最適反應(yīng)溫度，可防止反應(yīng)過程中其他微生物的污染，保障反應(yīng)過程的安全性。當溫度高于55 ℃時，甲殼素酶SbChiAJ143的活性迅速顯著下降，達到65 ℃時，其活性不到最高活性的一半。在45～60 ℃時，SbChiAJ143的殘余酶活相對較高。在50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH=6.0)中將SbChiAJ143于30～45 ℃溫度范圍孵育180 min，殘留酶活仍保留70%以上(見圖4d)。

2.3.3 金屬離子對酶活的影響 如表1所示，Ca2+和Ba2+對SbChiAJ143催化活性有輕微的促進作用，且促進效果隨著濃度增大而略增強。在高濃度(5 mmol/L)時，Mg2+呈現(xiàn)輕微的激活作用。大部分金屬離子在低濃度和高濃度下都對該酶有一定的抑制作用，如Zn2+、Fe3+、Mn2+、Cu2+、Co2+、Ni2+。其中高濃度的Zn2+、Fe3+、Cu2+、Co2+抑制作用更明顯。添加低濃度(1 mmol/L)和高濃度(5 mmol/L)表面活性劑SDS，酶活下降至未添加時酶活的57.6%和16.9%， 說明表面活性劑可以明顯抑制該酶的活性。1和5 mmol/L的Na2EDTA對該酶有輕微抑制作用，且抑制效果相當，說明SbChiAJ143不是金屬依賴型酶。

(a： 最適pH； pH 3.0～6.0： 檸檬酸鹽緩沖液； pH 6.0～8.0： 磷酸鹽緩沖液； pH 7.0～9.0： Tris-HCl緩沖液； pH 9.0～10.0： 甘氨酸-NaOH緩沖液； b： pH穩(wěn)定性； c： 最適溫度； d： 溫度穩(wěn)定性。a: The optimum pH; pH 3.0～6.0: Citrate buffer; pH 6.0～8.0: Phosphate buffer; pH 7.0～9.0: Tris-HCl buffer; pH 9.0～10.0: Glycline-NaOH buffer; b: The pH stability; c: The optimum temperature; d: The temperature stability.)

表1 金屬離子對酶活的影響Table 1 Effect of metal ions on enzymatic activity

2.3.4 酶促反應(yīng)動力學參數(shù) 利用米氏方程非線性擬合得到該酶的Vmax值為17.14 μmol/(min·mg)，Km值為3.54 mg/mL。與來源于PaenibacilluspasadenensisCS0611[30]和Streptomycessp.[31]的甲殼素酶的Km值相比(Km值分別為4.41和6.74 mg/mL)，該酶的Km值較小，對底物膠質(zhì)甲殼素的親和力較好，但比來源于Streptomycessp. CS495[23]的甲殼素酶的Km值略大(Km值為1.34 mg/mL)。

2.4 SbChiAJ143水解產(chǎn)物的高效液相分析

采用高效液相色譜法測定了甲殼寡糖(DP 2-6)的水解過程。(GlcNAc)2未被降解，(GlcNAc)3被水解成(GlcNAc)2和GlcNAc；反應(yīng)2 min后，(GlcNAc)4轉(zhuǎn)化為(GlcNAc)2，伴以少量(GlcNAc)3和GlcNAc；(GlcNAc)5降解為(GlcNAc)3和(GlcNAc)2，(GlcNAc)6生成(GlcNAc)4、(GlcNAc)2和微量(GlcNAc)3，最終降解為(GlcNAc)2和極少量的GlcNAc(見圖5)。上述結(jié)果表明，SbChiAJ143甲殼素酶能識別的最小單位為(GlcNAc)3，這與目前有關(guān)甲殼素酶產(chǎn)生(GlcNAc)2的研究結(jié)果一致。

(a： (GlcNAc)2水解產(chǎn)物的HPLC分析； b： (GlcNAc)3水解產(chǎn)物的HPLC分析； c： (GlcNAc)4水解產(chǎn)物的HPLC分析； d： (GlcNAc)5水解產(chǎn)物的HPLC分析； e： (GlcNAc)6水解產(chǎn)物的HPLC分析。甲殼寡糖標準品： N1: N-乙酰氨基葡萄糖； N2: 甲殼二糖； N3: 甲殼三糖； N4: 甲殼四糖； N5: 甲殼五糖； N6: 甲殼六糖。a: HPLC analysis of the hydrolysis products of (GlcNAc)2; b: HPLC analysis of the hydrolysis products of (GlcNAc)3; c: HPLC analysis of the hydrolysis products of (GlcNAc)4; d: HPLC analysis of the hydrolysis products of (GlcNAc)5; e: HPLC analysis of the hydrolysis products of (GlcNAc)6. Standards: N1: GlcNAc; N2: (GlcNAc)2; N3: (GlcNAc)3; N4: (GlcNAc)4; N5: (GlcNAc)5; N6: (GlcNAc)6.)

SbChiAJ143酶解過量的膠質(zhì)甲殼素結(jié)果如圖6所示，水解產(chǎn)物為(GlcNAc)2，伴隨著少量的GlcNAc。產(chǎn)物定量結(jié)果表明在酶解2 h內(nèi)產(chǎn)物為單一的(GlcNAc)2，從3 h開始出現(xiàn)少量GlcNAc，且(GlcNAc)2隨著反應(yīng)時間的延長而增加，而GlcNAc濃度基本不變。在酶解6 h內(nèi)，(GlcNAc)2的含量有明顯的上升趨勢，然后上升不再顯著。反應(yīng)24 h后，膠質(zhì)甲殼素產(chǎn)(GlcNAc)2和GlcNAc含量分別達到1.75和0.40 mg/mL。在整個過程中產(chǎn)生的GlcNAc的量非常小，幾乎是恒定的?？赡艽嗣竷?yōu)先水解膠質(zhì)甲殼素為偶數(shù)甲殼寡糖，然后迅速切割偶數(shù)甲殼寡糖為(GlcNAc)2。這對于甲殼素酶的酶切機理深入研究具有一定的參考價值。(GlcNAc)2是大多數(shù)GH18家族甲殼素酶的主要產(chǎn)物，并存在一定量的GlcNAc干擾純度[32]。但SbChiAJ143水解膠質(zhì)甲殼素時，GlcNAc的產(chǎn)量并沒有隨水解時間的延長而增加，這有利于單一(GlcNAc)2的工業(yè)化生產(chǎn)，也為快速生產(chǎn)高純度的(GlcNAc)2提供了重要參考。

(a： 膠質(zhì)甲殼素水解產(chǎn)物的HPLC分析。甲殼寡糖標準品： N1： N-乙酰氨基葡萄糖； N2： 甲殼二糖； N3： 甲殼三糖； N4： 甲殼四糖； N5： 甲殼五糖； N6： 甲殼六糖。b： 膠質(zhì)甲殼素水解產(chǎn)物的定量分析。a: HPLC analysis of the hydrolysis products of colloidal chitin. Standards: N1: GlcNAc; N2: (GlcNAc)2; N3: (GlcNAc)3; N4: (GlcNAc)4; N5： (GlcNAc)5; N6： (GlcNAc)6. b: Quantitative analysis of the hydrolysis products of colloidal chitin.)

3 結(jié)語

本研究成功克隆和表達了新的甲殼素酶SbChiAJ143，進化樹分析和多序列比對表明該酶屬于GH18家族。在pH=6.0的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液中55 ℃時該酶的活性最優(yōu)，具有廣泛的pH穩(wěn)定性。大部分金屬離子和SDS都可抑制該酶的活性，Ca2+和Ba2+對酶活有輕微的促進作用，該酶屬于非金屬依賴型酶。該酶的Km值為3.54 mg/mL，Vmax值為17.14 μmol/(min·mg)，對底物膠質(zhì)甲殼素的親和力較好。該酶具有生產(chǎn)單一(GlcNAc)2的能力，如果能夠通過基因定向進化或基因突變提高該酶的活性,該酶在工業(yè)生產(chǎn)中將更具產(chǎn)業(yè)價值。