彩葉樹種藍(lán)果樹嫩芽組培快繁技術(shù)研究

王 松，楊 黨，陳露茜，李鈞敏

（1.臺州林業(yè)技術(shù)推廣總站，浙江 臺州 318000；2.臺州學(xué)院 浙江省植物進(jìn)化生態(tài)學(xué)與保護(hù)重點實驗室，浙江 臺州 318000）

0 引言

藍(lán)果樹（Nyssa sinensisOliv.），浙江仙居當(dāng)?shù)赜址Q“山甜李”，為藍(lán)果樹科，屬落葉喬木，高可達(dá)20余m，分布于中國長江流域及以南各地，常生于海拔300～1700 m的山谷或溪邊潮濕混交林中［1-2］。藍(lán)果樹樹干通直，樹冠呈寶塔形，樹葉在春天萌發(fā)及深秋時均為紅色，果實成熟后是深藍(lán)色，是優(yōu)良的鄉(xiāng)土季節(jié)性彩葉樹種［3］，具有較大的園林應(yīng)用價值。但目前藍(lán)果樹現(xiàn)有資源以天然林為主，數(shù)量較少，且大多零星分布于深山或自然保護(hù)區(qū)中，而有關(guān)藍(lán)果樹人工繁殖和栽培的成功經(jīng)驗相對較少［3］；藍(lán)果樹人工栽培的繁殖方式主要是種子繁殖［4］，而藍(lán)果樹種殼堅硬，種子發(fā)芽率低（25%～40%）［5-6］，這大大限制了此樹種的推廣與應(yīng)用。

組織培養(yǎng)是藍(lán)果樹實現(xiàn)快速繁殖和工廠化育苗的重要途徑之一。近10年未見有關(guān)于藍(lán)果樹組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)的系統(tǒng)研究報道，早期王春榮等［4］以莖段為外植體進(jìn)行了相關(guān)研究，提出以9月中旬取半木質(zhì)化莖段進(jìn)行藍(lán)果樹組織培養(yǎng)較好，萌芽率和保存率較高，其余接種時期的嫩莖尖、嫩莖段及半木質(zhì)化莖段材料污染率較高，萌芽率較低。本文以春冬季節(jié)藍(lán)果樹嫩芽為外植體，以期解決組培過程中取材受限及污染率等問題，并優(yōu)化藍(lán)果樹的組織培養(yǎng)和快繁技術(shù)體系，為實現(xiàn)藍(lán)果樹工廠化育苗提供必要的技術(shù)支持。

1 材料與方法

藍(lán)果樹的組培及擴(kuò)繁實驗過程如圖1所示。

1.1 材料

實驗用藍(lán)果樹枝條取自仙居縣廣度鄉(xiāng)西角村海拔800～900 m的針闊葉混交林內(nèi)（地理坐標(biāo)：28.95°N，120.76°E）。將剪刀用75%乙醇消毒后，剪取生長健壯無病害的一年生以上枝條，帶回實驗室備用。

1.2 方法

1.2.1 外植體的選擇

2020年12月在仙居采樣剪取藍(lán)果樹枝條，一部分以越冬芽作為外植體（I），一部分將枝條插在蒸餾水中待越冬芽萌發(fā)后作為外植體（Ⅱ）；2021年3月在仙居采樣后將枝條浸泡在濃度為100 mg/L的ABT生根粉溶液中水培，7 d后，選取新長出的嫩枝芽作為外植體（Ⅲ），如圖1（a）所示；2021年4月在仙居采集的藍(lán)果樹枝條上長的野外嫩芽直接作為外植體（Ⅳ）。

圖1 藍(lán)果樹的組培及擴(kuò)繁

1.2.2 培養(yǎng)基的制備

以MS加入7 g/L的瓊脂和30 g/L的蔗糖為基本培養(yǎng)基，與不同種類及濃度的植物激素制備培養(yǎng)基；1/2WPM和1/2 MS生根培養(yǎng)基分別以1/2WPM、1/2MS加入7 g/L的瓊脂和30 g/L的蔗糖為基礎(chǔ)培養(yǎng)基；以上培養(yǎng)基調(diào)pH值至5.8～6.2。

1.2.3 外植體消毒及培養(yǎng)

用自來水沖洗尼龍網(wǎng)袋中的外植體2 h，然后在超凈工作臺中用75%乙醇消毒10 s，再用0.1% HgCl2處理5 min，用無菌水漂洗5次，每次3 min，置于無菌濾紙上，吸干表面水分。越冬芽剝?nèi)[片，萌發(fā)的越冬芽剝?nèi)[片及幼葉，露出葉原基，分別接到含MS無激素培養(yǎng)基的組培瓶中；實驗室水培嫩枝芽及野外嫩芽均切除幼葉，芽分別接到含MS無激素培養(yǎng)基的組培瓶中。以上均置于（23±1）℃組培室中，每日光照14 h，光照強(qiáng)度2000 lux。每天記錄污染率，連續(xù)記錄5 d，污染率=（污染個數(shù)/消毒外植體總數(shù)）×100%；將無污染的芽轉(zhuǎn)接到外植體啟動培養(yǎng)基中，配方為：MS+0.3 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA，30 d后統(tǒng)計不同外植體類型的成活率。死亡率=（死亡個數(shù)/消毒外植體總數(shù)）×100%；成活率=（成活個數(shù)/消毒外植體總數(shù)）×100%。

1.2.4 芽的繼代增殖培養(yǎng)

將長勢良好的芽轉(zhuǎn)接到不同激素濃度的繼代增殖培養(yǎng)基中：①M(fèi)S+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA；②MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；③MS+0.5 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA；④MS+1 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA；⑤MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；⑥MS+1 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA。接種后每隔30 d繼代1次，更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)50 d左右觀察芽的生長情況。統(tǒng)計增殖系數(shù)，增殖系數(shù)=出芽數(shù)/原有芽數(shù)。

1.2.5 誘導(dǎo)生根

將繼代不同次數(shù)的長度3～4 cm且長勢較好的芽分別接到以下培養(yǎng)基中：①1/2WPM；②1/2WPM+0.1 mg/L NAA；③1/2WPM+0.5 mg/L NAA；④1/2WPM+1 mg/L NAA；⑤1/2WPM+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L IBA，培養(yǎng)40 d左右統(tǒng)計生根數(shù)量、計算生根率；生根率=（生根個數(shù)/培養(yǎng)芽苗總數(shù)）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體對成活率的影響

選取不同外植體類型進(jìn)行消毒處理后，接種于培養(yǎng)基上，結(jié)果如表1所示。從表中可以看出，以藍(lán)果樹越冬芽作為外殖體（I）和野外直接采的嫩芽外植體（Ⅳ）的污染率較高，分別為75%和60%，成活率分別為10%和20%；水培后萌發(fā)的越冬芽（Ⅱ）污染率較低，為20%，但成活率偏低，為55%；3月份水培長出的嫩枝芽（Ⅲ）污染率為0，成活率高達(dá)95%。結(jié)果表明：3月份水培長出的嫩枝芽為藍(lán)果樹嫩芽組培的最佳外植體。

表1 藍(lán)果樹不同類型外植體對成活率的影響

2.2 不同植物激素配比對芽增殖的影響

將長勢良好的芽轉(zhuǎn)接到不同激素濃度的繼代增殖培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂素6-BA和生長素NAA濃度比例會影響芽的生長，結(jié)果如表2所示。比例過高或過低會導(dǎo)致增殖少，生長慢，葉片發(fā)黃，且會出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA為最佳繼代增殖培養(yǎng)基，比例為10：1，增殖系數(shù)為6.2，芽生長狀況較好，如圖1（b）所示。

表2 不同激素配比對藍(lán)果樹芽增殖誘導(dǎo)的影響

2.3 不同植物激素配比對根系生長的影響

切取不同繼代次數(shù)且生長狀況良好的藍(lán)果樹不定芽接種至生根培養(yǎng)基培養(yǎng)，如圖1（c）所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)繼代次數(shù)為1～3次的不定芽生根率均為0，無法成功誘導(dǎo)生根；繼代次數(shù)為4次的不定芽成功誘導(dǎo)生根，不同植物激素配比對根系誘導(dǎo)的結(jié)果如表3所示。從表中可以看出，生長素（NAA）在低濃度時可促進(jìn)根的生長，高濃度時會抑制苗的生長，加入IBA提高了生根數(shù)和根的質(zhì)量。在本研究配方中，1/2WPM+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L IBA為最佳生根培養(yǎng)基，生根率可達(dá)100%，根健壯，長勢較好，如圖1（d）所示。

表3 不同植物激素配比對根系生長的影響

3 討論與結(jié)論

為解決藍(lán)果樹外植體污染率高、取材時間受限等問題，本文在研究中選取春冬不同時期的嫩芽作為外植體，實驗結(jié)果表明：3月份水培長出的嫩枝芽為藍(lán)果樹嫩芽組培的最佳外植體，污染率低且成活率高；越冬芽和4月份直接采集的嫩芽污染率較高，可能是因為野外環(huán)境中外植體表面及內(nèi)部受到各類細(xì)菌和真菌的污染較多，加大了外植體滅菌的難度［7］。

在藍(lán)果樹繼代繁殖過程中，王春榮等［8］發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂素的類似物與生長素的類似物的配比以5～15為宜，增殖率較高，生長正常。本研究也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂素6-BA和生長素NAA濃度比例為10:1時，增殖系數(shù)較高，生長良好。同時發(fā)現(xiàn)，要經(jīng)過繼代培養(yǎng)4代以上，藍(lán)果樹才能成功誘導(dǎo)生根，表明繼代次數(shù)對藍(lán)果樹生根影響較大。有研究認(rèn)為：處于成年期的組培苗生根困難，而處于經(jīng)過多代培養(yǎng)后從成年期狀態(tài)回轉(zhuǎn)到童年期狀態(tài)的組培苗，生根相對要容易得多［9］。此外，在生根培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，生長素在低濃度時可促進(jìn)根的生長，在高濃度時卻抑制了苗的生長，使用NAA與IBA的復(fù)合激素促進(jìn)了藍(lán)果樹生根，這也和胡剛等［10］的研究結(jié)果一致。