響應(yīng)面法分析藥用植物傷力草浸提液對(duì)大腸桿菌抑制效果

徐亞軍，趙龍飛 *，符 可，望子龍，秦丁梅，王子秋，許明晨，袁菲菲

（1.商丘師范學(xué)院 生物與食品學(xué)院 河南省特色微生物資源開(kāi)發(fā)與應(yīng)用工程研究中心，河南 商丘 476000；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122）

傷力草，又名生力草，是河南東部常見(jiàn)的一類多年生草本植物，根生，莖光滑，葉片兩面無(wú)毛，邊緣鋸齒，對(duì)生，葉柄長(zhǎng)4～8 cm?；ㄗ仙虬咨?，總狀花序，全株有香味。主要生長(zhǎng)在河南東部，安徽亳州等地也有生長(zhǎng)。河南東部及附近地區(qū)百姓常在端午節(jié)時(shí)用其治療身體虛虧、過(guò)度勞累，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中關(guān)于此植物的報(bào)道相對(duì)較少，其藥理作用和藥用價(jià)值也鮮有報(bào)道。王利等[1]研究傷力草水煎劑對(duì)小白鼠免疫機(jī)能的影響的實(shí)驗(yàn)表明，傷力草水提液可提高小鼠脾臟和胸腺指數(shù)，有效提高小鼠的非特異性免疫功能。王利等[2]研究傷力草水煎液對(duì)肉仔雞部分血清生化指標(biāo)的影響發(fā)現(xiàn)，傷力草水煎液可有效降低血清總膽固醇、三酰甘油、血清葡萄糖、低密度脂蛋白的含量，顯著提高血清高密度脂蛋白的含量。秦彩玲等[3]研究傷力草對(duì)動(dòng)物免疫性能等方面影響，試驗(yàn)結(jié)果表明，添加適量的傷力草提取物可以提高產(chǎn)蛋雞后期的產(chǎn)蛋性能、蛋品質(zhì)和免疫功能，飼料里添加300 mg/kg傷力草提取物效果較好。

生物抑菌劑是天然生物中提取能抑制微生物生長(zhǎng)的一類活性成分，一般來(lái)自動(dòng)、植物提取物或微生物菌絲的物質(zhì)，能有效抗菌防腐，與化學(xué)抑菌劑相比，生物抑菌劑更安全、更穩(wěn)定。楊慧軒等[4]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌憑借其天然的來(lái)源、提供可持續(xù)的保護(hù)作用，成為傳統(tǒng)抑菌劑良好的替代品。隨著國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)天然植物研究的不斷深入，其化學(xué)組成、活性成分、生理功能、結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系逐漸被發(fā)現(xiàn)并廣泛應(yīng)用于功能性食品和醫(yī)藥領(lǐng)域[5]。天然植物資源中主要化學(xué)成分有揮發(fā)油、多糖、酚類、生物堿、苷類、有機(jī)酸等，大量研究[6]表明，這些化學(xué)成分大多具有抑菌、增強(qiáng)免疫力、抗氧化等生理活性。張?zhí)砭盏萚7]研究表明，植物中抑菌活性物質(zhì)在植物各組織（如種子、花、葉、莖、根、果等）均存在，可直接或提取后用于制備能夠殺死或抑制病原生物的植物源抗菌消毒制劑，防治植物病害。植物源抗菌消毒劑的活性成分可有效降低環(huán)境污染[8-9]。因此，利用植物資源開(kāi)發(fā)植物性抗菌物質(zhì)成為現(xiàn)代農(nóng)藥研究的重要方向[10]。

大腸桿菌（Escherichia coli）在自然環(huán)境中普遍存在，但致病性大腸桿菌會(huì)使人類及動(dòng)物染病[11]。大腸桿菌O157還會(huì)造成土壤和水資源污染，作為土壤中最為常見(jiàn)的致病菌，大腸桿菌O157主要通過(guò)糞肥進(jìn)入土壤，且研究發(fā)現(xiàn)，土壤中的致病性大腸桿菌O157還會(huì)向地下轉(zhuǎn)移，大腸桿菌便會(huì)通過(guò)土壤上種植的作物進(jìn)入人類食物鏈，引發(fā)大規(guī)模的食物和水源污染[12]。因此，使用經(jīng)過(guò)綠色處理的糞肥和保護(hù)灌溉水源對(duì)生態(tài)環(huán)境保護(hù)至關(guān)重要。為此，研究傷力草提取液對(duì)大腸桿菌的抑制作用，對(duì)有效控制大腸桿菌超標(biāo)造成的食品污染及環(huán)境污染，研發(fā)污染食品的病原菌抑制劑或防腐劑具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌（Escherichia coli）：由國(guó)家自然科學(xué)基金（U1204301）課題組提供；傷力草：采自商丘市梁園區(qū)傷力草種植基地（E115°28′0.69″，N34°29′16.83″，海拔：42 m）。

LB液體培養(yǎng)基、牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基：按參考文獻(xiàn)[7]配制，所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-52B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海書培實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；MLS-3750高壓蒸汽滅菌器：南北儀器有限公司；ZHPW-250臥式恒溫振蕩培養(yǎng)箱：天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵：上海亞榮生化儀器廠；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市杰瑞爾電器有限公司；MEDIFRIGER BL-S臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：西班牙MEDIFRIGER公司；V-5800PC分光光度計(jì)：上海精密儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

取傷力草全株，將根、莖、葉、花各組織分離，清洗表面灰塵及泥垢后陰干，置于60 ℃烘箱中烘至恒質(zhì)量，破碎機(jī)粉碎，備用。

1.3.2 傷力草浸提液的制備

稱取傷力草粉末，在不同處理下提取液過(guò)濾，保留上層清液，將上清液置于離心機(jī)4 ℃、4 000 r/min離心15 min，保留上層清液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀65 ℃濃縮至一定濃度后，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 菌株活化及菌懸液的制備

大腸桿菌在37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，用接種環(huán)挑一環(huán)大腸桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，充分振蕩，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h，離心棄上清，在無(wú)菌操作臺(tái)上用蒸餾水將沉淀稀釋至OD600nm≈0.1，置于4 ℃冰箱中短期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 抑菌實(shí)驗(yàn)方法

濾紙片藥液浸泡法[13]：將直徑準(zhǔn)=0.6 cm的濾紙片121 ℃高壓滅菌后冷卻，浸泡在浸提液20 min，瀝去濾紙片上殘留浸提液，平貼在含菌培養(yǎng)基平板表面。每個(gè)培養(yǎng)皿有3～5片，培養(yǎng)基中央浸泡無(wú)菌水的空白對(duì)照。37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈現(xiàn)象，并測(cè)量抑菌圈直徑（cm），記錄結(jié)果并拍照。

1.3.5 抑菌活性測(cè)定

抑菌活性分別用抑菌圈直徑和抑菌率表示，抑菌圈直徑由十字交叉法[14]測(cè)定，取數(shù)據(jù)平均值，抑菌率按照如下公式計(jì)算[15]：

1.3.6 單因素試驗(yàn)

（1）浸提液質(zhì)量濃度對(duì)抑菌效果的影響[16]：精確稱取干燥傷力草莖組織粉末6份，凈質(zhì)量分別為5 g、10 g、15 g、20 g、25 g、30 g，分別使用體積為50 mL、100 mL、150 mL、200 mL、250 mL、300 mL蒸餾水浸泡，于25 ℃恒溫水浴鍋中浸提24 h，試驗(yàn)中直接濃縮至1.0 g/mL、2.0 g/mL、3.0 g/mL、4.0 g/mL、5.0 g/mL、6.0 g/mL。

（2）浸提溫度對(duì)抑菌效果的影響[17]：精確稱取干燥傷力草莖組織粉末6份，分別用200 mL蒸餾水浸泡，溫度分別為25 ℃、37 ℃、50 ℃、65 ℃、80 ℃、95 ℃的水浴鍋中加熱24 h，將提取液過(guò)濾，保留上層清液，將上層清液置于離心機(jī)中4 ℃、4 000 r/min離心15 min，保留上層清液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀65 ℃濃縮至一定濃度后，置于4 ℃冰箱冷藏室中保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）浸提時(shí)間對(duì)抑菌效果的影響：精確稱取干燥傷力草莖組織粉末6份，分別用200 mL蒸餾水浸泡，于25 ℃恒溫水浴鍋中分別浸提6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h，將提取液過(guò)濾，保留上層清液，將上層清液置于離心機(jī)中4 ℃、4 000 r/min離心15 min，保留上層清液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀65 ℃濃縮至一定濃度后，置于4 ℃冰箱冷藏室中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.7 響應(yīng)面分析

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，選擇蒸餾水為浸提溶劑，選擇浸提液質(zhì)量濃度（A）、浸提溫度（B）和浸提時(shí)間（C）3個(gè)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，響應(yīng)面法[18-20]優(yōu)化傷力草莖水提液提取條件，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平如表1所示。

表1 傷力草莖部水提液抑菌成分提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for extract process optimization of antibacterial components of water extract form Shangli grass stem

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2016、SPSS 26.0、Design Expert 10.0.7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同組織水浸提液對(duì)大腸桿菌抑制效果

由圖1可知，以無(wú)菌水浸泡的濾紙片為對(duì)照，經(jīng)初篩發(fā)現(xiàn)只有傷力草莖部的浸提液對(duì)大腸桿菌具有一定抑制作用。復(fù)篩發(fā)現(xiàn)傷力草莖部水提液濾紙片四周出現(xiàn)明顯的抑菌圈，進(jìn)一步研究傷力草莖部水提液對(duì)大腸桿菌的抑制作用。

圖1 不同組織水浸提液對(duì)大腸桿菌抑制效果的影響Fig. 1 Effect of different tissue extracts on bacteriostasis of Escherichia coli

2.2 不同條件對(duì)傷力草莖部浸提液抑菌效果的影響

2.2.1 不同浸提液質(zhì)量濃度對(duì)傷力草莖部浸提液抑菌率的影響

傷力草莖部的不同浸提液質(zhì)量濃度對(duì)大腸桿菌的抑制作用影響見(jiàn)圖2。由圖2可知，抑菌率隨浸提液質(zhì)量濃度的增大呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。當(dāng)浸提液質(zhì)量濃度為1.0 g/mL時(shí)，傷力草莖部提取液的抑菌率最小，當(dāng)浸提液質(zhì)量濃度為5.0 g/mL時(shí)，對(duì)大腸桿菌的抑制作用最明顯。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇浸提液質(zhì)量濃度為4.0 g/mL、5.0 g/mL、6.0 g/mL作為響應(yīng)面試驗(yàn)水平。

圖2 不同質(zhì)量濃度對(duì)傷力草莖部浸提液抑菌率的影響Fig. 2 Effect of different extracts mass concentration from Shangli grass stem on bacteriostasis

2.2.2 不同浸提溫度對(duì)傷力草莖部浸提液抑菌率的影響

不同浸提溫度對(duì)傷力草莖部浸提液抑菌效果的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知，抑菌率隨浸提溫度升高呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，浸提溫度為37 ℃時(shí)，傷力草莖提取液抑菌率達(dá)到最大值；繼續(xù)升高浸提溫度到50 ℃時(shí)，傷力草莖提取液抑菌率開(kāi)始下降；浸提溫度達(dá)到80 ℃以上時(shí)，則沒(méi)有抑制作用。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇浸提溫度為25 ℃、37 ℃、50 ℃作為響應(yīng)面試驗(yàn)水平。

圖3 不同浸提溫度對(duì)傷力草莖部浸提液抑菌率的影響Fig. 3 Effect of different temperature of extracts from Shangli grass stem on bacteriostasis

2.2.3 不同浸提時(shí)間對(duì)傷力草莖部浸提液抑菌率的影響

不同浸提時(shí)間的浸提液對(duì)傷力莖部的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知，只有浸提時(shí)間超過(guò)18 h浸提液才有一定的抑菌現(xiàn)象出現(xiàn)，浸提時(shí)間為24 h時(shí)，傷力草莖部提取液抑菌率達(dá)到峰值，繼續(xù)浸提到30 h時(shí)，抑菌率相對(duì)于24 h降低了19.8%，可能是浸提時(shí)間延長(zhǎng)，破壞了抑菌活性物質(zhì)；但繼續(xù)延長(zhǎng)浸提時(shí)間到36 h，抑菌率又出現(xiàn)了上升，這可能是隨時(shí)間的延長(zhǎng)，又浸提出了其他的具有抑菌作用的成分。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇浸提時(shí)間為18 h、24 h、30 h作為響應(yīng)面試驗(yàn)水平。

圖4 不同浸提時(shí)間對(duì)傷力草莖部浸提液抑菌率的影響Fig. 4 Effect of different extraction time of extracts from Shangli grass stem on bacteriostasis

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化傷力草莖水浸提液提取條件

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以傷力草莖部水浸提液的抑菌率為響應(yīng)值，以浸提液質(zhì)量濃度（A）、浸提溫度（B）、浸提時(shí)間（C）為自變量，利用響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化傷力草莖部水浸提液的提取工藝[21]，所得的試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 傷力草莖部水浸提液抑菌成分提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of response surface experiments for extract process optimization of antibacterial components of water extracts from Shangli grass stem

利用Design-Expert 10.0.7軟件將表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得出傷力草莖部浸提液對(duì)大腸桿菌抑制作用的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=87.392+0.175A+0.126B+1.152C-0.022AB+0.125AC-0.007BC-0.911A2-2.078B2-5.273C2。

2.3.2 方差分析

對(duì)模型進(jìn)行方差分析[22]，結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，該模型P＜0.000 1，表示該模型極顯著（P＜0.01）。失擬項(xiàng)=0.175 9＞0.05，模型失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05）[23]，說(shuō)明所得方程回歸模型擬合真實(shí)水平，所選模型合適，可以使用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)分析試驗(yàn)結(jié)果[24]，本次試驗(yàn)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)有意義。相關(guān)系數(shù)R2=97.44%，說(shuō)明有97.44%的數(shù)據(jù)都可用該方程進(jìn)行解釋，具有較高的相關(guān)性，模型試驗(yàn)誤差合理[25]。校正相關(guān)系數(shù)R2Adj=94.15%，該模型適應(yīng)響應(yīng)值變化94.15%。變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）值[26]為0.92%，說(shuō)明提取優(yōu)化方法的結(jié)果準(zhǔn)確可靠。由P值可知，模型的一次項(xiàng)中浸提時(shí)間對(duì)抑菌率影響高度顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)對(duì)抑菌率影響均不顯著（P＞0.05），二次項(xiàng)中浸提液質(zhì)量濃度對(duì)抑菌率影響顯著（0.01＜P＜0.05），浸提溫度和浸提時(shí)間對(duì)抑菌率影響極顯著（P＜0.001）。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of regression equations for response surface experiments results

根據(jù)回歸模型做出各因素交互作用對(duì)結(jié)果影響的響應(yīng)曲面及等高線，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 浸提液質(zhì)量濃度、浸提溫度、浸提時(shí)間交互作用對(duì)傷力草莖部提取液抑菌率影響的響應(yīng)曲面及等高線圖Fig. 5 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between extract concentration,extract temperature and extract time on inhibition rate of water extracts from Shangli grass

響應(yīng)面圖坡度越陡表示響應(yīng)值受該因素的影響越大[27]。由圖5a可知，傷力草莖水提取液抑菌率隨著浸提液質(zhì)量濃度和浸提溫度增加，均呈先上升后下降趨勢(shì)，但是浸提液質(zhì)量濃度的曲面坡度較緩慢于浸提溫度的曲面坡度。由圖5b可知，隨著浸提液質(zhì)量濃度的提高，傷力草莖部提取液抑菌率表現(xiàn)出先上升后下降趨勢(shì)，但趨勢(shì)較緩慢。而傷力草莖部水提取液抑菌率隨浸提時(shí)間增加呈現(xiàn)明顯先上升后下降趨勢(shì)。可知，浸提時(shí)間對(duì)傷力草莖部水提液抑菌率的影響大于浸提液質(zhì)量濃度對(duì)抑菌率的影響。由圖5c可知，浸提時(shí)間的曲面坡度明顯比浸提溫度的曲面坡度陡峭，則浸提時(shí)間對(duì)傷力草莖部水提液抑菌率的影響大于浸提溫度對(duì)其抑菌率的影響。綜上所述，影響傷力草莖部水提取液抑菌率的因素順序?yàn)榻釙r(shí)間＞浸提溫度＞浸提液質(zhì)量濃度。

2.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證

根據(jù)響應(yīng)面擬合方程與模型預(yù)測(cè)可得出傷力草莖部水提取液抑菌率最高時(shí)的最佳提取工藝為：浸提液質(zhì)量濃度5.104 g/mL，浸提溫度37.876 ℃，浸提時(shí)間為24.663 h，預(yù)測(cè)抑菌率為87.467%，根據(jù)實(shí)際條件將最佳提取條件優(yōu)化為浸提液質(zhì)量濃度5.0 g/mL，浸提溫度37 ℃，浸提時(shí)間為24 h，重復(fù)試驗(yàn)3次得到力草莖部水提取液抑菌率實(shí)際值為87.89%，模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際測(cè)定結(jié)果相對(duì)誤差為0.42%，說(shuō)明響應(yīng)面模型最終優(yōu)化結(jié)果可靠。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用傷力草葉部、莖部、根部的水提液抑制大腸桿菌，結(jié)果表明，葉部和根部的水提物不能抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)，只有莖部水提液對(duì)大腸桿菌抑制效果明顯。本試驗(yàn)得出的傷力草莖部水提液對(duì)大腸桿菌抑制效果最佳的提取工藝為37 ℃水浴24 h，濃縮浸提液質(zhì)量濃度為5.0 g/mL。此優(yōu)化條件下，抑菌率是87.89%。