懷牛膝可培養(yǎng)內(nèi)生真菌的多樣性研究

孫思勝 張曉娟 馬傳貴 劉洋洋 陳林 張崗

摘要 [目的]探討道地藥材懷牛膝（Achyranthes bidentata Blume）內(nèi)生真菌的多樣性組成及定殖情況。[方法]通過組織塊分離法，選取二年生懷牛膝莖部和根部作為分離對象，進(jìn)行內(nèi)生真菌分離，并采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)2種方法對分離得到的真菌進(jìn)行鑒定。[結(jié)果]從懷牛膝材料中共分離純化獲得136株內(nèi)生真菌，其中根部分離得到86株，莖部分離得到50株，根據(jù)形態(tài)和分子生物學(xué)特征，它們屬于8目11科11屬;其中，懷牛膝根部內(nèi)生真菌定殖率較高（65.0%），莖部內(nèi)生真菌定殖率較低（37.5%）。莖部分離的內(nèi)生真菌只有8種，根部分離得到11種。[結(jié)論]懷牛膝根部內(nèi)生真菌表現(xiàn)出了較高的種屬多樣性。在懷牛膝根部分離的內(nèi)生真菌中，優(yōu)勢菌屬是鐮孢屬和Moesziomyces。

關(guān)鍵詞 懷牛膝;內(nèi)生真菌;根部;莖部;多樣性

中圖分類號 S567.23+9? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2022）10-0149-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.10.033

Study on Diversity of Culturable Endophytic Fungi from Achyranthes bidentata Blume

SUN Si-sheng1，ZHANG Xiao-juan2，MA Chuan-gui3 et al （1.College of Food and Pharmacy，Xuchang University/Key Laboratory of Biomarker Based Rapid-detection Technology for Food Safety of Henan Province，Xuchang，Henan 461000;2.Quartermaster Engineering Technology Institute，Academy of Military Science of the CPLA，Beijing 100010;3.Beijing Jingcheng Biological Technology Co.，Ltd.，Beijing 102600）

Abstract [Objective] To explore the diversity composition and colonization of endophytic fungi in Achyranthes bidentata Blume.[Method]By the method of tissue block separation，the stems and roots of biennial Achyranthes bidentata were selected as the separation objects，and the endophytic fungi were isolated，and the isolated fungi were identified by morphological and molecular biology methods.[Result]A total of 136 endophytic fungi were isolated and purified from Achyranthes bidentata materials，of which 86 strains were isolated from roots and 50 strains from stems.According to morphological and molecular biological characteristics，they belonged to 8 orders，11 families and 11 genera.Among them，the colonization rate of endophytic fungi in the root of Achyranthes bidentata was higher （65.0%），and the colonization rate of endophytic fungi in the stem was lower （37.5%）.Only 8 species of endophytic fungi were isolated from the stem，and 11 species were isolated from the root.[Conclusion]The endophytic fungi in the root of Achyranthes bidentata shows high species diversity.Among the endophytic fungi isolated from the roots of Achyranthes bidentata， dominant genera were Fusarium and Moesziomyces.

Key words Achyranthes bidentata Blume;Endophytic fungi;Root;Stem;Diversity

基金項目 河南省科技攻關(guān)項目（192102310441，202102110055）;陜西省高校青年杰出人才支持計劃。

作者簡介 孫思勝（1982—），男，河南范縣人，講師，博士，從事藥食兩用植物資源綜合開發(fā)與利用研究。通信作者，高級工程師，碩士，從事軍用食品研究。

收稿日期 2021-08-07

懷牛膝（Achyranthes bidentata Blume）為莧科（Achyranthes）牛膝屬（Achyranthes）多年生深根系草本植物，懷牛膝的使用歷史悠久，且可作為保健食品原料，我國最早的藥學(xué)著作《神農(nóng)本草經(jīng)》中將懷牛膝列為上品，久服可輕身延年。懷牛膝中含有甾酮、皂苷、多糖、黃酮和生物堿等成分，具有抗衰老、抗腫瘤、提高機體免疫力、促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、抑制血糖升高、降膽固醇、使受損的骨樣細(xì)胞再生、鎮(zhèn)痛消炎等作用[1-6]。由于懷牛膝具有延緩機體衰老、降糖、增強免疫力、抗腫瘤等多方面的功效，在保健品、食品和藥品中具有廣闊的開發(fā)潛力。

植物內(nèi)生真菌是指那些其全部或部分生活史在健康植物的各種組織或細(xì)胞內(nèi)部度過的真菌，它們的存在不引起宿主感染明顯的癥狀，但是它們可以通過組織學(xué)方法或嚴(yán)格表面消毒的方法從植物組織中分離或從植物組織內(nèi)部擴增出微生物 DNA的方法來證明其內(nèi)生性[7-8]。在長期醫(yī)療實踐過程中，部分特定地域、特定生產(chǎn)過程所出產(chǎn)的藥材較其他地區(qū)所產(chǎn)的同種藥材表現(xiàn)出品質(zhì)佳、療效好的特點，逐漸形成了“道地藥材”的概念[9]。道地藥材的品質(zhì)與療效經(jīng)歷臨床和生產(chǎn)的長期檢驗，其形成機制具有豐富的科學(xué)內(nèi)涵。普遍的觀點認(rèn)為，中藥材的道地性是在遺傳因素和外在因素的共同作用下形成的。其中，藥材自身遺傳因素及其所表現(xiàn)出的生物學(xué)特性是藥材道地性形成的內(nèi)因，也是道地性形成的本質(zhì)和基礎(chǔ)。外在因素即適宜的生態(tài)地理條件（溫度、水分、土壤、海拔、人工管理等）屬于外因，是影響藥材道地性的主要因素[10-11]。近年來的研究表明，環(huán)境微生物中與植物有緊密聯(lián)系的內(nèi)生菌對宿主植物的生長和次生代謝的影響不容忽視。因此該試驗以道地產(chǎn)區(qū)溫縣的二年生懷牛膝為材料，研究懷牛膝內(nèi)生真菌的多樣性，為懷牛膝內(nèi)生真菌多樣性與懷牛膝內(nèi)生真菌資源開發(fā)，以及進(jìn)一步探究內(nèi)生真菌多樣性與懷牛膝藥材道地性之間的關(guān)系奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 采自河南省焦作市溫縣農(nóng)科所種植基地健康的二年生懷牛膝植株。馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）配方（1 L）：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂12 g，去離子水定容至 1 000 mL，pH自然;122 ℃，滅菌22 min。孟加拉紅培養(yǎng)基配方（1 L）：孟加拉紅 35 g，去離子水定容至 1 000 mL，pH自然;122 ℃，滅菌22 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 懷牛膝內(nèi)生真菌的分離。

采用組織塊分離法[12-13]。隨機選取健康的懷牛膝根、莖，清水洗凈，無菌濾紙吸干水分，切成 1 cm 左右小段。在無菌條件下，浸入 75%乙醇中漂洗 30～60 s，然后再放入3%的次氯酸溶液中浸泡 8～12 min，無菌水沖洗4 次，再用無菌濾紙吸干水分。然后在無菌條件下，將表面消毒后的樣品切成 0.2 cm×0.2 cm大小的組織塊，從懷牛膝根部和莖部各隨機選取120 個組織塊，共計240個組織塊用于懷牛膝內(nèi)生真菌的分離。菌株用 PDA試管斜面保藏和10%甘油管妥善保藏;其中PDA試管放4? ℃冰箱保藏，10%甘油管放于-80? ℃超低溫冰箱保存。

1.2.2 內(nèi)生真菌的鑒定。

對分離的真菌編號之后，采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)2種方法對它們進(jìn)行鑒定;先根據(jù)形態(tài)和顯微特征以及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)對能夠產(chǎn)孢的菌株進(jìn)行鑒定;再對不能產(chǎn)孢的菌株初步歸為不產(chǎn)孢類群，然后利用分子生物學(xué)技術(shù)對其進(jìn)行鑒定。

1.2.2.1 形態(tài)學(xué)特征鑒定。

將已經(jīng)純化好的真菌接種于PDA平板上，觀察記錄菌落形態(tài)、生長特性，結(jié)合顯微結(jié)構(gòu)中的孢子形態(tài)、大小和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等對其進(jìn)行經(jīng)典的形態(tài)鑒定[14-17]，同時，通過對相關(guān)文獻(xiàn)的收集和查閱，最終能夠鑒定出這些真菌在分類學(xué)地位上屬于哪個屬或哪個種。

1.2.2.2 分子生物學(xué)手段鑒定。

除經(jīng)典形態(tài)鑒定外，該研究另外采用對真菌菌絲的核糖體rDNA的ITS序列擴增進(jìn)行鑒定的方法。一方面，對形態(tài)鑒定結(jié)果能夠相互驗證，確保鑒定的準(zhǔn)確性;另一方面，對一些經(jīng)過誘導(dǎo)也不產(chǎn)孢子的真菌進(jìn)行分子生物學(xué)手段的鑒定是目前普遍應(yīng)用的一種方法。

具體方法是：將分離獲得的真菌進(jìn)行純培養(yǎng)，提取核糖體rDNA，對轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS1-5.8S-ITS2）進(jìn)行擴增，擴增后獲得的 DNA 片段500～750 bp的序列，將其與GeneBank（http：//ncbi.nim.nih.gov）中的數(shù)據(jù)對比，確定其種屬類別。序列比對后，如果目標(biāo)序列和參考序列有95%以上的同源性，就暫定到參考序列所在的屬，如果有99%以上（包括99%）的相似性就暫定到種[18]。

1.3 菌株的保藏 把從懷牛膝根部和莖部中分離到的菌株進(jìn)行編號、整理和鑒定后，將菌株的活體標(biāo)本保藏于黃河科技學(xué)院納米功能材料研究所微生物真菌保藏中心。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

（1）分離率（isolation rate，IR）。樣本組織塊中分離得到的菌株數(shù)占全部樣本組織塊數(shù)的百分比，用來衡量植物組織中內(nèi)生真菌的豐富程度和每個組織塊受多重定殖的發(fā)生頻率。

（2）定殖率（colonization rate，CR）。樣本中受內(nèi)生真菌定殖的組織塊數(shù)占全部組織塊數(shù)的百分率，能夠反映出同一植物不同組織受內(nèi)生真菌的定殖程度。

（3）分離頻率 （isolation frequency，IF）。分離得到的某種（類）內(nèi)生真菌的菌株數(shù)占分離獲得的總菌株數(shù)的百分率，用于反映不同種（類）的內(nèi)生真菌在總菌群中的優(yōu)勢程度。IF>10%的內(nèi)生真菌為優(yōu)勢屬， 1%≤IF≤10%的內(nèi)生真菌為常見屬，IF<1%的內(nèi)生真菌為稀有屬。

（4）香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)（Shannon-Wiener index，H’）。H’=-（PilnPi），Pi 是指該品種（部位）某種內(nèi)生真菌菌株數(shù)量占該品種（部位）所有分離到內(nèi)生真菌菌株總數(shù)量的百分比，用來分析特定群落中內(nèi)生真菌的類群多樣性，群落中生物種類增多代表群落的復(fù)雜程度增高[10，15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 懷牛膝內(nèi)生真菌鑒定 從懷牛膝根部分離得到86株內(nèi)生真菌，根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果（表1），懷牛膝根部的 86株內(nèi)生真菌分別屬于子囊菌門糞殼菌綱肉座菌目叢赤殼科鐮孢屬的尖鐮孢菌、腐皮鐮刀菌以及1個不明種，肉座菌目球腔菌科Sarocladium的枝頂孢霉及1個不明種，肉座菌目Stachybotryaceae Albifimbria的 Myrothecium verrucaria，小叢殼目Plectosphaerellaceae Verticillium的Verticillium dahliae;座囊菌綱座囊菌目枝孢霉科枝孢霉屬的Cladosporium cladosporioides，格孢腔菌目Phaeosphaeriaceae Phaeosphaeria 的1個不明種;擔(dān)子菌門黑粉菌綱黑粉菌目黑粉菌科Moesziomyces 的Pseudozyma aphidis，微球黑粉菌綱鎖擲酵母目鎖擲酵母科紅酵母屬的1個不明種。共計2個門4個綱 6 個目 8 個科 8 個屬和 7個種以及4個不明種。此外，在懷牛膝根部分離的菌株中，優(yōu)勢屬為鐮孢屬和Moesziomyces，其中鐮孢屬的菌株數(shù)占總數(shù)的 44.19%，常有屬占 30.23%。

2.2 懷牛膝莖部內(nèi)生真菌鑒定 從懷牛膝莖部分離得到50株內(nèi)生真菌，

根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果（表2），懷牛膝莖部的 50株內(nèi)生真菌分別屬于子囊菌門座囊菌綱格孢菌目格孢菌科鏈格孢屬鏈格孢菌，座囊菌目枝孢霉科枝孢霉屬的Cladosporium cladosporioides;糞殼菌綱肉座菌目叢赤殼科鐮孢屬的Fusarium avenacum以及1個不明種，小叢殼目Plectosphaerellaceae Verticillium的Verticillium dahliae，Dothideomycetidae目球腔菌科Mycosphaerella的 1個不明種;散囊菌綱散子囊菌目曲霉科青霉屬草酸青霉菌;擔(dān)子菌門黑粉菌綱黑粉菌目黑粉菌科Moesziomyces的Pseudozyma aphidis。共計2個門4個綱 7個目 7個科 7個屬和 6個種以及2個不明種。此外，在懷牛膝莖部分離的菌株中，優(yōu)勢屬為鐮孢屬、鏈格孢屬和枝孢霉屬，其分別占總數(shù)的 30%、22%和18%，常有屬占 30%。

2.3 懷牛膝不同部位內(nèi)生真菌的分布情況及多樣性 從表 3 可以看出，懷牛膝不同部位內(nèi)生真菌的數(shù)量具有一定差異，懷牛膝共分離出 136株內(nèi)生真菌，其中根部內(nèi)生真菌的分離率和定殖率分別為71.67%、65.0%，分離出 86株真菌;莖部內(nèi)生真菌的分離率和定殖率分別為41.67%、37.5%。懷牛膝內(nèi)生真菌不同部位內(nèi)生真菌多樣性以根部為最高，其次為莖部;懷牛膝不同部位的內(nèi)生真菌數(shù)量存在差異，根部內(nèi)生真菌數(shù)量高于莖部，且多樣性也高于莖部。

3 結(jié)論與討論

該研究采用組織塊分離法從懷牛膝植株中分離到內(nèi)生真菌 136 株，利用形態(tài)學(xué)特征和ITS-rDNA 序列分子鑒定法將其鑒定為 11 個分類單元，分布在 5 綱 8 目 11科 11屬，可見懷牛膝植物內(nèi)生真菌具有豐富的多樣性。在懷牛膝根部分離的菌株中，優(yōu)勢屬為鐮孢屬和Moesziomyces;莖部分離的菌株中，優(yōu)勢屬為鐮孢屬、鏈格孢屬和枝孢霉屬;且懷牛膝根部內(nèi)生真菌分離率和多樣性均比莖部高。懷牛膝為多年生草本植物，野生條件下生長緩慢，大田栽培懷牛膝的生長周期一般為從春到秋一個生長季，此次試驗采集的是二年生人工栽培的懷牛膝。因此內(nèi)生真菌數(shù)量在懷牛膝不同部位的分布差異可能與懷牛膝的生長時間有關(guān)，其多樣性受宿主生長周期、生境等因素影響較大。將該研究結(jié)果與Sun等[19]的研究結(jié)果對比，發(fā)現(xiàn)共有屬一致;但是不同部位內(nèi)生真菌分離率和多樣性有差異，其結(jié)果為莖部比根部內(nèi)生真菌分離率和多樣性高，該研究則為根部比莖部內(nèi)生真菌分離率和多樣性高;差異產(chǎn)生的可能原因是該研究采用的材料為二年生人工栽培的懷牛膝，而Sun等[19]采用的為一年生人工栽培的懷牛膝。

在藥用植物與內(nèi)生真菌形成的微生態(tài)系統(tǒng)中，內(nèi)生真菌不僅可以改變藥用植物的生物學(xué)特性、促進(jìn)其生長、提高宿主植物抵御不良環(huán)境脅迫的能力，而且可以促進(jìn)宿主植物有效成分的合成和積累[20-21]。種種跡象表明內(nèi)生真菌對道地藥材主要活性成分的積累具有重要作用。懷牛膝內(nèi)生真菌具有豐富的多樣性，這些真菌是否能夠產(chǎn)生與懷牛膝類似的有效成分，是否是懷牛膝道地性形成的影響因素，今后將從內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物、生物轉(zhuǎn)化等方面深入研究，以期從微生態(tài)角度了解懷牛膝道地性的形成機制，為中藥材道地性的評價提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 高陽，姜曉莉.西洋參保健食品研發(fā)[J].東北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，45（3）：108-110.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：72-73.

[3] HE G，GUO W，LOU Z Y，et al.Achyranthes bidentata saponins promote osteogenic differentiation of bone marrow stromal cells through the ERK MAPK signaling pathway [J].Cell biochemistry and biophysics，2014，70：467-473.

[4]沈舒，王瓊，李友賓.牛膝的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J].海峽藥學(xué)，2011，23（11）：1-6.

[5] TAN F，DENG J.Analysis of the constituents and antisenile function of Achyranthes bidentata polysaccharides[J].Acta botanica sinica，2002，44 （7）：795-798.

[6] LI Q J，ZHENG Z J，PENG Y，et al.Opposite effects on tumor growth depending on dose of Achyranthes bidentata polysaccharides in C57BL/6 mice[J].Intermational immunopharmacology，2007，7（5）：568-577.

[7] 張萬芹，邱國俊，房保柱，等.黔西南薏苡內(nèi)生真菌多樣性及其抗菌活性研究[J].生物資源，2020，42（4）：428-436.

[8] 王紅霞，余亞茹，黃寶康.構(gòu)樹可培養(yǎng)內(nèi)生真菌的多樣性初探[J].菌物學(xué)報，2020，39（12）：2399-2408.

[9] 胡世林.中國道地藥材[M].哈爾濱：黑龍江科學(xué)技術(shù)出版社，1989.

[10] 韓邦興，彭華勝，黃璐琦.中國道地藥材研究進(jìn)展[J].自然雜志，2011，33（5）：281-285.

[11] 馬昭，唐承晨，張純，等.內(nèi)生菌與宿主植物關(guān)系對中藥材道地性研究的啟示[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2015，29（6）：4-11.

[12] 劉增亮，周雙云，梁桂東，等.量天尺根部內(nèi)生真菌的多樣性[J].菌物學(xué)報，2020，39（4）：723-730.

[13] SUN S S，ZENG X，ZHANG D W，et al.Diverse fungi associated with partial irregular heartwood of Dalbergia odorifera[J].Scientific reports，2015，5：1-7.

[14] SUTTON B C.The Coelomycetes.Fungi imperfecti with pycnidia，acervuli and stromata[M].Kew：Commonwealth Mycological Institute，1980.

[15] HANLIN R T.Illustrated genera of ascomycetes：Vol I and II[M].St.Paul：The American Phytopathology Society，1998.

[16] KIFFER E，MORELET M.The Deuteromycetes-mitosporic fungi：Classification and generic keys[M].Enfield：Science Publishers Inc，1999.

[17] 魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1982：487-645.

[18] SUREZ J P，WEIβ M，ABELE A，et al.Members of Sebacinales subgroup B form mycorrhizae with epiphytic orchids in a neotropical mountain rain forest[J].Mycological progress，2008，7（2）：75-85.

[19] SUN B D，CHEN A J，GAO W W，et al.Endophytic fungi associated with the medicinal plant，Achyranthes bidentata Blume （Amaranthaceae）[J].African journal of microbiology research，2013，7（15）：1357-1365.

[20] MAHDIEH S H M，JALAL S.Psychrophilic endophytic fungi with biological activity inhabit Cupressaceae plant family[J].Symbiosis，2014，63（2）：79-86.

[21] 王景儀，李夢秋，李艷茹，等.藥用植物內(nèi)生真菌的多樣性及生物功能研究進(jìn)展[J].生物資源，2020，42（2）：164-172.