N6-甲基腺苷修飾在HBV感染中的作用

薛 萍， 范 超

空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院 傳染科， 西安 710038

RNA轉(zhuǎn)錄后修飾在真核生物中較為普遍。其中，N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)修飾的生物學(xué)作用逐漸受到重視[1]。據(jù)估計[2]，細胞中25%的mRNA存在m6A修飾。而長鏈非編碼RNA(lncRNA)、微小RNA(miRNA)和病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物等RNA分子中也存在m6A修飾現(xiàn)象。自1970年起，RNA分子中的m6A甲基化現(xiàn)象被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時的m6A檢測主要依靠水解或核酸酶消化放射性標(biāo)記的RNA和色譜分析。時至今日，MeRIP-seq、PA-m6A-seq、miCLIP、m6A-LAIC-seq和SELECT等技術(shù)陸續(xù)被開發(fā)，使m6A功能相關(guān)研究得以更全面地開展[3-7]。

m6A修飾既有普遍性，又有序列特異性。多數(shù)m6A位點修飾以相似的分布方式存在于相應(yīng)的mRNA中，主要發(fā)生在RRACH基序(R=A或G；H=A、C或U)上，位點常聚集在轉(zhuǎn)錄起始點、剪接位點側(cè)翼的外顯子區(qū)、終止位點、5′非翻譯區(qū)(5′UTR)和3′非翻譯區(qū)(3′UTR)附近?；虻墓δ艹Ｅcm6A豐度相關(guān)，例如調(diào)節(jié)發(fā)育和細胞命運的基因往往含有更高的m6A修飾[5]。其功能涉及：RNA的穩(wěn)定性、剪接、核輸出、折疊、翻譯調(diào)節(jié)和降解等；參與的生物學(xué)過程包括：細胞重編程、干細胞分化、細胞增殖、細胞的應(yīng)激反應(yīng)、晝夜節(jié)律的調(diào)控和癌癥的發(fā)生等[8]。

m6A修飾不僅存在于真核細胞的內(nèi)源性RNA中，也同樣存在于病毒基因轉(zhuǎn)錄本中。例如猿猴病毒40、甲型流感病毒和腺病毒等的mRNA中均存在m6A修飾[9]。研究[10-11]發(fā)現(xiàn)，HBV感染同樣受到m6A修飾的調(diào)節(jié)。使用siRNA基因沉默m6A甲基轉(zhuǎn)移酶——甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白(methyltransferase-like protein，METTL)3/14可促進HBc和HBs的表達。同樣，如果基因沉默m6A結(jié)合蛋白YTHDF2/3，也會得到相似的結(jié)果。相反，如果基因沉默m6A去除蛋白FTO和ALKBH5，則會抑制HBc和HBs等病毒蛋白的表達[12]。

1 m6A修飾的基本過程和參與蛋白

m6A修飾的基本過程包括m6A的寫入、擦除和識別。m6A修飾受三類蛋白的調(diào)節(jié)，即甲基轉(zhuǎn)移酶(或稱“寫入器”)、去甲基化酶(或稱“擦除器”)以及m6A結(jié)合蛋白(或稱“讀取器”)。m6A修飾由甲基轉(zhuǎn)移酶引入，可被去甲基化酶消除，并通過m6A結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)RNA的結(jié)構(gòu)和功能(圖1)。“寫入器”由METTL3/14/16、維爾姆斯腫瘤相關(guān)蛋白(Wilms tumor associated protein，WTAP)、RNA結(jié)合基序蛋白15和KIAA1429等亞基構(gòu)成[13]。METTL3/14為復(fù)合物的核心成分，WTAP為調(diào)節(jié)亞基。RNA結(jié)合基序蛋白15和KIAA1429等蛋白也可影響“寫入器”的活性[14]。METTL16獨立于METTL3/METTL14/WTAP復(fù)合物，介導(dǎo)U6 snRNA和甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶2A mRNA的m6A修飾[15-16]。m6A修飾位點產(chǎn)生后，可通過alkB同源物5或脂肪量和肥胖相關(guān)蛋白等去除。脂肪量和肥胖相關(guān)蛋白除對m6A修飾具有去除作用外，還參與單鏈DNA或RNA中3-甲基胸腺嘧啶或3-甲基尿嘧啶的去甲基化[14]，并可介導(dǎo)N6,2′-O-二甲基腺苷(m6Am)的去除[15]。m6A“讀取器”的成員包含：YTH家族蛋白1/2/3(YTH domain family protein1/2/3，YTHDF1/2/3)、YTH結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白(YTH domain containing1/2，YTHDC1/2)等。YTHDF1可通過與3′UTR區(qū)域的m6A位點結(jié)合增強mRNA的翻譯活性；YTHDF2招募CCR4-NOT復(fù)合蛋白來促進mRNA的降解；YTHDF3為YTHDF1和YTHDF2調(diào)節(jié)亞基[17-18]。YTHDC1可調(diào)節(jié)mRNA從細胞核到細胞質(zhì)的運輸[19]，YTHDC2可與細胞質(zhì)中的核糖體亞基相互作用，調(diào)節(jié)RNA的翻譯[19]。此外，廣義的m6A“讀取器”還包括胰島素樣生長因子2-mRNA結(jié)合蛋白(insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein，IGF2BP)和真核起始因子3(eukaryotic initiation factor 3，eIF3)等[20]。IGF2BP通過GG(m6A)C基序與m6A位點結(jié)合，以促進mRNA的穩(wěn)定性；eIF3通過與mRNA 5’UTR 區(qū)的m6A位點結(jié)合來促進蛋白質(zhì)翻譯[20]。

2 HBV轉(zhuǎn)錄物的m6A修飾

在HBV的復(fù)制周期中，HBV可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生前基因組RNA(pregenomic RNA，pgRNA)，后者在細胞質(zhì)核心顆粒中被逆轉(zhuǎn)錄為松弛的環(huán)狀DNA，隨后環(huán)狀DNA在細胞核中轉(zhuǎn)化為共價閉環(huán)DNA，并利用細胞RNA聚合酶Ⅱ合成病毒RNA[21]。HBV基因轉(zhuǎn)錄從不同的轉(zhuǎn)錄起始位點開始，但共用同一個轉(zhuǎn)錄終止信號。因此，HBV轉(zhuǎn)錄本具有不同的5′末端，但具有共同的3′末端序列[22]。HBV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中包含m6A共有的DRACH基序(GGACA)，位于HBV轉(zhuǎn)錄物的epsilon-莖環(huán)區(qū)域(A1907)內(nèi)。由于HBV基因存在冗余重復(fù)，該基序在pgRNA的5′和3′末端重復(fù)2次，但在亞基因組轉(zhuǎn)錄本的3′UTR中僅存在1次[23]。這些m6A修飾位點可被“閱讀器”識別并促進HBV RNA的細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運和pgRNA包裝。在YTHDC1敲除細胞中，病毒轉(zhuǎn)錄物在細胞核中積累，病毒復(fù)制和共價閉環(huán)DNA合成受到顯著抑制。

HBV RNA不同位置的m6A修飾具有不同的生物學(xué)功能。位于HBV轉(zhuǎn)錄本3′-epsilon莖環(huán)的m6A修飾可降低病毒轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定性，從而抑制病毒蛋白的表達。這種RNA穩(wěn)定性的降低由YTHDF2/3介導(dǎo)。因此，基因沉默這些蛋白可增強HBV蛋白表達。同樣，當(dāng)3′-epsilon莖環(huán)m6A位點發(fā)生突變時，HBV蛋白的表達也被會增強。另一方面，位于pgRNA 5′-epsilon莖環(huán)中的m6A位點則可通過促進逆轉(zhuǎn)錄酶的識別，正向調(diào)節(jié)病毒的逆轉(zhuǎn)錄活性[10]。同時，由于pgRNA 5′-epsilon莖環(huán)結(jié)構(gòu)可被視黃酸誘導(dǎo)基因Ⅰ(retinoic acid inducible gene Ⅰ，RIG-Ⅰ)識別，從而刺激干擾素(IFN)合成。而m6A修飾的存在可以降低RIG-Ⅰ的親和力[24]。因此，HBV RNA的m6A 修飾可作為降低RIG-Ⅰ識別自身與非自身RNA的一種特殊手段。

3 m6A參與HBV感染免疫應(yīng)答

HBV RNA的m6A修飾可調(diào)節(jié)宿主的免疫應(yīng)答過程。HBV RNA的m6A修飾在IFNα誘導(dǎo)的病毒RNA降解中發(fā)揮作用，YTHDF2作為識別因子介導(dǎo)HBV RNA的降解[28]。在HBV感染的IFN治療過程中，IFNα通過IFN刺激基因20(interferon stimulating gene，ISG20)的核酸外切酶活性降解病毒RNA[25]。研究[26]發(fā)現(xiàn)，ISG20可被YTHDF2識別。YTHDF2將ISG20遞送至HBV RNA的m6A甲基化位點，從而對病毒RNA進行降解。相反，如果突變HBV RNA的m6A位點，則ISG20介導(dǎo)的病毒RNA降解過程會被削弱[25-26]。病毒感染激活宿主模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)可檢測病原體相關(guān)分子模式，啟動固有免疫反應(yīng)對抗病毒感染。而識別外來RNA的PRR依賴于特定的分子特征來區(qū)分自身與非自身RNA。如前所述，HBV pgRNA 5′-epsilon莖環(huán)上的m6A修飾降低了RIG-Ⅰ的信號活性，抑制RIG-Ⅰ對病毒RNA的識別過程[24]。同時，由于m6A修飾位點的存在，YTHDF2可與HBV RNA的RIG-Ⅰ配體識別區(qū)結(jié)合，進一步阻斷RIG-Ⅰ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，YTHDF2通過將病毒RNA與RIG-Ⅰ隔離來抑制RIG-Ⅰ對HBV RNA的感知[22]。

4 HBV感染對m6A修飾的影響

HBV感染可誘導(dǎo)宿主細胞m6A修飾譜發(fā)生顯著變化[27]。例如，磷酸酶和張力蛋白同源蛋白(phosphatase and tesion homologue deleted on chromosome ten，PTEN)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在HBV感染過程中表現(xiàn)出異常的m6A修飾，這種修飾可降低PTEN的穩(wěn)定性，減少PTEN的表達水平。PTEN可通過誘導(dǎo)干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory factor，IRF-3)的 Ser-96磷酸化促進IRF-3核轉(zhuǎn)位，從而激活I(lǐng)FN信號[28]。因此，HBV上調(diào)PTEN的m6A修飾過程抑制了宿主的抗病毒免疫反應(yīng)[27]。HBV可利用特殊機制指導(dǎo)自身RNA的m6A修飾[29]。例如，HBx可通過調(diào)節(jié)病毒RNA的m6A修飾影響病毒的感染周期。在HBV感染期間，HBx可與m6A甲基轉(zhuǎn)移酶相互作用，促進其核轉(zhuǎn)移過程，從而增強m6A甲基轉(zhuǎn)移酶對HBV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的m6A修飾作用。因此，HBx缺陷型的HBV感染不能有效產(chǎn)生m6A修飾的病毒RNA[29]，進而阻斷SMC5/6復(fù)合物的激活和HBx-DDB介導(dǎo)的RNA降解活性[30]。HBx還可促進m6A甲基轉(zhuǎn)移酶向PTEN基因的募集，從而將m6A添加到PTEN轉(zhuǎn)錄本中[27]。

圖1 m6A修飾的基本過程和參與蛋白

5 m6A修飾與HBV相關(guān)肝細胞癌(HCC)

HBV慢性感染是HCC的最主要原因[10,31]，越來越多的證據(jù)[35-36]表明，m6A相關(guān)蛋白的異常表達與HCC相關(guān)。例如，m6A修飾可通過METTL3/14參與HCC進程。HCC中異常表達的METTL3促進HCC的細胞增殖、遷移和集落形成[32]。細胞因子信號抑制因子2(suppressor of cytokine signaling 2，SOCS2)是METTL3介導(dǎo)的m6A修飾的靶基因，METTL3可通過YTHDF2介導(dǎo)的m6A識別促進SOCS2 mRNA的降解，從而使細胞失去SOCS2相關(guān)的抑癌信號。另一方面，METTL14在HCC中顯著下調(diào)，其表達水平與腫瘤復(fù)發(fā)和生存預(yù)后相關(guān)。METTL14通過促進DiGeorge綜合征相關(guān)結(jié)構(gòu)域基因8與miRNA初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(pri-miR)的識別，調(diào)節(jié)pri-miR126向miR126的成熟，最終促進腫瘤分化和微血管浸潤[9]。此外，HBV感染調(diào)節(jié)PTEN的m6A甲基化，減少PTEN表達。PTEN是一種重要的腫瘤抑制蛋白[33]，PTEN水平降低將在一定程度上誘導(dǎo)HCC的發(fā)生[34]。HBx誘導(dǎo)circ-ARL3的m6A修飾有利于circ-ARL3反向剪接和生物發(fā)生，circ-ARL3能夠吸附miR-1305，拮抗癌基因作用，從而促進HBV相關(guān)HCC進展[35](圖2)。

6 小結(jié)與展望

病毒基因組及轉(zhuǎn)錄物的m6A修飾與病毒的發(fā)病機制密切相關(guān)[10,36-38]。本文討論了HBV感染過程中發(fā)現(xiàn)的m6A修飾，這些研究結(jié)果為了解m6A在病毒-宿主相互作用中的功能提供了新的證據(jù)，也可能為基于m6A的治療干預(yù)提供新的途徑，但依然有很多問題值得進一步研究。近期，本實驗室通過收集不同HBV感染者臨床樣本開展m6A修飾譜分析，發(fā)現(xiàn)不同HBV感染者間的細胞m6A修飾存在明顯差異，表明m6A修飾可能對HBV感染免疫應(yīng)答具有重要意義，其具體機制將在后續(xù)研究中深入討論。作為一種具有應(yīng)用前景的分子靶點，m6A是否可以成為HBV預(yù)后和診斷標(biāo)志物，以及在藥物篩選中的潛力依然有待發(fā)掘。同時，還應(yīng)注意到，除了m6A修飾外，病毒轉(zhuǎn)錄本還存在其他化學(xué)修飾，包括5-甲基胞嘧啶、尿苷向假尿苷的編輯以及腺苷到肌苷的編輯等[39]；而在病毒基因組中也報道了其他形式的表觀轉(zhuǎn)錄組修飾，包括5-甲基胞苷、N4-乙酰胞苷，但上述修飾的具體功能依然有待研究[39-40]。相關(guān)RNA修飾的機制和功能是否類似m6A修飾，對該問題的深入分析具有重要的生物學(xué)意義。

圖2 HBV感染過程中m6A甲基化的調(diào)控作用

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：薛萍負責(zé)收集數(shù)據(jù)，資料分析，撰寫論文；范超負責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。