鎘對小鼠胚胎肝細胞BNL CL.2氧化損傷作用的研究

王 艷， 劉 暢,*， 靳二輝， 趙 磊，胡倩倩， 路振香， 李 磊

(1.安徽科技學院 動物科學學院，安徽 鳳陽 233100; 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部豬肉質(zhì)量安全控制重點實驗室，安徽 鳳陽 233100; 3.動物營養(yǎng)調(diào)控與健康安徽省重點實驗室，安徽 鳳陽 233100)

隨著我國工業(yè)化進程的快速發(fā)展，環(huán)境鎘污染日益嚴重。目前，我國多地均存在著不同程度的鎘污染問題[1]。土壤鎘污染直接導致地下水、糧食、牧草及農(nóng)作物中的鎘含量超標，從而導致飼料及其原料中鎘嚴重超標[2]。農(nóng)業(yè)部飼料工業(yè)中心實驗室承檢的飼料添加劑樣品中鎘含量大幅超標，最高達8.4%；在貴州某污染區(qū)，飼料中鎘含量達我國《飼料衛(wèi)生標準》限量的13.16倍；徐喆[3]研究發(fā)現(xiàn)，黑龍江省某市雞配合飼料中鎘的總體超標率達7.1%。動物采食被污染飼料可造成急、慢性中毒，嚴重影響畜禽養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展，更令人擔憂的是鎘還可以通過食物鏈進入人體，嚴重危害人畜健康。

鎘為人和動物非必需元素[4]，可經(jīng)皮膚、呼吸道及消化道吸收進入體內(nèi)[5]，消除半衰期可長達10～30年之久，一經(jīng)進入機體，幾乎無法被釋放出體外[6]。進入體內(nèi)的鎘可對肝、腎、肺、骨骼和腦等主要器官形成損害[7-8]，也可導致免疫、神經(jīng)、生殖等系統(tǒng)的損傷[9]。肝臟具有分泌膽汁、參與物質(zhì)與能量代謝、吞噬、解毒和防御等多重生理功能。肝功能的復雜性和多樣性增加了肝臟與各種毒性因子接觸的機會，因此，肝臟最易受到各種致病因素的侵害而造成損傷。研究發(fā)現(xiàn)，肝臟是鎘的主要靶器官之一，鎘吸收進入血液循環(huán)后快速到達肝臟，在肝臟中進行蓄積，人體內(nèi)大約1/6的鎘蓄積于肝臟[10]，急性或高劑量鎘中毒主要表現(xiàn)為急性肝損傷[11]。鎘暴露還與多種癌癥的發(fā)生相關(guān)，特別是與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)[12]。通常認為，鎘誘導的急性肝損傷與氧化應激、炎癥反應密切相關(guān)。然而，目前關(guān)于鎘誘導肝損傷的確切機制尚未完全闡明，這對鎘暴露肝損傷的防治工作帶來巨大挑戰(zhàn)，因此，深入揭示鎘誘導肝損傷作用機制具有重要理論意義與臨床應用價值。本研究通過建立體外鎘誘導肝損傷模型并分析鎘誘導肝臟氧化應激損傷作用，為進一步深入揭示鎘誘導的肝損傷作用機制提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

正常小鼠胚胎肝細胞(BNL CL.2)由中國科學院細胞庫/干細胞庫提供；CdCl2、胎牛血清均購自美國Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液(pH7.4，PBS)與0.25%胰蛋白酶均購于美國Gibco公司；總超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)活性檢測試劑盒(WST-8法)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒、CCK-8細胞活力檢測試劑盒與Hoechst 33342染液等購于上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 正常小鼠胚胎肝細胞(BNL CL.2)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖的培養(yǎng)基當中，在37 ℃、含5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液，待細胞長滿后，再經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，加入新鮮的DMEM高糖細胞培養(yǎng)液，反復吹打成單細胞懸液后，按照1∶3進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8法測定鎘對BNL CL.2細胞的毒性作用 收集處于對數(shù)生長期的BNL CL.2細胞，以2×104個/孔接種至96孔板，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，濃度為0～80 μmol/L的CdCl2處理0～24 h，每個處理設(shè)6個復孔，于試驗結(jié)束前3 h在每孔加入CCK-8試劑10 μL，試驗結(jié)束時采用酶標儀(Multiskan GO1510，Thermo Fisher公司)于450 nm 處測定吸光度，并計算各處理組細胞存活率。

1.2.3 HE染色 使用40 μmol/L CdCl2分別處理細胞0、3、6、12、18、24 h后，用PBS輕輕洗滌3次，使用95%酒精固定13 min，然后用PBS洗2次，每次1 min，接著使用蘇木素染液染色10 min，自來水洗3遍后，浸入1%鹽酸-酒精溶液分色數(shù)秒，然后再用自來水浸洗3遍，隨后用伊紅染液復染12 min，自來水浸洗后進行拍照分析。

1.2.4 Hoechst 33342染色 取對數(shù)生長期的BNL CL.2細胞接種至培養(yǎng)皿中，經(jīng)40 μmol/L CdCl2分別處理0、3、6、12、18、24 h后，每個培養(yǎng)皿加入1.5 mL Hoechst 33342細胞染液，37 ℃避光條件下孵育10 min；然后棄掉染液，加入少量PBS緩沖液輕輕洗滌2次后，使用倒置熒光顯微鏡(T12-U+Q12，尼康)觀察細胞形態(tài)并拍照。

1.2.5 CdCl2對BNL CL.2細胞SOD活力的影響 BNL CL.2細胞經(jīng)40 μmol/L CdCl2分別處理0、3、6、12、18、24 h后，按照SOD檢測試劑盒說明書測定各組樣品中SOD的活力，以BCA法測定各組樣本的蛋白濃度，并根據(jù)樣品蛋白濃度校正各組SOD測定結(jié)果。

1.2.6 CdCl2對BNL CL.2細胞MDA含量的影響 BNL CL.2細胞經(jīng)40 μmol/L CdCl2作用不同時間后，按照試劑盒說明書測定各組樣品中MDA的含量，并根據(jù)各組樣品蛋白濃度校正測定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的CdCl2對小鼠肝細胞活力的影響

采用CCK-8細胞毒性試驗測定不同濃度CdCl2對BNL CL.2細胞活力的影響。結(jié)果如圖1所示，與空白對照組相比，40 μmol/L和80 μmol/L CdCl2處理12 h可極顯著抑制BNL CL.2細胞活力(P<0.01)，而10 μmol/L和20 μmol/L對BNL CL.2細胞活力無顯著影響(P>0.05)，因此，在后續(xù)研究中選擇40 μmol/L CdCl2作為處理因素。

圖1 不同濃度CdCl2對小鼠肝細胞活力的影響

2.2 CdCl2不同作用時間對小鼠肝細胞活力的影響

以40 μmol/L CdCl2分別處理BNL CL.2細胞0、3、6、12、18、24 h，然后采用CCK-8法測定各組細胞活力。結(jié)果如圖2所示，40 μmol/L CdCl2作用BNL CL.2細胞6 h可顯著抑制細胞活力(P<0.05)，作用12 h后可極顯著抑制細胞活力(P<0.01)。

圖2 CdCl2作用不用時間對小鼠肝細胞活力的影響

2.3 HE染色

如圖3所示，40 μmol/L CdCl2處理小鼠肝細胞3和6 h后，少量細胞出現(xiàn)空泡變性，處理12 h后，肝細胞空泡變性明顯加重，細胞核固縮，部分細胞腫脹、死亡，上述病理變化在18和24 h處理組中更加明顯。以上結(jié)果表明40 μmol/L CdCl2對小鼠肝細胞可造成嚴重的損傷作用，該損傷作用會隨著處理時間延長而加劇。

圖3 HE染色法觀察CdCl2對小鼠肝細胞的損傷作用

2.4 Hoechst 33342染色

40 μmol/L CdCl2分別處理BNL CL.2細胞0、3、6、12、18、24 h，然后用Hoechst 33342染液染色，倒置熒光顯微鏡觀察各組細胞核的病理變化情況。結(jié)果如圖4所示，與對照組相比，CdCl2作用3 h后逐漸開始出現(xiàn)細胞核濃縮、斷裂等情況，隨著作用時間的增加，細胞核濃縮、斷裂的比例逐漸增加。

圖4 Hoechst 33342染色結(jié)果

2.5 CdCl2對小鼠肝細胞SOD活力的影響

如圖5所示，與空白對照組相比，40 μmol/L CdCl2作用于小鼠肝細胞6 h后，細胞SOD的活力極顯著降低(P<0.01)，隨著作用時間延長，SOD活力進一步受到抑制，表明肝細胞抗氧化能力受到了一定的抑制作用。

圖5 CdCl2對小鼠肝細胞SOD活力的影響

2.6 CdCl2對小鼠肝細胞MDA含量的影響

與空白對照組相比，40 μmol/L CdCl2作用于小鼠肝細胞6 h后，細胞MDA含量極顯著升高(P<0.01)，但隨著CdCl2作用時間延長，MDA含量逐漸降低，染毒18 h后，細胞內(nèi)MDA含量與空白對照組差異不顯著(P>0.05)。

圖6 CdCl2對小鼠肝細胞MDA含量的影響

3 結(jié)論與討論

鎘作為常見的環(huán)境污染物，其誘導的肝損傷作用通常與氧化應激及其伴隨的炎癥反應密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，40 μmol/L CdCl2作用6 h即可導致BNL CL.2細胞活力顯著下降(P<0.05)，隨著CdCl2作用時間延長，細胞活力進一步受到抑制。通過HE染色和Hoechst 33342染色發(fā)現(xiàn)，CdCl2作用6 h后，細胞形態(tài)即開始出現(xiàn)核濃縮、空泡變性等病理變化，當CdCl2作用時間進一步延長后，細胞空泡變性與核濃縮情況也隨之加重，這提示40 μmol/L CdCl2作用6 h后即可造成BNL CL.2細胞損傷。同時，BNL CL.2細胞經(jīng)40 μmol/L CdCl2處理6 h后，SOD活力即受到極顯著抑制(P<0.01)，隨著作用時間延長，SOD受到進一步抑制。然而，MDA在CdCl2處理6 h后顯著升高(P<0.01)，但隨著作用時間延長MDA含量逐漸恢復正常。

正常情況下，體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)常處于動態(tài)平衡之中，從而維持機體的新陳代謝[13]。當受到外來物質(zhì)刺激后，機體氧化與抗氧化平衡可被打破，此時，生物膜內(nèi)不飽和脂肪酸因受到自由基攻擊而發(fā)生脂質(zhì)過氧化損傷，其產(chǎn)物MDA具有明顯的細胞毒性，可作為評價細胞氧化應激損傷的重要指標[14]。本研究中，CdCl2處理的BNL CL.2細胞MDA含量顯著升高，表明鎘可導致肝細胞膜脂質(zhì)過氧化損傷，這與張文華等報道的結(jié)果一致[15]，但在本研究中，當CdCl2作用18～24 h，MDA含量盡管依然高于空白對照組，但與空白對照組相比差異不顯著(P>0.05)，這可能與細胞中MDA含量相對較低，導致組內(nèi)變異系數(shù)較大而導致組間差異不顯著。SOD能夠催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應生成O2和H2O2，其中H2O2可經(jīng)過氧化氫酶催化生成H2O，從而保護機體免受自由基的氧化損傷[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，CdCl2處理BNL CL.2細胞6 h即可顯著抑制SOD的活力，造成細胞氧化應激損傷，隨著作用時間延長，SOD可被進一步抑制，這與本課題組前期體內(nèi)試驗結(jié)果一致[18]。研究表明，細胞發(fā)生氧化應激時，SOD活力會顯著降低，而MDA含量則升高，細胞死亡率顯著升高[19]。陳嘉興等[20]研究發(fā)現(xiàn)，20 μmol/L鎘作用48 h可致HEK細胞發(fā)生氧化應激損傷，細胞SOD的活性顯著降低，同時MDA含量顯著升高，這與本研究結(jié)果一致。

綜上，本研究成功制備了鎘誘導的肝細胞損傷體外模型，證實鎘可誘導小鼠肝細胞發(fā)生氧化應激損傷，為深入探討鎘的肝細胞毒性提供了研究基礎(chǔ)。