喘息住院患兒病原學(xué)分析及臨床特征研究

李月紅，武敏，王宇清

1．江蘇省鹽城市婦幼保健院兒科，江蘇鹽城 224000；2.蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兒科，江蘇蘇州 215003

喘息是兒童呼吸道感染的常見癥狀。 有研究顯示， 呼吸道病毒感染與兒童喘息性疾病最為明確，80%是由呼吸道病毒感染所引起的[1]。 除病毒外，MP也是引起喘息發(fā)作的主要病原之一。 年齡與喘息有著密切的關(guān)系，嬰幼兒因為呼吸道的生理、解剖及免疫等有其特殊性，喘息的發(fā)生率明顯高于年長兒。季節(jié)與喘息也有一定的相關(guān)性。 有研究顯示喘息多發(fā)生在換季及秋、冬季，正是呼吸道感染的高發(fā)季節(jié)。為減少喘息的發(fā)作，必須盡早作出正確的評估，制訂有效的、合理的喘息治療及干預(yù)方案，從而降低反復(fù)喘息及發(fā)展為支氣管哮喘的概率。 該研究通過對2015 年1 月—2017 年12 月于蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院住院且表現(xiàn)有喘息癥狀的2 380 例患兒進行呼吸道的原學(xué)檢測， 了解不同的病原體在兒童喘息中的病原學(xué)分布、季節(jié)特征及其流行病學(xué)、臨床特征，為在臨床工作中合理用藥提供相應(yīng)的理論指導(dǎo)。 現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

方便選取于蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院住院治療中， 臨床特征有息癥狀的2 380 例患兒為研究對象， 該研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理會批準(zhǔn)， 患者家屬知情同意。其中，男1 616 例，女764 例；年齡29 d~13 歲。其中＜6 個月829 例、>6 個月～1 歲506 例，>1～3 歲664例，>3～4 歲255 例，≥5 歲126 例。

1.2 方法

1.2.1 資料采集 收集2 380 例患兒的年齡、 性別、住院時間等一般資料，臨床癥狀（發(fā)熱、咳嗽、紫紺、氣促、呼吸困難、鼻塞流涕等），實驗室檢驗、檢查等臨床資料。

1.2.2 標(biāo)本采集 ①痰標(biāo)本的采集：入院24 h 內(nèi)，采用無菌負壓抽吸痰液法， 將吸痰管經(jīng)過患兒鼻腔插入咽部以下， 吸取1～2 mL 分泌物置無菌生理鹽水中振蕩、混勻后，送痰病毒及hMPV、痰hBoV 及MPDNA、痰培養(yǎng)檢測。 ②血標(biāo)本的采集：患兒入院24 h內(nèi)抽取靜脈血分別行C 反應(yīng)蛋白（CRP）、白細胞計數(shù)及其分類、血清MP-IgM、IgG 等檢查。

1.2.3 7 種常見呼吸道病毒的檢測 采用直接免疫熒光法檢測流感病毒A、B 型（IVA、IVB）、呼吸道合胞病毒（RSV）、腺病毒（ADV）、副流感病毒。 試劑盒購自美國Chemicon 公司，按說明書進行操作，按照陽性的標(biāo)準(zhǔn)來判斷結(jié)果。 熒光顯微鏡為德國萊卡020-518.500。

1.2.4 RT-PCR 檢測hMPV 基因、hRV 基因 ①引物的設(shè)計、合成。 參考GenBank 中已發(fā)表hMPV 的全基因組序列， 設(shè)計合成擴增hMPV、hRV 的基因引物，引物序列為hMPV 1：5，-AACCGTGTACTAAGTGATGCACTC-3；hMPV 1r：5， -CATTGTTTGACCGGCCCCATAA-3；hRV-R：CAA AGT AGT CGG TCC CAT CC；hRV-F：TGG ACA GGG TGT GAA GAG C；hRV probe：FAM-TCC TCC GGC CCC TGA ATGTAMRA。 ②合成cDNA。 用6-隨機引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。③PCR 擴增。 將用上述引物置實時熒光PCR自動循環(huán)儀于60℃30 s，95℃5 min，95℃15 s，擴增大約40 個循環(huán)，儀器根據(jù)熒光曲線來判定最終陽性結(jié)果。

1.2.5 實時PCR 法檢測hBoV 基因、MP 基因 ①引物設(shè)計。 設(shè)計合成擴增hBoV、MP 的基因引物，引物序 列 為：hBoV -R：5’ -CAGATCCTTTTCCTCCTCCAATAC -3’；hBoV -F：5’ -TGACATTCAACTACCAACAACCTG -3’，hBoV -probe：AGCACCACAAAACACCTCAGGGG -TAMRA；MP -F：5’ -CCA ACCAAACAACAACGTTCA -3’；MP -R：5’ -ACCTTGACTGGAGGCCGTTA-3’；MP-probe 序列：5’-TCAACTCGAATAACGGTGACTTCTTACCACTG -3’。②PCR 擴增。 將DNA 3 μl 加RT 緩沖液2.5 μl，ddH2O 14.75 μl， 25 mM MgSO42 μl，dNTP 1 μl，0.25 μl Taq 酶，異物F、R 各0.5 μl，共25 μl，置實時熒光PCR 自動循環(huán)儀于56℃30 s，72℃30 s，94℃30 s，擴增40 個循環(huán)，儀器根據(jù)熒光曲線判定陽性結(jié)果。

1.2.6 血清MP 特異性抗體IgM、IgG 檢測 MP 試劑盒購自深圳亞輝龍生物科技有限公司，MP-IgM＞0.9 AU/mL 定為MP 近期感染。

1.2.7 細菌鑒定 抽取1 mL 左右的鼻咽部分泌物常規(guī)處理后接種于哥倫比亞選擇性培養(yǎng)基（巧克力、血平板平板各1 個），置5% CO2培養(yǎng)箱（35℃，18～24 h）中培養(yǎng)。 根據(jù)培養(yǎng)基上菌落特點、革蘭染色、顯微鏡下觀察、生物化學(xué)反應(yīng)等對細菌種類進行鑒定。

1.3 統(tǒng)計方法

應(yīng)用SPSS 20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。 符合正態(tài)分布的計量資料以（x±s）表示，非正態(tài)分布資料以[M（P25，P75）]表示，兩組之間比較采用秩和檢驗；計數(shù)資料以[n(%)]表示，行χ2檢驗及Fisher 精確檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 喘息住院患兒呼吸道病原檢出情況

2 380 例患兒中，呼吸道病原檢測陽性者1 339例，總檢出率56.3%。其中病毒檢測陽性者906 例（38.1%）；肺炎支原體（MP）檢測陽性者719 例（30.2%）；細菌檢測陽性者339 例（14.2%）。 混合感染479 例（20.1%）。

病毒檢測陽性者906 例中，呼吸道合胞病毒（RSV）395 例（16.6%）、人鼻病毒（hRV）347 例（14.6%）、人 博 卡 病 毒（hBoV）134 例（5.6%）、副 流 感 病 毒（Pinf）76 例（3.2%）、流感病毒（Ⅳ）22 例（0.9%）、腺病毒（ADV）11 例（0.5%）、人偏肺病毒（hMPV）8 例（0.3%）。

細菌檢測陽性者339 例， 檢出率高的前4 位細菌是肺炎鏈球菌（SP）223 例（9.4%），流感嗜血桿菌（HI）59 例（2.5%），卡他莫拉菌（MC）56 例（2.3%），金黃色葡萄球菌（SA）17 例（0.7%），其中單一細菌檢出311 例（13.1%），2 種以上細菌混合感染28 例（1.2%）。

混合感染479 例，其中病毒混合細菌116 例（4.9%），MP 混合病毒192 例（8.0%），MP 混合細菌49 例（2.1%），MP 混合病毒、細菌43 例（1.8%），單純病毒混合感染51 例（2.1%），單純細菌混合感染28例（1.2%）。 病毒混合細菌感染中，RSV 混合SP 感染檢出率最高，共28 例（1.2%）。 MP 混合病毒感染中，最常見是hRV（3.2%）；MP 混合細菌感染中，最常見的是混合SP 感染23 例（0.9%）；單純病毒混合感染中， 最 常 見 為hRV 混 合hBoV 感 染， 共29 例（1.2%）；單純細菌混合感染中，其中SP 混合MC 檢出率最高，共13 例（0.5%）。

2.2 不同年齡組喘息住院患兒病原特點

2 380 例患兒中，＜6 個月患兒829 例（34.8%），6 個月～1 歲患兒506 例（21.3%），＞1～3 歲患兒664例（27.9%），＞3～5 歲255 例 （10.7%），≥5 歲126 例（5.3%）。 在＜6 個月喘息患兒中以病毒感染最多見，檢出率為46.0%；6 個月～1 歲患兒以病毒感染為主，單一病原感染以MP（28.5%）最多見；＞1～3 歲以MP 感染（40.5%）最多見，其次為病毒（34.8%）；＞3～5 歲MP 感染最常見（47.1%），其次為病毒（27.1%）；≥5 歲年齡組患兒MP 感染檢出率高達49.2%。 見表1。

表1 不同年齡組病原種類分布[n（%）]Table 1 Distribution of pathogen species in different age groups[n（%）]

2.3 喘息住院患兒病原的季節(jié)及月份分布

3 年觀察期內(nèi)，2 380 例喘息住院患兒中，RSV在冬季檢出率最高，檢出率最高為42.3%；hRV 冬季檢出率最低；hBoV 夏季檢出率高，6～8 月份為流行高峰，2015 年7 月檢出率最高， 為15.4%；Pinf 夏季檢出率高，秋、冬季為低谷期；MP 全年散發(fā)，夏季為發(fā)病高峰期，其中2015 年夏季檢出率最高（48.7%）。見表2、圖1、表3。

表3 喘息住院患兒不同月份的病原檢出情況[n（%）]Table 3 Pathogen detection in hospitalized children with wheezing in different months[n（%）]

表2 喘息住院患兒常見病原的季節(jié)檢出率[n（%）]Table 2 Seasonal detection rate of common pathogens in hospitalized children with wheezing [n（%）]

2.4 不同病原喘息住院患兒臨床特征比較

比較5 種病原（RSV、hRV、hBoV、Pinf、MP）喘息住院患兒的臨床特征，MP 感染患兒年齡大；MP 感染與RSV、hRV、Pinf 感染組相比， 男性患兒少見；RSV 感染組、Pinf 感染組與hBoV 感染組相比，咳嗽癥狀更多見；MP 感染組與RSV、hBoV、Pinf 感染組相比，鼻塞流涕表現(xiàn)少；RSV 感染組與MP 感染組及hBoV 感染組相比， 出現(xiàn)發(fā)熱的比例低；hBoV 感染組、RSV 感染組與MP 感染組相比， 易出現(xiàn)氣促；hBoV 感染組中呼吸困難表現(xiàn)較MP 感染組更多見；與RSV 感染組、MP 感染組相比，紫紺在Pinf 感染組更多見；在濕疹史上，MP 感染組較RSV 感染組更多見；MP 感染組住院平均時間較其他4 組住院時間短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 見表4。

表4 不同病原喘息患兒臨床特征比較Table 4 Comparison of clinical characteristics of wheezing children with different pathogens

2.5 單純病毒感染組、 病毒混合細菌感染組、 單純MP 感染組、MP 混合細菌感染組、 病原學(xué)陰性組患兒的臨床特征比較

單純MP 感染組、MP 混合細菌感染組平均年齡偏大；單純病毒組、病毒混合細菌組、病原學(xué)陰性組與單純MP 感染組比較，男性多見；鼻塞流涕在單純病毒感染組更多見，但出現(xiàn)發(fā)熱的比例低；單純病毒感染組與單純MP 感染組相比，易出現(xiàn)氣促；病毒混合細菌感染組較單純MP 組、病原學(xué)陰性組，更易出現(xiàn)紫紺；病毒混合細菌感染組，較單純病毒組及病原學(xué)陰性組CRP 升高； 單純病毒感染組較單純MP組、病原學(xué)陰性組比較，住院時間長；單純MP 組、MP 混合細菌組與其他3 組相比，既往有喘息史更多見，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 見表5。

表5 單純病毒感染組、病毒混合細菌感染組、單純MP 感染組、MP 混合細菌感染組、病原學(xué)陰性組患兒的臨床特征比較Table 5 Comparison of clinical characteristics of children with simple virus infection group, virus mixed bacterial infection group, simple MP infection group, MP mixed bacterial infection group, and pathogen negative group

3 討論

喘息是呼吸道最常見的癥狀之一。 該研究納入因喘息住院的患兒共2 380 例， 其中病原檢出陽性率為56.3%， 進一步說明感染因素與兒童喘息發(fā)生關(guān)系密切。

其中病毒檢測陽性率為38.1%， 排在首位的病毒仍為RSV，總檢出率高達16.6%，在流行高峰月份的檢出率高達42.3%；其次為hRV、hBoV、Pinf，比例分別為14.6%、5.6%和3.2%。

MP 近年來被認為是僅次于病毒引起喘息的病原。尤其在嬰幼兒組，MP 感染臨床表現(xiàn)以喘息、痰鳴為主，在＜6 個月齡患兒中還可表現(xiàn)為氣促、青紫、低氧血癥[2]。韓國學(xué)者對反復(fù)喘息及MP 感染進行了長達10 年的研究，發(fā)現(xiàn)在肺炎支原體肺炎（MPP）中有10.4%的患者出現(xiàn)喘息，3.0%的患者出現(xiàn)反復(fù)喘息，提示MP 感染后易引起年幼兒童的喘息， 而且可引起今后的反復(fù)喘息[3]。 該研究顯示，MP 單病原陽性檢出率為30.2%， 為該研究檢出陽性率最高的單一病原，在流行月份最高檢出率可達48.7%。 國內(nèi)有研究該地區(qū)近9 年MP 感染陽性率30.3%， 且檢出率趨勢圖呈現(xiàn)周期性波動[4]，這和MP 每3~7 年發(fā)生一次社區(qū)流行或流行高峰[5]相吻合。

近年來，喘息與細菌的關(guān)系也受到關(guān)注。國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)， 嬰幼兒的喘息發(fā)生與SP、HI 及MC 有顯著的相關(guān)性，可能不受病毒感染的影響，并表示細菌可能是促發(fā)喘息的獨立因素[6]。該研究中共檢出細菌339 例，檢出率高達14.2%，其中SP 檢出率最高。但細菌感染引起喘息具體的作用及機制仍需進一步探討及研究。

該研究發(fā)現(xiàn)不同年齡組引起喘息的病原有所不同，年齡越小，病毒檢出的比例越高，此后隨著年齡的增長，MP 的檢出率不斷升高。國內(nèi)有研究發(fā)現(xiàn)0～1 歲患兒中RSV 檢出率最高，可能與年齡小，易感染病毒有關(guān)[7]。 HRV 更易感染無喘息史患兒及引起嬰幼兒喘息的發(fā)作[8]。 該研究顯示，大年齡組喘息兒童中也有相當(dāng)一部分病原為病毒，但主要是hRV。3 歲以上喘息住院患兒中病原檢出較高的為MP。不同的病原體感染具有明顯季節(jié)性[9-10]。該研究顯示，RSV 流行高峰與喘息的高發(fā)季節(jié)基本一致， 主要集中在冬季。 hRV 夏季檢出率高，流行月份檢出比例33.3%，國外學(xué)者Zeng SZ 等[11]研究報道hRV 流行高峰在9～11 月， 考慮可能和不同地區(qū)的氣候因素有關(guān)。VillaranMV 等[12]的研究得出Pinf 感染主要出現(xiàn)在秋季中期，RSV 感染與雨季及雨量均有關(guān)， 而Pinf 感染和雨量、 雨季呈負相關(guān)。 該研究提示MP 全年散發(fā)，夏季為發(fā)病高峰期，該結(jié)果與杭州地區(qū)基本一致[13]，與西安地區(qū)結(jié)果相反[14]，說明不同季節(jié)、不同地區(qū)喘息患兒感染的病原有所不同。

有研究顯示不同病原感染引起喘息的癥狀及嚴(yán)重程度有所不同。 Naja Z 等[15]經(jīng)過10 年的研究發(fā)現(xiàn)RSV 毛細支氣管炎的住院時間較非RSV 毛細支氣管炎住院時間長， 煙草暴露的患兒入PICU 概率及需要氧療比例均增加。 比較RSV 感染及MP 感染的臨床特點時，發(fā)現(xiàn)RSV 感染患兒年齡小，發(fā)熱以低熱為主， 而MP 感染引起喘息的患兒高熱的比例較高。 Pinf3 喘息癥狀輕， 但刺激性咳嗽癥狀更重[16]。Wolf DG 等[17]報 道 示 與RSV 感 染 相 比，hMPV 感 染毛細支氣管炎患兒的住院時間短、 氧療及入PICU的概率低，說明所致的病情較RSV 輕。 該研究數(shù)據(jù)中，MP 感染引起喘息的患兒年齡大，住院時間短，提示MP 感染喘息患兒臨床癥狀較輕。 發(fā)熱在MP 感染中更多見，其次為hBoV 感染組；氣促、呼吸困難表現(xiàn)多見于博卡病毒，其次為RSV 感染，這與之前研究結(jié)果一致[18]。

研究發(fā)現(xiàn)， 混合感染會加重喘息患兒的病情，Robledo-Aceves M 等[19]對134 例重癥喘息患兒的研究中，病毒與病毒混合感染為14.2%，其中最常見的為RSV 混合hRV 感染及RSV 混合Pinf 感染。 有研究揭示流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、肺炎鏈球菌的定植加大了合并hMPV 感染后喘息的發(fā)生[20]。 該研究顯示，與單純病毒感染相比，病毒混合細菌感染喘息患兒出現(xiàn)發(fā)熱的比例明顯增高， 同時CRP 增高，說明對于病毒感染引起喘息的患兒如病程中出現(xiàn)發(fā)熱、CRP 升高等征象，要考慮到合并細菌感染的可能性，需加強病原學(xué)的檢測。

綜上所述， 該研究提示喘息多發(fā)生在3 歲以下年齡組， 年齡越小， 病毒的檢出比例越高， 其中以RSV、hRV 感染為主。 不同年齡檢出病原體各不相同， 病毒是最主要的病原體，＜1 歲的喘息患兒以RSV、hRV 感染為主，大年齡組患兒喘息以MP 感染多見，其次為hRV。不同季節(jié)喘息患兒感染的病原體也有差異， 不同病原引起喘息患兒的臨床特點有所差別。