FGF15/FGFR4信號(hào)通路在利福平所致肝損傷中的作用及可能機(jī)制

涂倩倩 衛(wèi)霞 宋育林

利福平單用或與其他藥物聯(lián)用均可使部分患者出現(xiàn)不同程度的肝損傷[1]。膽汁淤積性肝損傷是其主要表現(xiàn)之一[2]，其所致肝損傷的機(jī)制可能與其對(duì)肝臟的藥物代謝酶(如CYP7a1等)和轉(zhuǎn)運(yùn)體的影響(如BSEP等)、氧應(yīng)激等影響有關(guān)[3]，但其確切機(jī)制仍不明確。

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子15(fibroblast growth factor 15，F(xiàn)GF15)可參與機(jī)體膽汁酸代謝，回腸末端分泌的FGF15到達(dá)肝臟后，與肝細(xì)胞表面的FGFR4結(jié)合，抑制膽固醇7α羥化酶(CYP7a1)的表達(dá)，從而減少膽汁酸的生成[4，5]；FGF15可通過(guò)調(diào)控ERK信號(hào)通路使MRP3和MRP4表達(dá)增加, 減輕膽汁淤積和肝損傷[6]。給予外源性FGF15可以改善膽總管結(jié)扎大鼠的肝功能[7]。本研究通過(guò)構(gòu)建利福平致小鼠肝損傷模型，探討FGF15/FGFR4信號(hào)通路在利福平所致藥物性肝損傷中的作用及可能機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

28只健康的SPF級(jí)雄性C57/BL6小鼠(鼠齡6～8周，體質(zhì)量18～22 g)，購(gòu)自杭州子源實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司；動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(浙)2019-0004。

二、實(shí)驗(yàn)材料和儀器

(一)藥品與試劑 利福平、BLU9931購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress公司；FGF15蛋白購(gòu)自CUSABIO公司；Mouse FGF15 ELISA試劑盒購(gòu)自武漢基因美生物科技有限公司；CYP7a1、FGFR4及BSEP抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

(二)儀器 全自動(dòng)生化分析儀為瑞士Roche Modular DPP產(chǎn)品；成像系統(tǒng)為美國(guó)阿爾法公司產(chǎn)品。酶標(biāo)儀為T(mén)hermo公司產(chǎn)品；化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)為上海嘉鵬科技有限公司產(chǎn)品；離心機(jī)為T(mén)hermo Fisher scientific公司產(chǎn)品。

三、方法

(一)實(shí)驗(yàn)分組 28只C57/BL6鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組、模型組、FGF15組和FGFR4抑制劑(BLU9931)組，每組7只。除正常組外，其余3組小鼠均予利福平(200 mg·kg-1·d-1)灌胃，連續(xù)7 d，制備小鼠肝損傷模型[8]。其中，F(xiàn)GF15組小鼠腹腔注射FGF15 (0.1 mg·kg-1·d-1)，連續(xù)7 d，其余3組注射等量0.9%NaCl；BLU9931組在第1天利福平灌胃前6 h予以BLU9931(10 mg/kg)灌胃1次，其余3組予相應(yīng)體積的溶劑灌胃。造模7 d后處死小鼠，以0.3%苯巴比妥鈉(10 mg/kg)腹腔注射麻醉后，摘除眼球取血，靜置、離心后取上清液，于-80℃冰箱凍存；再頸椎脫臼法處死小鼠，留取肝臟并稱濕重。將部分肝組織放置于4%甲醛中固定待做病理;剩余肝組織經(jīng)液氮速凍后，放置-80℃冰箱保存待用。

(二)計(jì)算小鼠肝指數(shù) 小鼠肝指數(shù)=(肝組織濕重÷小鼠體重)×100%。

(三)血清TBil、ALT、總膽汁酸(total bile acid,TBA)水平測(cè)定 全自動(dòng)化生化分析儀檢測(cè)血清TBil；用ALT、TBA試劑盒檢測(cè)血清ALT、TBA。

(四)肝組織TC、TG水平檢測(cè) 剪取凍存的肝組織按1∶9(g∶mL)相應(yīng)的PBS液制備肝組織勻漿，靜置后留取上清液，按試劑盒說(shuō)明測(cè)定肝組織TC、TG的水平。

(五)肝組織病理學(xué)觀察 將充分固定好的肝臟標(biāo)本分別依次進(jìn)行常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片及HE染色，在光鏡下觀察肝組織病理形態(tài)學(xué)改變并拍照。

(六)ELISA檢測(cè)肝組織勻漿FGF15的表達(dá) 剪取凍存的肝組織按1∶9(g∶mL)加入相應(yīng)的PBS液制備肝組織勻漿，靜置后留取上清液，按試劑盒說(shuō)明測(cè)定肝組織FGF15的表達(dá)情況。

(七)蛋白免疫印跡法檢測(cè)肝組織FGFR4、CYP7a1及BSEP蛋白的表達(dá) 提取適量肝組織總蛋白。BCA法檢測(cè)蛋白含量。加入 SDS-PAGE (5×) 蛋白上樣緩沖液混合后，沸水中煮沸3-5 min，使蛋白變性后放置-80 ℃ 冰箱中凍存待用。取適量蛋白樣品電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉，以 GAPDH(1∶2 000) 作為內(nèi)參，以抗 FGFR4抗體(1∶1000 ) 、抗CYP7a1抗體(1∶1000 )、抗BSEP抗體(1∶1000 )作為一抗孵育過(guò)夜。以相應(yīng)的二抗(1∶5 000)行室溫孵育2h，采用自動(dòng)曝光儀拍攝分析。以所需測(cè)定的目標(biāo)蛋白與相對(duì)應(yīng)的內(nèi)參GAPDH的灰度系數(shù)值比值(OD值)來(lái)表示目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、各組小鼠的一般情況和肝指數(shù)變化

實(shí)驗(yàn)期間，模型組、FGF15組及BLU9931組小鼠均出現(xiàn)不同程度的四肢黃染、行動(dòng)遲緩。其中正常組、模型組及FGF15組未出現(xiàn)死亡，BLU9931組死亡1只。

正常組、模型組、FGF15組及BLU9931組的肝指數(shù)分別為(5.86±1.27)%、(8.31±0.84)%、(8.29±1.21)%和(9.64±2.16)%；與正常組比較，模型組的肝指數(shù)顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，F(xiàn)GF15組的肝指數(shù)稍降低，BLU9931組的肝指數(shù)有所增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

二、各組間小鼠血清TBil、ALT、TBA水平變化

與正常組比較，模型組的TBil、ALT、TBA明顯升高(均P<0.01)；與模型組比較，F(xiàn)GF15組的TBil、ALT、TBA降低(均P<0.05)；BLU9931組的TBil升高(P<0.05)，ALT、TBA有所升高，但數(shù)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠血清TBil、ALT、TBA水平變化(±s)

三、各組小鼠肝組織TG、TC水平變化

與正常組比較，模型組肝臟TG、TCHO水平顯著升高(均P<0.01)。與模型組比較，F(xiàn)GF15組TG明顯下降(P<0.01)，TC略有下降(P>0.05)；BLU9931組TG、TCHO均略有升高(均P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠肝組織TG、TCHO水平變化(±s)

四、各組小鼠肝組織病理學(xué)改變

正常組小鼠肝細(xì)胞排列整齊，未見(jiàn)明顯變性和壞死。模型組小鼠肝細(xì)胞排列紊亂，有明顯空泡變性和脂肪變性，并可見(jiàn)點(diǎn)狀、灶性壞死和炎細(xì)胞浸潤(rùn)。FGF15組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)及排列基本正常，病理變化較模型組明顯減輕；BLU9931組小鼠肝細(xì)胞排列紊亂和空泡變性程度較模型組更為嚴(yán)重。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠肝組織光學(xué)顯微鏡下表現(xiàn)(HE×200)

五、各組小鼠肝組織勻漿FGF15水平

正常組、模型組、FGF15組和BLU9931組的肝組織FGF15表達(dá)量分別為(646.86±22.66)、(580.40±11.30)、(622.11±18.96)和(528.37±44.91)pg/g。

六、各組小鼠肝組織FGFR4、CYP7a1、BSEP蛋白表達(dá)情況

與正常組比較，模型組肝組織FGFR4、BSEP蛋白水平均降低(均P<0.01),CYP7a1水平升高(P<0.01)。與模型組比較，F(xiàn)GF15組FGFR4、BSEP水平升高(均P<0.01)，CYP7a1水平降低(P<0.01)；BLU9931組FGFR4、BSEP水平均降低(均P<0.05)，CYP7a1水平升高(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠肝組織FGFR4、CYP7a1、BSEP蛋白表達(dá)情況(±s)

討 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)利福平連續(xù)灌胃7 d后，小鼠四肢黃染、行動(dòng)遲緩，肝指數(shù)增加，血清ALT、TBA、TBil較正常組明顯升高，可見(jiàn)明顯的肝細(xì)胞空泡變性及脂肪變性，部分肝細(xì)胞內(nèi)見(jiàn)點(diǎn)狀、灶性壞死和炎細(xì)胞浸潤(rùn)，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[8]，表明利福平致小鼠肝損傷模型復(fù)制成功。

FGF15/FGF19是主要由回腸末端分泌的一種內(nèi)分泌因子，F(xiàn)GF15/FGF19與FGFR4結(jié)合參與肝臟膽汁酸、脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)[5，9，10]；FGF15/FGF19可以阻止非酒精性脂肪性肝炎的發(fā)生、發(fā)展，給予外源性FGF15可以降低膽總管結(jié)扎大鼠的TBA、ALT、AST水平[7，9，11]。本研究顯示，相對(duì)于正常組而言，模型組的TBil、TBA、ALT升高，肝細(xì)胞排列紊亂，可見(jiàn)明顯肝細(xì)胞空泡變性和脂肪變性，并見(jiàn)點(diǎn)狀、灶性壞死和炎細(xì)胞浸潤(rùn)；肝組織TG、TCHO水平升高，BSEP表達(dá)降低，CYP7a1表達(dá)升高。相對(duì)于模型組而言，F(xiàn)GF15組的血清TBil、TBA、ALT均降低，肝臟病理變化明顯減輕，肝組織TG水平降低，BSEP表達(dá)升高，CYP7a1降低；BLU9931組的血清TBIL升高，肝細(xì)胞空泡變性加重，肝組織BSEP表達(dá)降低，CYP7a1表達(dá)升高。表明利福平所致小鼠肝損傷主要表現(xiàn)為膽汁淤積及脂肪變性，F(xiàn)GF15可減輕利福平所致小鼠肝損傷，抑制FGF15下游受體FGFR4可致小鼠膽汁淤積及肝細(xì)胞變性壞死加重。FGF15/FGFR4信號(hào)通路在利福平所致小鼠肝損傷中的作用機(jī)制為：調(diào)節(jié)膽汁酸代謝和調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。FGF15/FGFR4信號(hào)通路可抑制CYP7a1的表達(dá)，使膽汁酸合成減少[5，9，12]；FGF15可增加MRP3和MRP4表達(dá)水平, 促進(jìn)膽汁酸的排出[6]。本研究顯示，相對(duì)于正常組而言，模型組的肝臟BSEP表達(dá)降低，F(xiàn)GF15組肝臟BSEP表達(dá)高于模型組，BLU9931組肝臟BSEP表達(dá)低于模型組。提示FGF15/FGFR4信號(hào)通路對(duì)肝臟BESP表達(dá)有調(diào)控作用， 其機(jī)制可能與FGF15/FGFR4信號(hào)通路激活下調(diào)NF-κB有關(guān)[9]，抑制NF-κB可以逆轉(zhuǎn)利福平和異煙肼合用所致的BSEP下調(diào)[13]。FGF15/FGF19 通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)參與脂質(zhì)合成的基因(Fas、Acly、Fatp4、SREBP1c等 )和脂質(zhì)攝取(Cd36等)來(lái)減輕脂肪變性[9，11]。

本研究表明，相對(duì)于正常組而言，模型組的肝臟FGF15、FGFR4表達(dá)降低。利福平導(dǎo)致肝臟FGF15、FGFR4下調(diào)的機(jī)制不明。既往文獻(xiàn)報(bào)道，原發(fā)性膽汁性膽管炎患者的肝細(xì)胞可以表達(dá)FGF19[10]；在酒精性肝炎患者肝臟膽管細(xì)胞FGF19 表達(dá)陽(yáng)性[12]。正常小鼠肝臟可檢測(cè)到FGF15，肥大細(xì)胞缺陷小鼠其肝臟FGF15水平下降，注射肥大細(xì)胞后肥大細(xì)胞缺陷小鼠肝臟FGF15水平增加；膽總管結(jié)扎的野生型小鼠肝內(nèi)膽管FGF15表達(dá)高于對(duì)照組，膽總管結(jié)扎的肥大細(xì)胞缺陷小鼠肝內(nèi)膽管FGF15表達(dá)下降，但與對(duì)照組之間無(wú)明顯差異[14]。利福平可抑制皮膚內(nèi)肥大細(xì)胞的活化[15]。

綜上所述，本研究證實(shí)了FGF15/FGFR4信號(hào)通路在利福平所致小鼠肝損傷中起著重要作用，通過(guò)對(duì)FGF15/FGFR4信號(hào)通路的干預(yù)可以減輕利福平所致的肝損傷程度，未來(lái)有望為利福平所致肝損傷藥物臨床治療提供新的技術(shù)靶點(diǎn)。