兩種栽培型廣藿香內(nèi)生真菌群落組成變化

王利國(guó)　肖晶晶　鄧月婷　崔業(yè)旋　劉志芬

摘要：為探索內(nèi)生真菌與廣藿香互作間對(duì)宿主活性成分形成機(jī)制的影響，該研究以成分差異較大的牌香和湛香為對(duì)象，采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法對(duì)所獲菌株歸類，通過(guò)真菌通用引物ITS1/ITS4擴(kuò)增菌株rDNAITS序列，鑒定其分類地位并研究其多樣性。結(jié)果表明：（1）用PDA和LBA培養(yǎng)基對(duì)苗期、分枝期和成株期廣藿香莖葉組織塊進(jìn)行內(nèi)生真菌分離，共獲得3 070株菌株，其中牌香（PX）分離出1 624株，鑒定出1 319株，分屬于36屬;湛香（ZX）分離出1 446株，鑒定出994株，分屬于33屬。牌香分離出7種特有內(nèi)生真菌，分別為香柱菌（Epichloe typhina）、盤長(zhǎng)孢狀刺盤孢菌（Colletotrichum gloeosporioides）、座腔孢菌（Botryosphaeria sp.）、絲核菌（Rhizoctonia sp.）及截盤多毛孢菌（Truncatella sp.），并首次分離到疫霉菌（Phytophthora sp.）和指疫霉菌（Sclerophthora sp.），這2種菌屬于卵菌門內(nèi)生菌。湛香分離出擬青霉菌（Paecilomyces sp.）和尾孢菌（Cercospora sp.）2種特有內(nèi)生真菌。（2）牌香和湛香優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌相同，均為鏈格孢菌（Alternaria sp.）和刺盤孢菌（Colletotrichum sp.），其中牌香中相對(duì)分離頻率為9.48%和7.81%，湛香為10.16%和8.65%。（3）從苗期到成株期，牌香和湛香內(nèi)生真菌定殖率逐漸增高，依次為牌香8月（97.78%）>7月（72.50%）>5月（55.28%）;湛香8月（91.11%）>7月（63.06%）>5月（46.67%）。平均定殖率為牌香75.19%，湛香66.95%。（4）隨著生長(zhǎng)期延長(zhǎng)，牌香和湛香內(nèi)生真菌多樣性呈遞增趨勢(shì)，同時(shí)2種廣藿香內(nèi)生真菌平均相似性系數(shù)為0.86?？梢姡葡愫驼肯銉?nèi)生真菌種類豐富，各有獨(dú)特的內(nèi)生真菌，且不同生長(zhǎng)期內(nèi)生真菌種群組成不同。該研究結(jié)果為篩選活性內(nèi)生真菌菌株，探究?jī)?nèi)生真菌影響廣藿香活性成分合成與積累奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 廣藿香， 栽培型， 牌香， 湛香， 內(nèi)生真菌， 群落組成

中圖分類號(hào)：Q949; R282.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：10003142（2022）05075309

Community composition changes of endophytic fungi

from two cultivated species of Pogostemon cablin

Abstract：In order to explore the effects of the interaction between endophytic fungi and patchouli on the formation mechanism of active components， a laboratory experiment was conducted for investigating the endophytic fungi of Pogostemon cablin cv. shipaiensis and P. cablin cv. zhanjiangensis with chemical component difference. The strains were classified by traditional morphological methods firstly， and then the rDNAITS sequences of the strains were amplified by the common fungal primer ITS1/ITS4 to identify their taxonomic status and their diversities. The results were as follows： （1） A total of 3 070 strains were isolated from the stem and leaf tissues of patchouli in seedling， branching and adult stages by PDA and LBA culture media. The 1 624 strains of endophytic fungi from P. cablin cv. shipaiensis were isolated and 1 319 strains were identified， which belonged to 36 genera. Seven endemic endophytic fungi were isolated from P. cablin cv. shipaiensis， including Epichloe typhina， Colletotrichum gloeosporioides， Botryosphaeria sp.， Rhizoctonia sp.， Truncatella sp.，Phytophthora sp.， and Sclerophthora sp.， and the later two belonging to Oomycete were isolated for the first time. There were 1 446 strains isolated from P. cablin cv. zhanjiangensis， and 994 strains were identified， which were belonging to 33 genera. Among them， there were two endemic endophytic fungi in P. cablin cv. Zhangjiangensis， including Paecilomyces sp. and Cercospora sp. （2） The dominant endophytic fungi were Alternaria sp. and Colletotrichum sp. in two kinds of cultivated patchouli. The relative separation frequencies of the Alternaria sp. and Colletotrichum sp. were 9.48% and 7.81% in P. cablin cv. shipaiensis， and were 10.16% and 8.65% in P. cablin cv. zhanjiangensis. （3） The colonization rates of endophytic fungi gradually increased with the growth of patchouli from seedling to adult stages， which were Aug.（97.78%） > Jul.（72.50%）> May（55.28%） in P. cablin cv. shipaiensis， and Aug.（91.11%） > Jul.（63.06%） > May（46.67%） in P. cablin cv. zhanjiangensis. The average colonization rates were 75.19% and 66.95%. （4） There were a positive correlation between the growth periods and the Shannon index， which increased with the growth of patchouli. The average sorenson similarity index was 0.86. Obviously， P. cablin cv. shipaiensis and P. cablin cv. Zhangjiangensis had a large population of endophytic fungi and had their own endemic endophytic fungi， but the community structure was significantly different. These results lay a foundation for screening active strains and exploring the effect of endophytic fungi on the synthesis and accumulation of active components of patchouli.C657C382-18B4-494A-8042-F7973D3AA0B0

Key words： Pogostemon cablin， cultivated type， P. cablin cv. shipaiensis， P. cablin cv. zhanjiangensis， endophytic fungi， community composition

廣藿香（Pogostemon cablin）為唇形科刺蕊草屬一年生芳香性草本植物，是廣東省道地藥材，著名“四大南藥”之一，具有芳香化濕、和胃止嘔、祛暑解表的功效（李薇和徐鴻華，2003）。廣藿香不僅是多種中成藥的主要原料，可用來(lái)提取廣藿香油，還是輕化工業(yè)的重要輔料。傳統(tǒng)上，廣藿香分4種栽培型：牌香（廣州產(chǎn)）、枝香（肇慶產(chǎn)）、湛香（湛江產(chǎn)）和南香（海南產(chǎn)），4種廣藿香形態(tài)差異明顯，尤以牌香和湛香為甚。徐頌軍等（2003）通過(guò)超薄等電聚焦電泳技術(shù)得出4個(gè)產(chǎn)地的廣藿香分為3個(gè)栽培品種，即石牌廣藿香[簡(jiǎn)稱牌香（P. cablin cv. Shipaiensis），用PX表示]、高要廣藿香[簡(jiǎn)稱湛香（P. cablin cv. Gaoyaoensi），用ZX表示]和湛江廣藿香（P. cablin cv. Zhanjiangensis）。牌香和枝香是廣藿香藥材的主要來(lái)源，而湛香和南香多用于提取精油。羅集鵬等（2001，2003）研究發(fā)現(xiàn)4種廣藿香中，牌香和枝香的廣藿香酮含量明顯高于湛香和南香，牌香最高。根據(jù)成分差異，通過(guò)葉綠體基因組蛋白編碼基因中保守的18S rRNA基因和進(jìn)化速率較快的matK基因序列比較，進(jìn)一步將4種廣藿香分成兩種化學(xué)型，即廣藿香酮化學(xué)型廣藿香，包括牌香和枝香;廣藿香醇化學(xué)型廣藿香，包括湛香和南香。劉玉萍等（2002）通過(guò)16S rRNA序列分析證明牌香和湛香廣藿香基因序列存在差異。

植物內(nèi)生真菌因長(zhǎng)期定殖于宿主組織內(nèi)部，與宿主植物協(xié)同進(jìn)化，二者形成了一種非常復(fù)雜的共生關(guān)系，并影響著宿主植物各種成分的積累和對(duì)脅迫的應(yīng)激反應(yīng)（Clay & Schardl， 2002）。目前，幾乎所有被研究過(guò)的植物中都能檢測(cè)到內(nèi)生真菌的存在，其分布廣、種類多，具有豐富的生物多樣性。同時(shí)，內(nèi)生真菌也存在宿主偏好或?qū)Ｒ恍?，不同的宿主或不同的生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)內(nèi)生真菌種群組成和定殖有明顯影響。藥用植物是挖掘活性內(nèi)生真菌資源的重要寶庫(kù)，其與宿主互作間產(chǎn)生的小分子次生代謝物對(duì)宿主的生長(zhǎng)發(fā)育、系統(tǒng)防御以及次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成具有關(guān)鍵調(diào)控作用（Jia et al.， 2016）。廣藿香作為廣東省道地藥材，目前已從牌香篩選出有活性的內(nèi)生真菌并對(duì)其化學(xué)成分（王沫等，2016a）、抗青枯?。ㄖx華蓉等，2017）、抗腫瘤（王沫等，2016b）、抗逆性（吳瑕，2013）等進(jìn)行了相關(guān)研究，由于未考慮廣藿香栽培型差異以及廣藿香生長(zhǎng)期不同，因此分離出的活性內(nèi)生真菌差異較大。牌香和湛香作為廣東省栽培面積最大的2種廣藿香，其成分差異明顯，由于活性成分形成機(jī)理尚未明確，因此影響了廣藿香品種的選育。廣藿香藥物成分多屬于倍半萜類，合成過(guò)程遵循類異戊二烯代謝途徑中的甲羥戊酸（MVA）途徑。彭淑萍等（2021）研究地黃（Rehmannia glutinosa）茉莉酸合成發(fā)現(xiàn)，丙二烯氧化物合酶（allene oxide synthase， AOS）和1 2-氧代植二烯酸還原酶（1 2oxophytodienoate reductase， OPR）基因的表達(dá)受內(nèi)生真菌調(diào)控，不同器官基因表達(dá)量不同。前期中藥種質(zhì)資源與分子鑒定研究團(tuán)隊(duì)（PI）對(duì)廣東省和云南省陽(yáng)春砂（Amomum villosum）內(nèi)生真菌多樣性研究發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)環(huán)境影響著兩地陽(yáng)春砂內(nèi)生真菌的群落組成，推斷出“土壤環(huán)境-內(nèi)生真菌定殖共生-宿主成分積累”形成模式（肖晶晶等，2020）。牌香和湛香因長(zhǎng)期種植于不同地理區(qū)域，其外觀形態(tài)及內(nèi)生真菌群落組成發(fā)生了明顯變化。為此，本研究以牌香和湛香為材料，探究2種廣藿香不同生長(zhǎng)期內(nèi)生真菌的群落組成以及種群的動(dòng)態(tài)變化，為深入了解內(nèi)生真菌在廣藿香藥物合成機(jī)理中的作用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 樣品采集與處理

牌香采自廣州市蘿崗區(qū)（現(xiàn)黃埔區(qū)蘿崗鎮(zhèn)）廣州市香雪制藥股份有限公司廣藿香GAP基地;湛香采自湛江市遂溪縣烏塘鎮(zhèn)廣藿香種植合作社，按照苗期、分枝期和成株期3個(gè)生長(zhǎng)階段采樣。牌香采樣時(shí)間為苗期（5月10日，PX1）、分枝期（7月14日，PX2）、成株期（8月20日，PX3）;湛香采樣時(shí)間為苗期（5月21日，ZX1）、分枝期（7月5日，ZX2）和成株期（8月7日，ZX3），各采樣30株。采樣方式按照5點(diǎn)取樣法隨機(jī)挖取健康植株帶回，剪短分裝于密封袋中冰箱保存。材料經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)賀紅教授鑒定為廣藿香。從材料中隨機(jī)選取莖枝5段，摘取葉后用水洗凈，莖剪成長(zhǎng)度5 cm， 葉剪成2.5 cm × 2.5 cm的組織塊。組織塊置于含75%乙醇的燒杯中浸泡3 min、無(wú)菌水沖洗3次后，置于加入Tween20的0.1%升汞浸泡，莖浸泡2 min，葉浸泡3 min。浸泡期間不斷攪動(dòng)，讓組織塊與殺菌液充分接觸，取出用無(wú)菌水沖洗3次，每次2 min、用無(wú)菌濾紙吸干水分，無(wú)菌條件下將組織塊剪成大小約0.5 cm × 0.5 cm備用。

1.2 培養(yǎng)和分離

分階段從處理后的組織塊中隨機(jī)選取120個(gè)貼于PDA和利馬豆（LBA）平板中，LBA配置參照左豫虎（2004）的方法。以各組織塊正反面滾動(dòng)或平鋪培養(yǎng)基表面2 min后取出為對(duì)照，平板置于25 ℃恒溫恒濕下暗培養(yǎng)，隔天觀察，當(dāng)組織塊周圍有菌絲長(zhǎng)出時(shí)，將其挑出培養(yǎng)，單孢分離純化，純化后的菌株編號(hào)后接種于試管中，2～5 ℃下冷藏保存，用于菌株的分類鑒定。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 內(nèi)生真菌鑒定

按照魏景超（1979）的《真菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。形態(tài)學(xué)鑒定主要包括菌落形態(tài)、菌絲特征、分生孢子梗形態(tài)、孢子形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及產(chǎn)孢方式等。不產(chǎn)孢的菌株參考Sutton（1980）的方法，首先進(jìn)行促孢培養(yǎng)，產(chǎn)孢后按上述方法進(jìn)行鑒定。分子鑒定參考Barnett & Hunter（1987）和Ellis（1988）的方法確定所獲菌株的分類地位?？侱NA提取選用改良的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法（王桂娥，2015），引物對(duì)為ITS1（5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′）和ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′），擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，合格后送廣州擎科生物有限公司測(cè)序。所獲序列與NCBI上的已知序列進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)序列的相似度和覆蓋率，接合菌株的形態(tài)學(xué)特征確定其分類地位。C657C382-18B4-494A-8042-F7973D3AA0B0

1.4 數(shù)據(jù)處理

定殖率常用來(lái)衡量植物中內(nèi)生真菌的豐度，而相對(duì)分離頻率（isolation frequency， IF）則用來(lái)衡量植物中某一類內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)度。分別按此公式計(jì)算：定殖率=（內(nèi)生真菌感染的組織塊數(shù)/總組織塊數(shù)）SymboltB@

100%;相對(duì)分離頻率=（分離到的某屬或種的菌株數(shù)/分離到的總菌株數(shù)）SymboltB@

100%（Yuan et al.， 2011）。

利用SPSS 21.0軟件的皮爾森相關(guān)系數(shù)（Pearson correlation coefficient）法對(duì)2種廣藿香內(nèi)生真菌定殖率和相對(duì)分離頻率相關(guān)性進(jìn)行分析，若方差齊性，則采用單因素方差分析（oneway anova）中的Turkey HSD檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析（P<0.05）。方差齊性采用levene檢驗(yàn)。當(dāng)P<0.05時(shí)，差異顯著。

Shannon指數(shù)（H′）反映了植物內(nèi)生真菌的物種多樣性，計(jì)算公式為H′= -∑ki=1Pi×InPi。式中：Pi指某一種類內(nèi)生真菌的數(shù)量占全部?jī)?nèi)生真菌數(shù)量的百分比。

相似性系數(shù)（Sorenson index）（Cs）常用來(lái)比較兩種植物之間內(nèi)生真菌組成的相似程度，計(jì)算公式為Cs=2j / （a + b） 。式中： j指牌香和湛香共有的內(nèi)生真菌種類;a和b則指每種廣藿香所有的內(nèi)生真菌種類（Spellerberg & Fedor， 2003）。

2結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌的定殖率和分離株數(shù)

3個(gè)生長(zhǎng)階段，從牌香和湛香莖葉的2 160個(gè)組織塊中，共獲得內(nèi)生真菌菌株3 070株，鑒定出2 203株。其中，牌香獲得1 319株，湛香994株。牌香內(nèi)生真菌的平均定殖率為75.19%，湛香為66.95%。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出：隨著廣藿香從苗期到成株期，內(nèi)生真菌定殖率逐漸增高，牌香依次為8月（97.78%）>7月（72.50%）>5月（55.28%）;湛香為8月（91.11%）>7月（63.06%）>5月（46.67%），卡方檢驗(yàn)呈顯著性差異（P < 0.05）（圖1）。3個(gè)采樣階段，牌香內(nèi)生真菌的定殖率均高于湛香。從分離出的菌株數(shù)發(fā)現(xiàn)，隨著廣藿香生長(zhǎng)期延長(zhǎng)，牌香和湛香內(nèi)生真菌的菌株數(shù)均呈遞增趨勢(shì)，其中，從牌香獲得的菌株數(shù)依次為8月（702株）>7月（574株）>5月（348株）;從湛香獲得內(nèi)生真菌菌株數(shù)為8月（662株）>7月（478株）>5月（306株）。從苗期到成株期，牌香內(nèi)生真菌獲得菌株數(shù)均高于湛香（圖2）。

2.2 內(nèi)生真菌的分類地位

所有經(jīng)過(guò)分子鑒定的菌株ITS序列已提交到GenBank。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，從牌香獲得的1 624株菌株中鑒定出1 319株，從湛香1 446株中鑒定出994株，屬于40個(gè)種屬（表1）。牌香中特有的內(nèi)生真菌有香柱菌（Epichloe typhina）、盤長(zhǎng)孢狀刺盤孢菌（Colletotrichum gloeosporioides）、座腔孢菌（Botryosphaeria sp.）、絲核菌（Rhizoctonia sp.）、截盤多毛孢菌（Truncatella sp.）。通過(guò)LBA培養(yǎng)，從牌香中分離到卵菌門（Oomycota）疫霉菌屬（Phytophthora sp.）內(nèi)生菌53株和指疫霉菌屬（Sclerophthora sp.）內(nèi)生菌32株。湛香有2種特有的內(nèi)生真菌，分別為擬青霉菌（Paecilomyces sp.）和尾孢菌（Cercospora sp.）。

牌香和湛香的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌種類相差不大，但相對(duì)分離頻率差異明顯。優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌均為鏈格孢菌和刺盤孢菌，占已鑒定菌株數(shù)的9.77%和8.17%。其中，鏈格孢菌和刺盤孢菌在牌香的相對(duì)分離頻率為9.48%和7.81%，在湛香為10.16%和8.65%。其次，鐮刀菌（Fusarium sp.）、青霉菌（Penicillium sp.）、暗色座腔孢菌（Phaeocytostroma sp.） 與木霉菌（Trichoderma sp.）內(nèi)生真菌也較多，相對(duì)分離頻率遠(yuǎn)超過(guò)其他內(nèi)生真菌（表1）。

2.3 內(nèi)生真菌的多樣性和相似性

5—8月，隨著廣藿香從苗期到成株期的生長(zhǎng)，牌香和湛香內(nèi)生真菌多樣性均呈遞增的趨勢(shì)。牌香Shannon指數(shù)依次為5月3.17、7月3.28、8月3.42;湛香Shannon指數(shù)為5月3.21、7月3.30、8月3.35，2種廣藿香呈現(xiàn)出豐富的內(nèi)生真菌群落組成多樣性（表1）。同時(shí)，牌香和湛香內(nèi)生真菌相似性系數(shù)不完全相同。牌香3個(gè)采樣時(shí)間段，內(nèi)生真菌群落組成的相似性系數(shù)為0.87～0.97，湛香為0.97～0.98，而牌香與湛香內(nèi)生真菌群落組成相似性系數(shù)介于0.75～0.86之間。相似性系數(shù)最高的是湛香內(nèi)生真菌，5月份與8月份是0.97，7月份與8月份為0.98。內(nèi)生真菌相似性系數(shù)最低的是5月份的牌香與湛香，為0.75（表2）。表明牌香和湛香不同生長(zhǎng)階段內(nèi)生真菌群落組成相對(duì)穩(wěn)定，但同一生長(zhǎng)期牌香與湛香內(nèi)生真菌的群落組成差異明顯，尤以苗期為甚。

3討論與結(jié)論

內(nèi)生真菌群落的組成結(jié)構(gòu)與宿主關(guān)系密切，不同屬宿主內(nèi)生真菌群落組成差異性較大，甚至同屬植物之間內(nèi)生真菌也不完全一樣（Chen et al.， 2013）。一方面，宿主內(nèi)生真菌呈現(xiàn)豐富的物種多樣性，另一方面，宿主對(duì)內(nèi)生真菌的定殖往往具有一定的選擇性和偏好性。Arnold（2007）研究指出，高緯度地區(qū)內(nèi)生真菌豐富度遠(yuǎn)高于低緯度地區(qū)，高緯度地區(qū)以糞殼菌綱（Sordariomycetes）為主，低緯度地區(qū)以座囊菌綱（Dothideomycetes）真菌較多。一些常見的糞囊菌綱內(nèi)生真菌，如刺盤孢菌、莖點(diǎn)霉菌（Phoma sp.）、擬莖點(diǎn)霉菌（Phomopsis sp.）和炭角菌目（Xylariales）在植物莖葉內(nèi)均能分離到，但葉點(diǎn)霉菌（Phyllosticta sp.）只分布在葉中，鐮刀菌不能從葉中分離得到（Herrera et al.， 2010;Márquez et al.， 2010）。從本研究對(duì)牌香和湛香的分離結(jié)果可以看出，82.23%的內(nèi)生真菌屬于糞囊菌綱，10.04%屬于座囊菌綱，另有7.73%屬于卵菌門卵菌綱（Oomycetes）內(nèi)生真菌。2種廣藿香優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌均為刺盤孢菌和鏈格孢菌，但刺盤孢菌在牌香中相對(duì)分離頻率遠(yuǎn)高于湛香，其中，牌香獲得162株，湛香86株。鏈格孢菌是較例外的內(nèi)生真菌，該菌屬于座囊菌綱真菌。Rosa等（2009） 從南極發(fā)草（Deschampsia antarctica）中分離出1株鏈格孢屬內(nèi)生真菌，認(rèn)為座囊菌綱下的格孢菌目（Pleosporales）鮮受環(huán)境影響，是草本植物中較為普遍的內(nèi)生真菌。本研究從牌香中獲得125株鏈格孢菌，湛香中獲得101株，差異不大，表明鏈格孢菌受緯度的影響較小，應(yīng)普遍存在于草本植物中。除2種優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌外，鐮刀菌、青霉菌、暗色座腔孢菌及木霉菌相對(duì)分離頻率也較高，這些次優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌多屬于子囊菌門（Ascomycota）糞囊菌綱或有絲分裂真菌（mitosporic fungi），這些腐生菌常存于各類植物組織間營(yíng)腐生生活。藥用植物各有不同的入藥部位，且不同部位藥效差異較大。周仁超等（2014）研究認(rèn)為不同內(nèi)生真菌有各自喜好的組織部位，不同部位間內(nèi)生真菌群落構(gòu)成并非完全一樣。本研究發(fā)現(xiàn)在廣藿香整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中，葉組織塊分離到的內(nèi)生真菌種類和數(shù)量明顯多于莖，葉內(nèi)生真菌群落豐度高于莖器官。C657C382-18B4-494A-8042-F7973D3AA0B0

不同生長(zhǎng)期宿主內(nèi)生真菌群落組成并不相同，內(nèi)生真菌與宿主生長(zhǎng)之間處在一種動(dòng)態(tài)平衡之中。依牌香和湛香來(lái)看，苗期牌香中未分離獲得的殼二孢菌（Ascochyta sp.）、粘盤孢菌（Colletogloeum sp.）、小叢殼菌 （Glomerella sp.）、盤單毛孢菌（Monochaetia sp.）、莖點(diǎn)霉菌及輪枝孢菌（Verticillium sp.），在7月和8月樣品中分離獲得，且分離頻率逐漸增高，此時(shí)，牌香正處于從分枝期到成株期的生長(zhǎng)階段，也是廣藿香藥物成分積累的重要時(shí)間節(jié)點(diǎn)。同樣，湛香中的穆氏節(jié)絲殼菌

（Arthrocladiella mougeotii）只在7—8月生長(zhǎng)期間獲得，苗期未有定殖。這些受溫度影響晚定殖的“溫敏性內(nèi)生真菌”，其同屬中的一些種甚至可以造成植物病害，屬于病原真菌。這些“溫敏性內(nèi)生真菌”相對(duì)分離頻率比其它內(nèi)生真菌低，但在影響廣藿香成分積累中的作用不可忽視。除了牌香和湛香共有的內(nèi)生真菌外，我們從3 070株菌株中也獲得了2種廣藿香各自特有的一些內(nèi)生真菌，其中，

牌香分離出7種特有內(nèi)生真菌，包括香柱菌（Epichloe typhina）、座腔孢菌（Botryosphaeria sp.）、盤長(zhǎng)孢狀刺盤孢菌（Colletotrichum gloeosporioides）、絲核菌（Rhizoctonia sp.）、截盤多毛孢菌（Truncatella sp.）4種屬于子囊菌門的內(nèi)生真菌以及疫霉菌（Phytophthora sp.）和指疫霉菌（Sclerophthora sp.）2種卵菌門卵菌。湛香中分得尾孢菌（Cercospora sp.）和擬青霉菌（Paecilomyces sp.）2種特有內(nèi)生真菌。香柱菌是存在于野生禾草類植物中較常見的內(nèi)生真菌，其代謝物影響著宿主植物種子萌發(fā)及活性成分的積累（烏日罕等，2018）。進(jìn)一步研究這些“溫敏性內(nèi)生真菌”和特有內(nèi)生真菌在宿主活性成分合成機(jī)制中的作用有特別的意義。

除宿主本身外，宿主的生活環(huán)境也影響著宿主內(nèi)生真菌群落構(gòu)成及豐度。3個(gè)生長(zhǎng)階段的牌香與湛香，無(wú)論從定殖率、分離株數(shù)、多樣性指數(shù)比較，牌香內(nèi)生真菌豐度高于湛香，但2種廣藿香變化趨勢(shì)基本相同，隨著生長(zhǎng)期延長(zhǎng)，內(nèi)生真菌定殖率夏季高于春季，且Shannon指數(shù)（H′）逐漸增加，呈現(xiàn)出成株期>分枝期>苗期。這一結(jié)果與呂立新等（2014）研究草本藥用植物茅蒼術(shù)（Atractylodes lancea）內(nèi)生真菌群落隨季節(jié)變化一致。而Gao等（2005）研究拐棗（Hovenia acerba）內(nèi)生真菌群落變化發(fā)現(xiàn)春季拐棗內(nèi)生真菌種類多于夏季，這從一個(gè)側(cè)面反映出一年生草本植物可能與木本植物內(nèi)生真菌群落變化并不完全一樣。 本研究結(jié)果表明牌香和湛香中含有豐富的內(nèi)生真菌，牌香的豐度更高。這兩種栽培型廣藿香內(nèi)生真菌群落構(gòu)成受到宿主、生長(zhǎng)期、氣候等因子影響。牌香和湛香內(nèi)生真菌群落組成及變化特征為進(jìn)一步了解牌香和湛香藥性差異奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯李莉）

收稿日期：2021-02-10

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81373901）; 國(guó)家中醫(yī)藥管理局全國(guó)中藥資源普查項(xiàng)目（GZYKJS2018004，GZYKJS2019003）;國(guó)家公共衛(wèi)生服務(wù)補(bǔ)助資金項(xiàng)目（財(cái)社[2016]44號(hào)） [Supported by National Natural Science Foundation of China（81373901）; National Survey on Chinese Materia Medica Resources of State Administration of Traditional Chinese Medicine （GZYKJS2018004，GZYKJS2019003）; Special Subsidy Fund for National Public Health Service（CS[2016] No. 44） ]。

第一作者： 王利國(guó)（ 1966-） ，博士，主要從事藥用植物資源與開發(fā)研究，（ Email）wanglg@gzucm.edu.cn。C657C382-18B4-494A-8042-F7973D3AA0B0