吉林地區(qū)非結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定情況分析

高菲?周亞麗

摘? 要：目的? 了解吉林地區(qū)非結(jié)核分枝桿菌（NTM）病的確診率及各菌種所占比例、地域性特點及分布情況，對本地區(qū)NTM病的診斷、治療和整體防治規(guī)劃起到至關(guān)重要的作用。方法? 采集2017～2019年吉林地區(qū)的NTM菌株3768株，采用分枝桿菌基因組快速提取試劑盒和獵陣分枝桿菌（16種）菌種鑒定試劑盒（膜芯片法），對NTM進行基因分型，鑒定到分枝桿菌種屬，以便臨床醫(yī)生對患者更合理用藥進行治療，避免耽誤最佳治療時期。結(jié)果? 2017～2019年吉林地區(qū)NTM病確診率分別為0.68/10萬、0.86/10萬、1.19/10萬;在3768株分枝桿菌中，NTM病所占比例為2.68%（101/3768）;將101例NTM病的菌株進行菌型鑒定，占比最多的是胞內(nèi)分枝桿菌，為40.59%（41/101），其次為堪薩斯分枝桿菌，為26.73%（27/101）;地域分布：2017～2019年農(nóng)村的確診率為3.23/10萬，城市的確診率為1.55/10萬;年齡分布：60歲以上NTM病患者占72.3%（73/101）。結(jié)論? 吉林地區(qū)NTM病確診率近幾年呈上升趨勢，地域性分布特點為農(nóng)村高于城市;感染人群以老年人居多，本地區(qū)NTM病致病菌以胞內(nèi)分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌為主。

關(guān)鍵詞：非結(jié)核分枝桿菌;菌種鑒定;PCR分子生物學(xué)技術(shù)

中圖分類號：R446.5 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1009-8011（2022）-11-00-03

非結(jié)核分枝桿菌（NTM）是指除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（包括人型分枝桿菌、牛型分枝桿菌、非洲型分枝桿菌、田鼠型分枝桿菌）和麻風(fēng)分枝桿菌以外的其他分枝桿菌[1]。近年來，NTM病呈快速增多趨勢，并且已經(jīng)成為威脅人類健康的重要公共衛(wèi)生問題。為應(yīng)對NTM病日益增多的形勢，提高對NTM病的診斷治療和整體預(yù)防控制水平，減少NTM對人類生命健康的威脅。中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會于2012年撰寫了《非結(jié)核分枝桿菌病診斷與治療專家共識》，詳細(xì)介紹了世界各國NTM病的發(fā)病情況和流行趨勢。我國近年來尚未有大樣本NTM病的流行病學(xué)調(diào)查資料。1990年和2000年全國結(jié)核病抽樣流調(diào)結(jié)果顯示，NTM分別為4.9%和11.1%，在發(fā)現(xiàn)的NTM中具有致病性的就有30余種，我國沿海地區(qū)的NTM發(fā)病率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于內(nèi)陸地區(qū)，并且致病的NTM種類也不相同[2]。了解本地區(qū)NTM病的確診率及各菌種所占比例及流行趨勢情況，并對患者信息進行統(tǒng)計和分析，得出相應(yīng)結(jié)論，對本地區(qū)NTM病的診斷、治療、預(yù)防控制及防治規(guī)劃的制定起到至關(guān)重要的作用。本研究對吉林地區(qū)2017～2019年全部分枝桿菌培養(yǎng)陽性菌株（3768株）進行鑒定、基因分型，鑒定到分枝桿菌種屬。現(xiàn)報道如下。

1? 資料與方法

1.1? 一般資料

收集吉林地區(qū)2017～2019年保留的分枝桿菌培養(yǎng)陽性菌株，共3768株（來源包括吉林地區(qū)9個縣市區(qū)結(jié)防所、吉林市結(jié)核病防治研究所全部結(jié)核網(wǎng)報患者培養(yǎng)陽性菌株），用傳統(tǒng)方法進行菌種鑒定，同時采用結(jié)核分枝桿菌基因組快速提取試劑盒和獵陣分枝桿菌（16種）菌種鑒定試劑盒，進行基因分型實驗，鑒定NTM到分枝桿菌種屬。

1.2? 實驗方法

（1）結(jié)核分枝桿菌基因組快速提取。吸取1 mL已滅菌的菌液加入到裂解管中離心5 min;吸棄上清（吸棄玻璃珠層以上液體，吸棄液體時不要碰到玻璃珠）;在裂解管中加入100 uL裂解液TF（TF每次使用時要搖勻并即刻取用）;恒溫振蕩儀上水平振蕩10 min，95 ℃;離心3 min，上清即為分枝桿菌提取的基因組，可作為聚合酶連反應(yīng)（PCR）擴增模板。2～8 ℃保存。（2）獵陣分枝桿菌（16種）菌種鑒定。①PCR擴增：擴增體系為20 uL，即將17 uL擴增反應(yīng)液和3 uL模版DNA分別加入PCR管中，渦旋離心數(shù)秒備用。擴增程序為50 ℃、2 min;95 ℃、4 min;（94 ℃、30 s，53 ℃、45 s，72 ℃、20 s）、35個循環(huán);（94 ℃、30 s，68 ℃、45 s，72 ℃、20 s）、20個循環(huán);4 ℃，hold。完成擴增反應(yīng)后，PCR產(chǎn)物可立即檢測，如果不能立即檢測則置于-18 ℃以下保存，并且在1周內(nèi)完成檢測。②分枝桿菌菌種鑒定膜芯片檢測：按照儀器及試劑盒說明書進行操作。（3）判讀分枝桿菌的種類。當(dāng)膜芯片上2條陽性質(zhì)控（HC、PC）探針均為陽性，陰性質(zhì)控（NC）探針陰性時，認(rèn)定本次結(jié)果有效。然后將各菌種鑒定探針的顯色斑點位置的結(jié)果與表1進行比對。結(jié)果判讀見表1。

1.3? 觀察指標(biāo)

當(dāng)膜芯片上HC、PC探針位置正常顯色，且NC探針位置為陰性時，根據(jù)膜芯片上顯色斑點的位置，讀取相應(yīng)的檢測結(jié)果。若NTM探針出現(xiàn)顯色位點，NTM菌種鑒定探針同時出現(xiàn)顯色點，則說明為相應(yīng)的NTM為陽性。例如：膜芯片上HC、PC探針位置正常顯色，NC探針位置為陰性時，NTM探針位置出現(xiàn)顯色斑點，同時，堪薩斯分枝桿菌探針位置也出現(xiàn)顯色斑點，則可以判定，該NTM菌種鑒定為堪薩斯分枝桿菌。若NTM探針出現(xiàn)顯色斑點，NTM菌種鑒定探針位置沒有出現(xiàn)顯色斑點，則說明可能為檢測范圍外的其他分枝桿菌。例如：膜芯片上HC、PC探針位置正常顯色，NC探針位置為陰性時，NTM探針位置出現(xiàn)顯色斑點，而NTM菌種鑒定探針沒有出現(xiàn)顯色斑點，則可以判定該患者感染了NTM，并且是檢測范圍外的其他分支桿菌。若結(jié)核分枝桿菌（MTB）探針出現(xiàn)顯色位點，則說明結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性。即膜芯片上HC、PC探針位置正常顯色，NC探針位置為陰性時，MTB探針位置出現(xiàn)顯色斑點，則可以判定該患者感染了MTB。若菌種鑒定探針出現(xiàn)多個顯色位點，則說明為多種分枝桿菌陽性。例如：膜芯片上HC、PC探針位置正常顯色，NC探針位置為陰性時，MTB探針位置出現(xiàn)顯色斑點，同時，NTM探針位置出現(xiàn)顯色斑點，并且胞內(nèi)分枝桿菌探針位置也出現(xiàn)顯色斑點，則可以判定該患者混合感染了MTB和NTM，并且該NTM菌種鑒定為胞內(nèi)分枝桿菌。通過肉眼判讀膜芯片上的顯色斑點位置，判定NTM菌種類型，分別統(tǒng)計數(shù)量，計算出吉林地區(qū)NTM病的確診率及各菌種類型所占比例，并且對患者信息進行統(tǒng)計分析，得出NTM病的地域分布情況及年齡結(jié)構(gòu)情況。

2? 結(jié)果

2017～2019年吉林地區(qū)分離培養(yǎng)陽性菌株3768株，對所有分離培養(yǎng)陽性菌株同時進行傳統(tǒng)方法菌型鑒定和PCR分子生物學(xué)技術(shù)（分枝桿菌菌種鑒定膜芯片法）的菌種鑒定，傳統(tǒng)方法菌型鑒定出的MTB株數(shù)為3661株，NTM株數(shù)為100株，實驗污染為7株;PCR分子生物學(xué)技術(shù)鑒定出的MTB株數(shù)為3772株，NTM株數(shù)為101株，其中5株菌株利用分子生物學(xué)方法檢測MTB和NTM都存在。經(jīng)重復(fù)試驗，判定這5株菌株為MTB和NTM混合感染，傳統(tǒng)方法菌型鑒定與PCR分子生物學(xué)技術(shù)鑒定具有較高的一致性。

將3768株菌株，經(jīng)過分枝桿菌菌種鑒定膜芯片檢測進行菌型鑒定后，NTM株數(shù)為101株，在全部分枝桿菌中，NTM所占比例為2.68%（101/3768），按照年份統(tǒng)計，2017年25例、2018年32例、2019年44例，按照吉林地區(qū)人口370萬、分離出NTM菌株的人數(shù)計算（NTM病確診率=NTM病培養(yǎng)陽性人數(shù)/總?cè)丝跀?shù)×100000/10萬），2017～2019年吉林地區(qū)NTM病確診率分別為0.68/10萬、0.86/10萬、1.19/10萬。對比分析得出，2017～2019年吉林地區(qū)NTM病的確診率呈逐年上升趨勢。

在101株NTM菌株中，胞內(nèi)分枝桿菌為41株，所占比例為40.59%（41/101）;堪薩斯分枝桿菌為27株，所占比例為26.73%（27/101）;鳥型分枝桿菌5株，所占比例為4.95%（5/101）;恥垢分枝桿菌和膿腫分枝桿菌均為4株，所占比例均為3.96%（4/101）;偶然分支桿菌和次要分枝桿菌均為2株，所占比例均為1.99%（2/101）;其他NTM（膜芯片法檢測范圍以外的其他分枝桿菌）為16株，所占比例為15.84%（16/101）。其中5例為混合感染菌株，4例為人型分枝桿菌與胞內(nèi)分枝桿菌混合感染，1例為人型分枝桿菌與膿腫分枝桿菌混合感染。

將101例NTM病患者的信息進行統(tǒng)計，地域分布：2017～2019年農(nóng)村確診率為3.23/10萬（84例患者，260萬人口），城市確診率為1.55/10萬（17例患者，110萬人口），吉林地區(qū)NTM病的地域性分布特點為農(nóng)村人口確診率高于城市人口確診率;年齡分布：60歲以上73例，40～59歲22例，40歲以下6例，吉林地區(qū)NTM病感染人群是老年人多于年輕人。

3? 討論

由NTM感染導(dǎo)致的疾病統(tǒng)稱NTM病，NTM病與結(jié)核病有相同或高度相近的病原菌形態(tài)、臨床特點、病理和影像特點，在結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家，NTM病誤診成結(jié)核病屢見不鮮[3]，甚至因治療效果不佳歸類于耐藥結(jié)核病或致多系統(tǒng)傳播性感染[4-5]。當(dāng)患者出現(xiàn)抗結(jié)核治療效果差，反復(fù)抗酸桿菌檢測陽性時，醫(yī)生要考慮是NTM的感染，應(yīng)該對標(biāo)本進行分子生物學(xué)方法檢測[6-8]。

2017～2019年吉林地區(qū)NTM病確診率分別為0.68/10萬、0.86/10萬、1.19/10萬。目前NTM病是以NTM培養(yǎng)陽性為臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，NTM培養(yǎng)陽性患者為確診患者[1，9]。吉林地區(qū)NTM病的確診率呈逐年上升趨勢，分析原因：臨床醫(yī)生對NTM病的認(rèn)識提高;實驗方法的改進和新技術(shù)的應(yīng)用，尤其是PCR檢測技術(shù)應(yīng)用于菌種鑒定，大大提高檢出率;以及高齡人群、艾滋病患者等易感人群的增多使NTM病確診率有所升高[10]。地域不同，NTM菌株流行分布特點不同。我國不同地區(qū)的相關(guān)研究結(jié)果顯示，常見的致病性NTM為鳥-胞

內(nèi)分枝桿菌復(fù)合體、膿腫分支桿菌、堪薩斯分枝桿菌[11-12]。有研究顯示，我國北方是NTM病的多發(fā)地區(qū)，最常見NTM為胞內(nèi)分枝桿菌[13]。本研究中的101株NTM，最多的是胞內(nèi)分枝桿菌，比例為40.59%，其次為堪薩斯分枝桿菌，比例為26.73%，與我國北方菌株流行分布特點一致。對NTM病患者信息進行統(tǒng)計，吉林地區(qū)NTM病的地域性分布特點為農(nóng)村發(fā)病率高于城市，其原因可能與生活習(xí)慣、自然環(huán)境及飲用水有關(guān)，使農(nóng)村人口在NTM環(huán)境中的暴露機會遠(yuǎn)大于城市人口。NTM病感染人群是以60歲以上的老年人為主，主要是老年人既往有慢性疾病者偏多，或長期應(yīng)用激素致使機體抵抗力下降，導(dǎo)致一部分條件致病菌感染致病。

關(guān)于NTM病的治療，以胞內(nèi)分枝桿菌病的治療為例，大多數(shù)一線抗結(jié)核藥物，比如異煙肼和吡嗪酰胺，對胞內(nèi)分枝桿菌都天然耐藥，藥物對胞內(nèi)分枝桿菌的體外活性比對結(jié)核分枝桿菌的體外活性降低10～100倍，而大環(huán)內(nèi)酯類藥物（克拉霉素和阿奇霉素）卻是胞內(nèi)分枝桿菌治療中不可替代的藥物，是胞內(nèi)分枝桿菌病治療的核心藥物[14-15]。2020年新版胞內(nèi)分支桿菌屬肺病診療指南[16]推薦，初治患者采用“克拉霉素+利福霉素+乙胺丁醇”三藥聯(lián)合方案，對于進展性、難治性的耐藥患者可酌情增加氨基糖苷類藥物。也有研究顯示莫西沙星是抗胞內(nèi)分枝桿菌屬作用最強的氟喹諾酮類藥物[17]。NTM病的治療要遵循的重要原則是要在NTM菌種鑒定基礎(chǔ)上選擇合理的治療方案，做到不同的NTM病應(yīng)給予不同的治療方案。

綜上所述，在重點人群中及時篩查診斷，選擇適當(dāng)治療方案是降低NTM對高危人群健康危害的最有效手段。因此，鑒別MTB和NTM，并對NTM進行菌型鑒定，指導(dǎo)臨床醫(yī)生做出準(zhǔn)確的診斷，避免耽誤最佳治療時期，對NTM病患者給予準(zhǔn)確治療方案減輕負(fù)擔(dān)，以及對NTM病的防治規(guī)劃制定都起到至關(guān)重要的作用。

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