低濃度二硫蘇糖醇處理紅細(xì)胞消除抗CD38單抗 對輸血前相容性試驗的干擾
——附2例多發(fā)性骨髓瘤病例檢測結(jié)果報告

張永麗

作者單位：226400 江蘇南通，如東縣人民醫(yī)院輸血科

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是以克隆性漿細(xì)胞異常增殖為主要表現(xiàn)的惡性血液系統(tǒng)疾?。?］，MM患者漿細(xì)胞異常增生，分泌大量單克隆免疫球蛋白（M蛋白）或本周氏蛋白（Bence Jones蛋白，游離的單克隆性κ或λ輕鏈）。MM發(fā)病率在造血系統(tǒng)惡性腫瘤中排名第二，發(fā)病人數(shù)約為造血系統(tǒng)惡性腫瘤患者總數(shù)的10%［2］。MM患者的中位生存期約為3～4年，該疾病危害較大。CD38抗原在骨髓瘤細(xì)胞中高表達，目前臨床常用抗CD38（通用名達雷妥尤單抗）治療MM，CD38抗原在正常人群的紅細(xì)胞中低表達，因此抗CD38會對任何基于抗人球蛋白試劑的檢測方法產(chǎn)生干擾，且進行一次 抗CD38治療后，干擾將長期存在。如東縣人民醫(yī)院收治2例使用抗CD38治療的MM患者，通過多次試驗尋找二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）的最低濃度，使其既能消除抗CD38干擾，還可保留其他紅細(xì)胞系統(tǒng)抗原，防止發(fā)生不規(guī)則抗體漏檢，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 病例資料

1.1.1 病例1 本院血液科住院患者，男性，70歲，2020年無明顯誘因出現(xiàn)泡沫尿，同年12月出現(xiàn)右側(cè)肋骨、右側(cè)肩胛骨、左側(cè)髖關(guān)節(jié)疼痛。2020年 12月—2021年1月先后在南通市腫瘤醫(yī)院和蘇州大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診，診斷為MM，且進行多次VRD-Lite方案化療，期間多次輸血，未出現(xiàn)配血困難現(xiàn)象?；颊咭蚧熜Ч患?，與2021年4月14日 改為PD化療方案，在化療第1天、第8天、第15天、第22天使用抗CD38單抗1000 mg治療。2021年 7月21日患者因病情加重，轉(zhuǎn)至本院血液科住院治療，檢測血紅蛋白（hemoglobin，Hb）47 g/L,主治醫(yī)生開具輸血申請單至輸血科。

1.1.2 病例2 本院重癥監(jiān)護病房（intensive care unit，ICU）住院患者，女性，59歲，診斷為MM 5年余，于2021年10月復(fù)發(fā)，在南通大學(xué)附屬醫(yī)院血液科治療，治療期間使用抗CD38治療，具體用藥方案家屬不能準(zhǔn)確描述。3 d前住院期間病情加重，遂自行出院，于12月1日轉(zhuǎn)入本院ICU，初步診斷為1型呼吸衰竭、急性腎損傷、MM、骨和骨髓繼發(fā)性惡性腫瘤。12月3日查Hb為67 g/L，主治醫(yī)生開具輸血申請單至輸血科。

1.2 試劑與儀器 ABO、RhD血型定型檢測卡（批號：20210202、20210501），ABO血型反定型試劑紅細(xì)胞（批號：2021070101、2021090301），抗人球蛋白檢測卡（用于抗體篩查，批號：20210101、20210503）， 不規(guī)則抗體篩選試劑紅細(xì)胞1（批號：20210403），不規(guī)則抗體篩選試劑紅細(xì)胞2（批號：20210603），不規(guī)則抗體篩選試劑紅細(xì)胞3（批號：20210901），不規(guī)則抗體篩選試劑紅細(xì)胞4（批號：20211101），抗人球蛋白檢測卡（用于交叉配血，批號：20210301），以上試劑均為長春博迅生物制品有限公司產(chǎn)品。木瓜酶、DTT為德國BioFroxx公司產(chǎn)品，配制成1.0%木瓜酶試劑和0.2 mol/L DTT試劑。FYQ型試劑卡孵育器，TD-A型血型血清學(xué)用離心機購自長春博研科學(xué)儀器有限責(zé)任公司。SC-2546型低速離心機購自安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗方法 對患者常規(guī)進行ABO、RhD血型鑒定、抗人球蛋白檢測卡交叉配血，配血不合則加做不規(guī)則抗體篩查試驗（鹽水法和抗人球蛋白檢測卡法），不規(guī)則抗體篩查試驗陽性則加做不規(guī)則抗體鑒定試驗，同時加做直接抗人球蛋白試驗以及自身對照。獲得試驗結(jié)果后，向臨床詢問病史以及用藥史，獲悉為MM患者，且使用過抗CD38治療。根據(jù)《CD38單克隆抗體對輸血相容性檢測干擾及其應(yīng)對方案的專家共識》［3］，采用木瓜酶二步法，使用DTT處 理不規(guī)則抗體篩選紅細(xì)胞和獻血員紅細(xì)胞后再次進行抗體篩查試驗和抗人球蛋白檢測卡交叉配血試驗。

1.3.1 木瓜酶二步法 參考文獻［4］，1.0%酶工作液與洗滌紅細(xì)胞按1∶1比例混合，37 ℃孵育10 min， 至少洗滌3次，制備成濃度為0.8%～1.0%的紅細(xì)胞懸液，使用酶處理的紅細(xì)胞進行不規(guī)則抗體篩查試驗和抗人球蛋白檢測卡交叉配血試驗。

1.3.2 DTT處理紅細(xì)胞 操作步驟參考文獻［5］，不同濃度的DTT和PBS洗滌的壓積紅細(xì)胞以4∶1比例混合，37 ℃孵育40 min，每5 min混勻1次，使用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌4次，用PBS配制成濃度為0.8%～1.0%的紅細(xì)胞懸液，用DTT處理的紅細(xì)胞進行不規(guī)則抗體篩查試驗和抗人球蛋白檢測卡交叉配血試驗。

2 結(jié)果

2.1 血型 病例1：ABO血型B型，正反定型相符，Rh（D）陽性。病例2：ABO血型A型，正反定型相符，Rh（D）陽性。

2.2 交叉配血 病例1：抗人球蛋白檢測卡交叉配血不合，主側(cè)2+，次側(cè)陰性。病例2：抗人球蛋白檢測卡交叉配血不合，主側(cè)2+，次側(cè)陰性。

2.3 不規(guī)則抗體篩查試驗、自身對照、直接抗人球試驗 病例1：不規(guī)則抗體篩查試驗結(jié)果可見，鹽水法陰性，抗人球蛋白檢測卡法陽性，見圖1A；兩批次6個譜細(xì)胞凝集強度均為2+；自身對照陰性，直接抗人球蛋白試驗陰性。病例2：不規(guī)則抗體篩查試驗結(jié)果可見，鹽水法陰性，抗人球蛋白檢測卡法陽性；兩批次6個譜細(xì)胞凝集強度均為2+；自身對照陰性，直接抗人球蛋白試驗陰性。

2.4 木瓜酶二步法 木瓜酶處理不規(guī)則抗體篩選紅細(xì)胞和獻血員紅細(xì)胞后，再進行不規(guī)則抗體篩查試驗?？谷饲虻鞍讬z測卡法依舊為陽性，2例患者4批次12個譜細(xì)胞凝集強度均為2+，抗人球蛋白檢測卡交叉配血試驗結(jié)果仍為不合，主側(cè)凝集強度2+，次側(cè)陰性。

2.5 DTT處理不規(guī)則抗體篩選紅細(xì)胞和獻血員紅細(xì)胞 分別采用濃度為0.200 mol/L、0.020 mol/L、0.002 mol/L、0.005 mol/L的DTT處理不規(guī)則抗體篩選紅細(xì)胞和隨機10個ABO同型獻血員紅細(xì)胞后，進行不規(guī)則抗體篩查試驗，采用抗人球蛋白檢測卡法和抗人球蛋白檢測卡交叉配血，結(jié)果均為陰性。見圖1B～1C。

圖1 DTT處理前以及0.002 mol/L、0.005mol/L DTT處理后抗體篩查結(jié)果

3 討論

MM是漿細(xì)胞惡性增殖性血液系統(tǒng)疾病，發(fā)病率約為（1～2）/10萬，MM患者數(shù)約占血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者總數(shù)的10%，多見于中老年，男性患者多于女性。臨床上常見的MM有免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）型、免疫球蛋白A（IgA）型和輕鏈型，其中輕鏈型MM相較于前兩者，由于總蛋白（total protein，TP）、球蛋白（globulin，GLB）水平正常，Ig水平正?；蚪档?，容易漏診或誤診［6］。由于漿細(xì)胞惡性增生、骨髓廣泛浸潤和大量單克隆Ig的出現(xiàn)和沉積，從而引起溶骨性骨骼破壞、貧血、高鈣血癥、腎功能不全等臨床表現(xiàn)（即“CRAB”癥狀）［7］。約50%的MM患者因貧血待查和全血細(xì)胞減少首診于血液科，首診癥狀以骨痛、腰椎痛多見，骨痛合并腎功能不全者次之［8］。MM的治療以溫和性化療為主，患者中位生存期為3～4年。

CD38抗原是一個相對分子質(zhì)量為45000的單鏈跨膜糖蛋白，整體結(jié)構(gòu)分為N末端短的細(xì)胞質(zhì)尾，單次跨膜域和C段長的胞外區(qū)［9］。CD38抗原作為受體還參與細(xì)胞黏附與跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。CD38抗原在正常淋巴細(xì)胞、骨髓來源細(xì)胞和一些非造血組織中表達較低，而淋巴細(xì)胞和骨髓來源的血液惡性腫瘤則過度表達CD38抗原，因此CD38抗原是理想的免疫治療靶點?？笴D38以CD38為靶抗原，通過補體依賴性細(xì)胞毒性作用、抗體依賴性細(xì)胞毒性作用和凋亡等多種機制，清除表達CD38分子的腫瘤細(xì)胞［10］，聯(lián)合來那度胺、地塞米松治療MM的應(yīng)答率達到58.3%，為復(fù)發(fā)及難治性骨髓瘤患者帶來了希望［11］。因此抗CD38單抗可作為治療難治性MM的推薦用藥。人紅細(xì)胞較骨髓瘤細(xì)胞低表達CD38，抗CD38單抗也可與紅細(xì)胞上的CD38抗原結(jié)合。目前我國較多醫(yī)院的輸血科和檢驗科采用抗人球蛋白檢測卡進行交叉配血和抗體篩查試驗，抗CD38干擾此類試驗，表現(xiàn)為不規(guī)則抗體篩查試驗全陽、交叉配血全部不合。

另一方面，剛使用抗CD38單抗時患者直接抗人球試驗結(jié)果為陽性，但通常一周后，患者直接抗人球試驗變?yōu)殛幮?。分析直接抗人球試驗轉(zhuǎn)陰的可能原因有以下幾點：① 抗CD38單抗改變了患者紅細(xì)胞CD38抗原的親和力；② 抗CD38單抗減弱了CD38抗原的表達［12］；③ 抗CD38與紅細(xì)胞結(jié)合后，能快速清除體內(nèi)小紅細(xì)胞碎片［13］。不規(guī)則抗體篩查試驗全陽性，一方面導(dǎo)致配血困難，另一面可掩蓋同種抗體的存在，盲目輸血可能導(dǎo)致嚴(yán)重的溶血性輸血反應(yīng)，造成對患者生命健康的威脅。另外，患者直抗陽性、自身對照陰性，且有多次輸血經(jīng)歷，又非常容易被誤判為血漿中存在高頻抗原抗體，輸血科無法找到相容性血液而不敢向臨床發(fā)血，導(dǎo)致延誤患者輸血治療，同樣危及患者生命安全?？笴D38單抗的影響周期非常久，可達半年以上［14］。

2020年多家期刊發(fā)表了抗CD38干擾配血相關(guān)論文，可見抗CD38單抗給臨床輸血帶來了很大的困擾。人CD38抗原屬于Ⅱ類跨膜糖蛋白，細(xì)胞膜外的二硫鍵是維持其空間結(jié)構(gòu)的主要化學(xué)鍵。 0.200 mol/L濃度的DTT能裂解CD38分子位于細(xì)胞外的二硫鍵，破壞了CD38分子的結(jié)構(gòu)，使之失去與抗CD38結(jié)合的槽位。這種作用同樣發(fā)生在細(xì)胞外存在二硫鍵的其他抗原分子，如Kell、Cartwright、 LW、Dombrock和Knops血型系統(tǒng)抗原。0.002 mol/L的DTT可以使Jsa和Jsb抗原變性，而不破壞其他抗原系統(tǒng)內(nèi)抗原分子的結(jié)構(gòu)，從而保留其與相應(yīng)抗體結(jié)合的功能［5］。

本研究通過對0.200 mol/L DTT多次稀釋至濃度為0.005 mol/L，處理不規(guī)則抗體篩選細(xì)胞4批次，處理獻血員紅細(xì)胞20人份，均獲得陰性結(jié)果?？梢娫摑舛鹊腄TT即可破壞CD38抗原［15］，無需使用0.200 mol/L DTT處理紅細(xì)胞，最大限度保留其他抗原系統(tǒng)中抗原的完整性，極大程度上保證了不規(guī)則抗體的檢出，防止抗體的漏檢，保障交叉配血的安全性和有效性。CD38單克隆抗體對輸血相容性檢測的干擾及其應(yīng)對方案的專家共識中提到多種排除抗CD38干擾的方法［3］，筆者也嘗試用酶處理紅細(xì)胞，但結(jié)果并不理想。凝聚胺攜帶正電荷，可與CD38分子中的羧基結(jié)合，從而阻止抗CD38與之結(jié)合，從而排除干擾［3］。但筆者認(rèn)為凝聚胺對弱抗體易漏檢，敏感度不如抗人球蛋白檢測卡方法。

對于存在抗CD38干擾的患者，先用低濃度DTT處理不規(guī)則抗體篩選細(xì)胞，確認(rèn)抗體篩查陰性后再常規(guī)使用凝聚胺交叉配血，才能保障交叉配血的安全性。由于本研究案例較少，僅有2例，且距離抗CD38治療最短時間都超過1個月，0.005 mol/L DTT對于剛治療患者的消除干擾作用未能驗證，因此筆者認(rèn)為，在患者進行治療之前進行不規(guī)則抗體篩查以及抗體鑒定實驗，是對此類患者安全輸血提供保障的有效措施。

利益沖突作者聲明不存在利益沖突