3-苯甲?；愣顾氐暮铣杉翱鼓[瘤活性研究

孫小雅，劉 騰，孫 捷，王曉靜

(山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院) 藥物研究所，山東 濟(jì)南250000)

目前，癌癥是全球第二大死亡原因[1]，中國的新增癌癥病例數(shù)和癌癥死亡人數(shù)均居世界首位。癌癥是由正常細(xì)胞的異常增殖引起的，大多數(shù)抗癌藥物通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡[2-3]來殺死癌細(xì)胞。香豆素類化合物是一種具有苯并α-吡喃核的天然化合物，被廣泛報道具有抗菌[4-5]、抗凝血[6]、抗炎[7]、抗氧化[8]等活性，近年來也逐漸發(fā)現(xiàn)其在抗腫瘤方面有活性[9-12]，特別是對結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞[13-15]，抗腫瘤活性較好。例如2018年，Guo等[16]設(shè)計合成了一個香豆素類化合物A(圖1)，發(fā)現(xiàn)A對Hela、SKOV3、A549、OVCA429、OVCA433、A2780、MDA-MB-231、MCF-7、KB 等細(xì)胞株都表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗增殖活性，IC50值為0.5 ～ 143 nmol·L-1，它能夠明顯誘導(dǎo)A2780細(xì)胞早期凋亡，對細(xì)胞周期影響較小，具有顯著的抗癌活性。2018年，Gomha課題組[17]設(shè)計合成了3-苯甲酰基香豆素B(圖2)，發(fā)現(xiàn)其對肝細(xì)胞癌(HepG2)細(xì)胞具有較好的抑制活性。

圖1 化合物A的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of compound A

圖2 化合物B的結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of compound B

本文改進(jìn)了課題組原有的合成3-苯甲?；愣顾氐暮铣煞椒╗18]，以4-甲基哌啶替代吡啶，與原方法相比，反應(yīng)速度加快且更加符合綠色化學(xué)的要求，并采用MTT法對合成的化合物進(jìn)行了抗癌活性研究。

1 實(shí)驗部分

1.1 儀器與試劑

DF101S 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀BUCHIR-200， 瑞士Bruker公司； 真空干燥箱DZF-6050，上海精宏實(shí)驗設(shè)備有限公司; 循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；ZF-6型三用紫外線分析儀，上海嘉鵬科技有限公司；Bruker AM-600核磁共振儀，瑞士Bruker公司；DLZ-100多功能酶標(biāo)儀，南京迪樂嘉生物科技有限公司。

4-氟苯甲醛，苯甲醛，5-羥基苯甲醛， 2-羥基-5-甲氧基苯甲醛，3-甲氧基苯甲醛，4-甲基苯甲醛，6-甲氧基苯甲醛，3,5-二叔丁基苯甲醛，3-氟苯甲醛， 4羥基苯甲醛， 3,4-二甲氧基苯甲酰乙酸乙酯，2,3,4,5-四氟苯甲酰乙酸乙酯，3-甲基苯甲酰乙酸乙酯，4-氟苯甲酰乙酸乙酯，2-氟苯甲酰乙酸乙酯，4-三氟甲基苯甲酰乙酸乙酯，甲醇，乙酸乙酯，石油醚，二氯甲烷。除非另有說明，所有溶劑和試劑均可在市場上獲得，使用時無需進(jìn)一步純化。

1.2 步驟

化合物1-21的合成路線如圖3所示，所合成的化合物如表1所示：其中化合物1、2、5、7、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20等15個化合物均為新化合物。

圖3 3-苯甲?；愣顾匮苌锏暮铣煞磻?yīng)式Fig.3 General synthetic route of 3-benzoylcoumarin derivatives

表1 3-苯甲?；愣顾匮苌?/p>

1.2.1 目標(biāo)化合物1-21的合成

以3-(3′,4′-二甲氧基苯甲?；?-7-氟香豆素(化合物1)的合成為例：100 mL的三口反應(yīng)瓶中，加入1.4 g (10 mmol) 4-氟水楊醛，2.52 g (10 mmol) 3 , 4-二甲氧基苯甲酰乙酸乙酯，30 mL甲醇，加2-3滴4-甲基哌啶作為催化劑，然后60 ℃加熱回流攪拌2 h。TLC 監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，反應(yīng)液倒在冰水中(100 mL)。固體析出，抽濾，用冷水沖洗幾次，得粗品。粗產(chǎn)物用二氯甲烷或甲醇重結(jié)晶，真空干燥箱干燥。采用相同的方法得到化合物2-21。

3-(3′,4′-二甲氧基苯甲?；?-7-氟香豆素(1): 淡黃色固體， 產(chǎn)率: 85.36%;1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ8.33 (s, 1H), 7.91 (dd,J= 8.7, 6.3 Hz, 1H), 7.57 (dd,J= 8.4, 2.0 Hz, 1H), 7.48 (dt,J= 4.8, 2.6 Hz, 2H), 7.32 (td,J= 8.7, 2.5 Hz, 1H), 7.06 (d,J= 8.5 Hz, 1H), 3.84 (d,J= 28.0 Hz, 6H);13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ189.64 (s), 164.52 (s), 157.61 (s), 155.24 (s), 153.91 (s), 148.75 (s), 145.75 (s), 131.64 (s), 131.57 (s), 128.67 (s), 125.40 (s), 115.35 (s), 112.78 (s), 112.62 (s), 111.04 (s), 103.9 (s), 55.8 (s), 55.64 (s); MS:m/z：[M+H]+329.080 6 [M+Na]+351.062 7。

3-(2′,3′,4′,5′-四氟苯甲?；?-香豆素(2): 淡黃色固體，產(chǎn)率: 63.98%；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ8.69 (s, 1H), 7.96 (dd,J= 7.7, 1.4 Hz, 1H), 7.92～7.83 (m, 1H), 7.83～7.74 (m, 1H), 7.51 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 7.49～7.42 (m, 1H);13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ185.07 (s), 157.64 (s), 154.51 (s), 148.27 (s) ,134.75 (s) , 130.6 (s) , 125.4 (s) , 124.84 (s) , 118.03 (s) , 116.31 (s) , 112.48 (s), 112.34 (s);MS:m/z：[M+H]+323.029 1 [M+Na]+345.009 9。

3-(3′-甲基苯甲?；?-7-氟香豆素(3): 淡黃色固體，產(chǎn)率: 85.82%；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ8.40 (s, 1H), 7.94 (dd,J= 8.7, 6.4 Hz, 1H), 7.76～7.69 (m, 2H), 7.52～7.46 (m, 2H), 7.43 (t,J= 7.6 Hz, 1H), 7.32 (td,J= 8.7, 2.5 Hz, 1H), 2.38 (s, 3H)；13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ191.49 (s), 163.83 (s), 157.56 (s), 144.59 (s), 138.11 (s), 136.05 (s), 134.38 (s), 131.87 (s), 131.80 (s), 129.68 (s), 128.47 (s), 126.65 (s), 125.21 (s), 115.3 (s), 112.76 (s), 103.93 (s), 20.61 (s)； MS:m/z：[M+H]+283.046 2 [M+Na]+305.027 6.

3-(3′-甲基苯甲?；?-香豆素(4) 淡黃色固體，產(chǎn)率: 83.3%;1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ8.40 (s, 1H), 7.86 (dd,J= 7.7, 1.4 Hz, 1H), 7.77～7.72 (m, 3H), 7.52～7.48 (m, 2H), 7.45～7.41 (m, 2H), 2.38 (s, 3H)；13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ191.68 (s), 157.87 (s), 154.04 (s), 144.84 (s), 138.14 (s), 136.07 (s), 134.42 (s), 133.38 (s), 129.69 (s), 129.65 (s), 128.51 (s), 126.66 (s), 126.49 (s), 124.76 (s), 118.18 (s), 116.23 (s), 20.62 (s); MS:m/z：[M+H]+265.057 9 [M+Na]+287.039 2。

3-(3′-甲基苯甲酰基)-6-羥基香豆素(5) 淡黃色固體，產(chǎn)率: 81.43%；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ9.85 (s, 1H), 8.30 (s, 1H), 7.76～7.65 (m, 2H), 7.50 (d,J= 7.5 Hz, 1H), 7.43 (d,J= 7.6 Hz, 1H), 7.36～7.30 (m, 1H), 7.19～7.12 (m, 2H), 2.37 (s, 3H)；13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ192.02 (s), 158.26 (s), 154.09 (s), 147.51 (s), 144.78 (s), 138.24 (s), 136.22 (s), 134.51 (s), 129.75 (s), 128.63 (s), 126.74 (s), 126.66 (s), 121.60 (s), 118.76 (s), 117.25 (s), 113.52 (s), 20.75 (s)； MS:m/z：[M+H]+281.051 4 [M+Na]+303.033 7。

3-(3′,4′-二甲氧基苯甲酰基)-8-甲氧基香豆素(6) 淡黃色固體，產(chǎn)率: 87.05%；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ8.31 (s, 1H), 7.56 (dd,J= 8.4, 2.0 Hz, 1H), 7.48 (d,J= 2.0 Hz, 1H), 7.43～7.40 (m, 1H), 7.39～7.34 (m, 2H), 7.07 (d,J= 8.5 Hz, 1H), 3.95 (s, 3H), 3.85 (d,J= 28.6 Hz, 6H)；13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ189.86 (s), 157.65 (s), 153.93 (s), 148.76 (s), 146.41 (s), 144.24 (s), 143.31 (s), 128.66 (s), 126.91 (s), 125.38 (s), 124.66 (s), 120.54 (s), 118.78 (s), 115.44 (s), 111.16 (s), 110.90 (s), 56.18 (s), 55.82 (s), 55.65 (s)； MS:m/z：[M+H]+341.034 5 [M+Na]+363.015 5。

3-(3′-甲基苯甲?；?-8-甲氧基香豆素(7) 淡黃色固體，產(chǎn)率: 88.44%；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ8.37 (s, 1H), 7.78～7.68 (m, 2H), 7.51 (d,J= 7.5 Hz, 1H), 7.44～7.33 (m, 4H), 3.95 (s, 3H), 2.37 (s, 3H)。13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ191.71 (s), 157.61 (s), 146.40 (s), 145.05 (s), 143.44 (s), 138.14 (s), 136.04 (s), 134.43 (s), 129.71 (s), 128.51 (s), 126.67 (s), 126.62 (s), 124.69 (s), 120.69 (s), 118.72 (s), 115.64 (s), 56.17 (s), 20.61 (s)； MS:m/z：[M+H]+295.065 3 [M+Na]+317.047 8。

3-(4′-氟苯甲?；?-8-甲氧基香豆素(8) 淡黃色固體，產(chǎn)率: 79.86%；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ8.40 (s, 1H), 8.03 (dd,J= 8.6, 5.6 Hz, 2H), 7.43～7.34 (m, 5H), 3.95 (s, 3H)；13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ190.17 (s), 166.18 (s), 164.50 (s), 157.63 (s), 146.40 (s), 145.51 (s), 143.52 (s), 132.51 (s), 132.45 (s), 126.3 (s), 124.7 (s), 120.74 (s), 118.71 (s), 115.79 (s), 115.76 (s), 115.51 (s), 56.19 (s)； MS:m/z：[M+H]+299.041 0 [M+Na]+321.022 1。

3-(4′-(3-氟甲基)苯甲?；?-7-甲基香豆素(9) 淡黃色固體，產(chǎn)率: 85.12%；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ8.51 (s, 1H), 8.10 (d,J= 8.1 Hz, 2H), 7.90 (d,J= 8.2 Hz, 2H), 7.79 (d,J= 7.9 Hz, 1H), 7.37～7.25 (m, 2H), 2.48 (s, 3H)；13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ191.05 (s), 157.99 (s), 154.51 (s), 146.95 (s), 145.44 (s), 139.87 (s), 129.88 (s), 129.73 (s), 126.00 (s), 125.43 (s), 125.41 (s), 124.06 (s), 116.27 (s), 115.77 (s), 21.34 (s)；MS:m/z：[M+H]+333.037 7 [M+Na]+355.019 6。

3-(4′-(3-氟甲基)苯甲?；?-6-羥基香豆素(10) 淡黃色固體， 產(chǎn)率: 88.8%；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ9.90 (s, 1H), 8.46 (s, 1H), 8.10 (d,J= 8.1 Hz, 2H), 7.89 (d,J= 8.3 Hz, 2H), 7.35 (d,J= 8.8 Hz, 1H), 7.19 (d,J= 3.3 Hz, 2H)；13CNMR (150 MHz, DMSO-d6)δ191.22 (s), 158.15 (s), 154.04 (s), 147.75 (s), 146.59 (s), 139.71 (s), 129.95 (s), 125.56 (s), 125.48 (s), 122.11 (s), 118.63 (s), 117.20 (s), 113.66 (s)； MS:m/z：[M+H]+335.020 0 [M+Na]+357.000 9。

3-(4′-(3-氟甲基)苯甲?；?-5-甲氧基香豆素(11) 淡黃色固體，產(chǎn)率: 75.6%；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ8.47 (s, 1H), 8.08 (d,J= 8.1 Hz, 2H), 7.89 (d,J= 8.2 Hz, 2H), 7.72 (d,J= 1.0 Hz, 1H), 7.08～7.02 (m, 2H), 3.96 (s, 3H)；13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ190.96 (s), 157.76 (s), 155.28 (s), 141.31 (s), 139.99 (s), 135.33 (s), 129.88 (s), 125.4 (s), 125.38 (s), 124.57 (s), 123.48 (s), 108.51 (s), 108.42 (s), 106.41 (s), 56.47 (s)； MS:m/z：[M+H]+349.033 3 [M+Na]+371.015 7。

3-(3′,4′-二甲氧基苯甲?；?-7-甲基香豆素(12) 淡黃色固體，產(chǎn)率: 90.1%；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ8.29 (s, 1H), 7.72 (d,J= 7.9 Hz, 1H), 7.53 (dd,J= 8.4, 2.0 Hz, 1H), 7.47 (d,J= 2.0 Hz, 1H), 7.32 (s, 1H), 7.25 (dd,J= 7.9, 0.7 Hz, 1H), 7.06 (d,J= 8.5 Hz, 1H), 3.86 (s, 3H), 3.82 (s, 3H), 2.46 (s, 3H)；13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ189.94 (s), 158.05 (s), 154.07 (s), 153.82 (s), 148.73 (s), 144.42 (s), 144.21 (s), 129.18 (s), 125.85 (s), 125.46 (s), 125.28 (s), 116.25 (s), 115.82 (s), 111.14 (s), 110.85 (s), 55.80 (s), 55.62 (s), 21.28 (s)； MS:m/z：[M+H]+325.074 5 [M+Na]+347.056 9。

3-(3′,4′-二甲氧基苯甲?；?-5-甲氧基香豆素(13) 淡黃色固體，產(chǎn)率: 89.3%；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ8.23 (s, 1H), 7.68 (t,J= 8.4 Hz, 1H), 7.53 (dd,J= 8.4, 2.0 Hz, 1H), 7.46 (d,J= 2.0 Hz, 1H), 7.06 (d,J= 8.4 Hz, 2H), 7.01 (d,J= 8.3 Hz, 1H), 3.93 (s, 3H), 3.87 (s, 3H), 3.82 (s, 3H)；13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ189.83 (s), 157.73 (s), 156.66 (s), 154.88 (s), 153.78 (s), 148.71 (s), 138.66 (s), 134.42 (s), 128.87 (s), 125.25 (s), 124.88 (s), 111.22 (s), 110.82 (s), 108.41 (s), 106.30 (s), 56.41 (s), 55.79 (s), 55.64 (s)； MS:m/z：[M+H]+341.067 4 [M+Na]+363.050 2。

3-(3′,4′-二甲氧基苯甲?；?-6-羥基香豆素(14) 淡黃色固體，產(chǎn)率: 78.77%；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ9.84 (s, 1H), 8.23 (s, 1H), 7.52 (dd,J= 8.4, 2.0 Hz, 1H), 7.47 (d,J= 1.8 Hz, 1H), 7.38～7.26 (m, 1H), 7.21～7.08 (m, 2H), 7.06 (d,J= 8.5 Hz, 1H), 3.86 (s, 3H), 3.82 (s, 3H)；13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ190.05 (s), 158.19 (s), 153.95 (s), 153.89 (s), 148.77 (s), 147.26 (s), 143.84 (s), 128.72 (s), 126.77 (s), 125.37 (s), 121.21 (s), 118.7 (s), 117.11 (s), 113.27 (s), 111.06 (s), 110.88 (s), 55.81 (s), 55.63 (s)； MS:m/z：[M+H]+327.054 9 [M+Na]+349.036 0。

3-(2′-氟苯甲?；?-6-羥基香豆素(15) 淡黃色固體，產(chǎn)率: 83.1%；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ9.93 (s, 1H), 8.50 (s, 1H), 7.79 (td,J= 7.6, 1.7 Hz, 1H), 7.69 (dt,J= 7.3, 5.6 Hz, 1H), 7.56～7.24 (m, 3H), 7.26～6.95 (m, 2H)；13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ188.76 (s), 160.29 (s), 159.66 (s), 154.66 (s), 148.22 (s), 146.58 (s), 135.64 (s), 135.58 (s), 131.12 (s), 127.35 (s), 125.33 (s), 122.93 (s), 117.76 (s), 116.78 (s), 116.63 (s), 114.48 (s)； MS:m/z：[M+H]+285.026 8 [M+Na]+307.008 4。

3-(4′-氟苯甲酰基)-6,8-二叔丁基香豆素(16) 淡黃色固體，產(chǎn)率: 62.53%；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ8.40 (s, 1H), 8.07～8.00 (m, 2H), 7.74 (d,J= 2.3 Hz, 1H), 7.66 (d,J= 2.3 Hz, 1H), 7.38 (t,J= 8.8 Hz, 2H), 1.49 (s, 9H), 1.33 (s, 9H)；13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ190.18 (s), 166.13 (s), 164.46 (s), 157.54 (s), 150.82 (s), 146.73 (s), 146.51 (s), 136.11 (s), 132.86 (s), 132.85 (s), 132.56 (s), 132.50 (s), 128.07 (s), 124.89 (s), 124.49 (s), 118.10 (s), 115.78 (s), 115.63 (s), 34.58 (s), 34.35 (s), 30.94 (s), 29.53 (s)； MS:m/z：[M+H]+381.147 0 [M+Na]+403.132 7。

3-(3′-甲基苯甲酰基)-7-甲基香豆素(17) 淡黃色固體，產(chǎn)率: 77.69%.1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ8.35 (s, 1H), 7.73 (d,J= 8.0 Hz, 2H), 7.69 (d,J= 7.7 Hz, 1H), 7.50 (d,J= 7.6 Hz, 1H), 7.42 (t,J= 7.6 Hz, 1H), 7.33 (s, 1H), 7.26 (d,J= 7.9 Hz, 1H), 2.46 (s, 3H), 2.37 (s, 3H)；13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ191.81 (s), 158.03 (s), 154.23 (s), 145.11 (s), 134.32 (s), 129.63 (s), 129.40 (s), 128.49 (s), 126.63 (s), 125.92 (s), 116.28 (s), 115.79 (s), 21.32 (s), 20.65 (s)； MS:m/z：[M+H]+279.072 1 [M+Na]+301.054 0。

3-(2′-氟苯甲?；?-6,8-二叔丁基香豆素(18) 淡黃色固體，產(chǎn)率: 64.21%；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ8.57 (s, 1H), 7.84 (d,J= 2.3 Hz, 1H), 7.79 (d,J= 1.7 Hz, 1H), 7.69 (dd,J= 10.1, 5.2 Hz, 2H), 7.41～7.31 (m, 2H), 1.47 (s, 9H), 1.34 (s, 9H)；13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ188.59 (s), 161.90 (s), 158.00 (s), 151.59 (s), 148.27 (s), 147.33 (s), 136.72 (s), 135.47 (s), 131.14 (s), 129.38 (s), 125.97 (s), 125.74 (s), 125.36 (s), 118.69 (s), 116.81 (s), 116.66 (s), 35.17 (s), 34.98 (s), 31.50 (s)； MS:m/z：[M+H]+381.072 1 [M+Na]+403.034 4。

3-(3′,4′-二甲氧基苯甲?；?-8-氟香豆素(19) 淡黃色固體，產(chǎn)率:92.68%；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ8.36 (d, J = 0.8 Hz, 1H), 7.70～7.63 (m, 2H), 7.61 (dd,J= 8.4, 2.0 Hz, 1H), 7.50 (d,J= 2.0 Hz, 1H), 7.43～7.38 (m, 1H), 7.07 (d,J= 8.5 Hz, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.83 (s, 3H)；13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ189.48 (s), 156.81 (s), 154.05 (s), 148.79 (s), 147.45 (s), 143.48 (s), 143.47 (s), 128.49 (s), 127.62 (s), 125.55 (s), 124.91 (s), 124.76 (s), 119.04 (s), 110.89 (s), 55.84 (s), 55.68 (s)； MS:m/z：[M+H]+329.050 3[M+Na]+351.032 3。

3-(3′,4′-二甲氧基苯甲?；?-7-羥基香豆素(20) 淡黃色固體，產(chǎn)率: 84.66%；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ10.88 (s, 1H), 8.24 (s, 1H), 7.68 (d,J= 8.6 Hz, 1H), 7.49 (dd,J= 8.4, 2.0 Hz, 1H), 7.44 (d,J= 2.0 Hz, 1H), 7.06 (d,J= 8.5 Hz, 1H), 6.86 (dd,J= 8.5, 2.3 Hz, 1H), 6.79 (d,J= 2.2 Hz, 1H), 3.84 (d,J= 27.8 Hz, 6H)；13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ190.14 (s), 162.81 (s), 158.26 (s), 156.25 (s), 153.52 (s), 148.61 (s), 145.34 (s), 131.15 (s), 129.18 (s), 124.93 (s), 121.67 (s), 113.67 (s), 111.29 (s), 110.77 (s), 110.66 (s), 101.98 (s), 55.74 (s), 55.58 (s)； MS:m/z：[M+H]+327.055 8 [M+Na]+349.037 4。

3-(3′,4′-二甲氧基苯甲?；?-6-甲基香豆素(21) 淡黃色固體，產(chǎn)率: 83.33%；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ8.25 (s, 1H), 7.62 (s, 1H), 7.54 (dd,J= 8.4, 1.8 Hz, 2H), 7.47 (d,J= 2.0 Hz, 1H), 7.39 (d,J= 8.5 Hz, 1H), 7.06 (d,J= 8.5 Hz, 1H), 3.30 (s, 6H), 2.39 (s, 3H)；13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ189.90 (s), 158.05 (s), 153.91 (s), 152.06 (s), 148.77 (s), 143.89 (s), 134.05 (s), 134.02 (s), 128.99 (s), 128.68 (s), 126.65 (s), 125.39 (s), 117.94 (s), 116.00 (s), 110.87 (s), 55.82 (s), 55.64 (s), 20.12 (s)； MS:m/z：[M+H]+325.074 4 [M+Na]+347.056 7。

1.3 抗癌活性測定

1.3.1 MTT法測試化合物的細(xì)胞毒性

MTT法[19]的檢測原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能將外源的MTT還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞內(nèi)，而死細(xì)胞則沒有這種功能。二甲基亞砜(DMSO)能將藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚溶解，用酶標(biāo)儀在490 nm波長下測定其吸光度值(OD值)，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。OD值越大，細(xì)胞活力越強(qiáng)，毒性越低。

選取H1299細(xì)胞進(jìn)行抗癌活性實(shí)驗，實(shí)驗過程如下:收集貼壁細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，96孔板，每孔加100 μL 細(xì)胞懸液，鋪板使每孔中待測細(xì)胞密度為7 000個左右。前一天晚上鋪板，次日上午加化合物，化合物設(shè)置6個濃度梯度，3個重復(fù)孔。加完藥后，將96孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。48 h后，取出96孔板，每孔加入10 μL MTT，加完后用錫紙包好孔板避光，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。4 h后，取出96孔板，用1 mL注射器將板中上層液體吸出，過程中盡量避免吸掉底部結(jié)晶。然后每孔加入150 μL DMSO，酶標(biāo)儀中低速振蕩10 min使晶體充分溶解。在酶標(biāo)儀490 nm處測量各孔OD值，根據(jù)公式計算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率(%)=A1/A2×100%，其中A1為樣本組OD值，A2為空白組OD值。

1.3.2 急性毒性試驗

根據(jù)細(xì)胞水平的測定結(jié)果，對化合物2、8、15進(jìn)行小鼠體內(nèi)的急性毒性測試。根據(jù)Myran的研究方法[20]，并選定KM小鼠進(jìn)行實(shí)驗(老鼠從濟(jì)南朋悅實(shí)驗動物養(yǎng)殖有限公司購買,執(zhí)照號碼:SCXK(陸)20190003)。在恒溫室喂養(yǎng)小鼠，用含吐溫-80的生理鹽水制備化合物2、8、15，吐溫-80起到可溶性助溶作用。灌胃用藥量為0.2 mL/10 g，實(shí)驗分為1 000 mg/kg和2 000 mg/kg兩個濃度組，每組小鼠5只，灌胃給藥1次。24 h后觀察小鼠行為模式的變化及死亡情況，連續(xù)觀察7 d后處死小鼠。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成方法

本文以4-甲基哌啶為催化劑，苯甲酰乙酸乙酯與取代水楊醛化合物在甲醇中反應(yīng)，合成了21個取代3-苯甲?；苌铩Ｅc原方法相比，可將反應(yīng)溫度由80 ℃降至60 ℃，催化劑由哌啶改為4-甲基哌啶，反應(yīng)時間由原來的4 h變?yōu)? h，縮短了反應(yīng)時間，使反應(yīng)過程更加安全，更符合綠色化學(xué)的要求。

2.2 化合物對H1299細(xì)胞的細(xì)胞毒性

化合物對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(H1299)的細(xì)胞毒性及形態(tài)改變?nèi)鐖D4所示。以常用的抗腫瘤藥物拓?fù)涮婵?Topotecan，TPT)作為對照藥物，MTT法測定對照品和化合物的生物活性， IC50值如表2所示。抗癌實(shí)驗結(jié)果表明，化合物2、8和15對H1299細(xì)胞系表現(xiàn)出明顯的抗增殖活性，其中化合物2的抗癌活性比TPT還要好。

為了確定化合物2、8、15對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性，我們用不同濃度的化合物2、8、15處理H1299細(xì)胞。由表2可以看出，陽性藥物拓?fù)涮婵底饔糜贖1299細(xì)胞時，IC50值為(16.053±0.750) μmol·L-1，而化合物2的IC50值為(9.151±0.669) μmol·L-1，小于拓?fù)涮婵担憩F(xiàn)出比拓?fù)涮婵蹈玫目拱┳饔?。其中化合?和15的藥效略低于陽性藥物。MTT結(jié)果顯示，該化合物在測試范圍內(nèi)呈劑量依賴性，顯著降低了細(xì)胞活力(圖5)。此外，顯微鏡下的形態(tài)學(xué)分析也證實(shí)了類似的結(jié)果。向細(xì)胞中加入化合物共同作用后，觀察到明顯的細(xì)胞形態(tài)的改變，包括細(xì)胞收縮、破裂、數(shù)量減少(圖4)。綜上所述，化合物對H1299細(xì)胞具有明顯的生長抑制和形態(tài)變化，表明化合物2、8和15具有細(xì)胞毒性。

圖4 不同濃度的化合物2、8和15處理H1299細(xì)胞48 h后的細(xì)胞狀態(tài)圖(從左到右的濃度分別為50、25、12.5、6.25、3.125、1.56 μmol·L-1)Fig.4 Cell state diagram of H1299 cells treated with different concentrations of compounds 2, 8 and 15 for 48 h (the concentrations from left to right are 50，25，12.5，6.25，3.125，1.56 μmol·L-1)

表2 化合物2、8、15 和TPT在H1299細(xì)胞中的IC50測定

圖5 化合物2、8、15 在不同濃度下的抑制率(*P<0.05，**P<0.01)Fig.5 Inhibition rates of compound 2,8,15 at different concentrations (*P<0.05,**P<0.01)

2.3 急性毒性試驗

根據(jù)細(xì)胞水平的活性評價結(jié)果，參照Myran等[18]的研究方法，對化合物2、8、15進(jìn)行小鼠急性毒性試驗。給藥后觀察小鼠的情況，結(jié)果如表3所示，小鼠活動正常，食欲無明顯變化，精神狀態(tài)良好，大小便無異常，體重未下降，未出現(xiàn)死亡。與對照組比較，無顯著性差異，小鼠未發(fā)生死亡及異常反應(yīng)，說明短期內(nèi)口服該化合物是安全的，無明顯急性毒副作用。

表3 小鼠灌胃給藥后行為模式的改變

2.4 ADMET性能分析

通過細(xì)胞試驗篩選出3個活性較好的化合物2、8、15，采用ADMET預(yù)測綜合分析化合物的HIA、BBB、PPB、CYP2D6、溶解度和肝毒性，分析結(jié)果如圖6、表4所示。HIA分析表明，2、8和15均具有良好的吸附能力(HIA= 0)， BBB滲透性分析發(fā)現(xiàn)，3種化合物均具有良好的滲透性。PPB參數(shù)表明，這些化合物都不能與血液中的載體蛋白高度結(jié)合，游離狀態(tài)下的化合物具有更好的生物利用度。根據(jù)細(xì)胞色素P4502D6 (CYP2D6)結(jié)果分析，所有化合物均為CYP2D6酶的非抑制劑(得分< 0.161)，表明化合物在肝臟中代謝良好。通過溶解度參數(shù)分析，四種化合物的溶解度均為2，具有良好的溶解度。在肝毒性方面，化合物幾乎沒有肝毒性?？偟膩碚f，化合物符合ADMET制備的相關(guān)要求，為進(jìn)一步進(jìn)行化合物體外毒性檢測奠定了基礎(chǔ)。

圖6 四種化合物的腸吸收(HIA)和血腦屏障(BBB)特性預(yù)測(紅色和綠色橢圓分別代表HIA的95%和99%的置信區(qū)間,紫紅色和藍(lán)色橢圓分別代表血腦屏障的95%和99%的置信區(qū)間,深藍(lán)色的點(diǎn)是3種化合物)Fig.6 Prediction of intestinal absorption (HIA) and blood brain barrier (BBB) properties by four compounds(Red and green ellipses represent 95% and 99% confidence intervals of HIA, respectively; the amaranthand blue ellipses represent 95% and 99% confidence intervals of BBB, respectively; the dark blue dots are 3 compounds)

表4 3-苯甲?；愣顾氐腁DMET性質(zhì)

3 結(jié)論

合成了一系列3-苯甲?；愣顾仡惢衔?，并對其抗癌活性進(jìn)行了評價。選擇4-甲基哌啶作為催化劑，降低了反應(yīng)溫度，縮短了反應(yīng)時間，使反應(yīng)更符合綠色化學(xué)的要求?；衔?、8和15對H1299細(xì)胞系具有較強(qiáng)的廣譜抗癌活性。其中，化合物2具有最佳的抗癌活性，IC50為(9.151±0.669) μmol·L-1，低于陽性藥物TPT的IC50(16.053±0.750) μmol·L-1)?；衔?(IC50= (27.137±0.128) μmol·L-1)和15(IC50= (26.8±1.921) μmol·L-1)也表現(xiàn)出較好的抗癌活性。對小鼠的急性毒性試驗結(jié)果表明，化合物對小鼠基本無毒。這些結(jié)果均表明，此類化合物是進(jìn)一步開發(fā)強(qiáng)效抗癌藥物的有希望的先導(dǎo)分子，為后續(xù)研究開發(fā)抗癌藥物的新骨架結(jié)構(gòu)提供一定的理論依據(jù)。