陳文鈞, 駱 媱, 章建華, 尹 華*
(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州 311402;2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,浙江 杭州 310006)
骨關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)軟骨退行性病變?yōu)楹诵?,累及骨質(zhì)并包括滑膜、關(guān)節(jié)囊及關(guān)節(jié)其他結(jié)構(gòu)的慢性炎癥[1-2]。骨關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)“骨痹”范疇,臨床多采用補(bǔ)腎活血方藥治療。淫羊藿-川芎藥對(duì)取自《太平圣惠方》中的仙靈脾散,由淫羊藿、川芎、威靈仙、肉桂、蒼耳子組成,取淫羊藿補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨之功,川芎活血行氣、祛風(fēng)止痛之效,兩藥合用可標(biāo)本兼治。中醫(yī)骨傷科臨床診治骨關(guān)節(jié)炎時(shí),常以淫羊藿、川芎配伍使用,再隨證加減其他藥味,療效顯著。研究表明,淫羊藿苷可調(diào)控軟骨細(xì)胞代謝,促進(jìn)滑膜細(xì)胞增殖,抑制MMP-13、MMP-3、IL-1β、PGE2表達(dá),從而延緩骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展[3-5];川芎可改善外周血管循環(huán),抑制血小板聚集,改善炎癥[6-7]。
本研究采用HPLC法建立22批淫羊藿-川芎藥對(duì)指紋圖譜,酶聯(lián)免疫法檢測(cè)MMP-13、MMP-3、IL-1β、NO、PGE2水平,應(yīng)用雙變量相關(guān)分析、灰色關(guān)聯(lián)度分析和遺傳神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)研究其譜-效關(guān)系,初步闡明該藥對(duì)治療骨關(guān)節(jié)炎的物質(zhì)基礎(chǔ)。
1.1 儀器 Waters alliancee 2695高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司,配置e2695分離模塊、柱溫箱、2998PDA檢測(cè)器、Empower色譜工作站);MettlerXS105電子天平(十萬(wàn)分之一,瑞士Mettler-Toledo公司);BP211D電子分析天平(德國(guó)賽多利斯公司);Centrifuge 5804R高速冷凍離心機(jī)、手動(dòng)移液器(德國(guó)Eppendorf公司);KQ5200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司);Biorad 680全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司);Ti-S正置顯微鏡(日本Nikon公司)。
1.2 試劑與藥物 淫羊藿、川芎飲片共22批,具體信息見表1~2,經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室鑒定為正品,編號(hào)S1~S22。硫酸氨基葡萄糖膠囊購(gòu)自永信藥品工業(yè)(昆山)股份有限公司,批號(hào)GSCyK004;塞來(lái)昔布膠囊購(gòu)自美國(guó)Pfizer公司,批號(hào)W64712。綠原酸購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院,純度均>98%,批號(hào)0753-200111;阿魏酸、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ、藁本內(nèi)酯對(duì)照品購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司,純度均>98%,批號(hào)B20007、B20170、B20172、B20173、B21576、B20075、B20492;洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A購(gòu)自成都克洛瑪生物科技有限公司,純度均>98%,批號(hào)CHB180617、CHB180615。MMP-13、MMP-3、IL-1β、NO、PGE2試劑盒均購(gòu)自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司,批號(hào)MM-O11OR1、MM-0112R1、MM-0047R1、MM-20607R1、MM-0068R1。乙腈、甲醇為色譜純;其他試劑均為分析純;水為娃哈哈純凈水。
表1 淫羊藿飲片信息
表2 川芎飲片信息
1.3 動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠,雌雄各半,體質(zhì)量180~220 g,購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可號(hào)SCXK(滬)2017-0005,飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心屏障系統(tǒng)內(nèi)。
2.1 HPLC指紋圖譜建立
2.1.1 色譜條件 按照文獻(xiàn)[8-9]報(bào)道,Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相乙腈(A)-0.1%磷酸(B),梯度洗脫,程序見表3;體積流量1 mL/min;柱溫30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm;進(jìn)樣量10 μL。
表3 梯度洗脫程序
2.1.2 溶液制備
2.1.2.1 供試品溶液 精密稱取淫羊藿(批號(hào)180101)、川芎(批號(hào)171201)飲片粉末各0.2 g(過(guò)40目篩),置于50 mL具塞錐形瓶中,加入80倍量50%乙醇,稱定質(zhì)量,在40 ℃下超聲處理30 min,冷卻至室溫,50%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,濾過(guò),取續(xù)濾液,12 000 r/min離心15 min,取上清液,即得。
2.1.2.2 對(duì)照品溶液 精密稱取綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯適量,置于10 mL量瓶中,甲醇制成質(zhì)量濃度為2.255、2.330、2.167、2.041、2.042、2.327、2.173、2.112、2.261、2.049 mg/mL的溶液,即得。
2.1.3 方法學(xué)考察 以朝藿定C(11號(hào)峰)為參照峰,取同一供試品溶液,在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次,測(cè)得各成分色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均<1.7%,相對(duì)峰面積均RSD<2.8%,表明儀器精密度良好。按“2.1.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份,在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得各成分色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均<0.1%,相對(duì)峰面積RSD均<2.9%,表明該方法重復(fù)性良好。取同一供試品溶液,于0、2、4、8、12 h在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得各成分色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均<1.2%,相對(duì)峰面積RSD均<2.9%,表明溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.1.4 圖譜生成 按“2.1.2.1”項(xiàng)下方法制備22批藥對(duì)的供試品溶液,在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)建立指紋圖譜,共確定20個(gè)共有峰,見圖1,再采用SPSS 17.0軟件,以共有峰峰面積為變量,將22批次飲片分為7類,見圖2。最終,選取S3、S19、S12、S21進(jìn)行后續(xù)藥效學(xué)研究。
注:S2為淫羊藿對(duì)照?qǐng)D譜,S3為川芎對(duì)照?qǐng)D譜,S4為對(duì)照品溶液。1.綠原酸 5.阿魏酸 8.洋川芎內(nèi)酯Ⅰ 9.朝藿定A 10.朝藿定B 11.朝藿定C 12.淫羊藿苷 17.寶藿苷Ⅰ 18.洋川芎內(nèi)酯A 19.藁本內(nèi)酯圖1 22批藥對(duì)HPLC指紋圖譜
圖2 22批藥對(duì)聚類分析圖
2.2 藥效學(xué)研究
2.2.1 造模與給藥 56只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,分為正常組(8只)和造模組(48只),造模組大鼠采用切斷前交叉韌帶并損傷半月板法建立骨關(guān)節(jié)炎模型,術(shù)后每天腹腔注射青霉素40 000 U/只,連續(xù)3 d,以預(yù)防感染。
圖2顯示,22批藥對(duì)分為7類,其中S16、S11、S20這3批飲片單獨(dú)成類,樣本量較少,無(wú)可比性,故選取其他4類中的各1批。將造模組大鼠隨機(jī)分為模型組,淫羊藿-川芎藥對(duì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組,陽(yáng)性藥組,每組8只,雌雄分籠飼養(yǎng),正常飲水?dāng)z食。
造模3 d后,淫羊藿-川芎藥對(duì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組大鼠分別灌胃給予2 g/mL藥液,陽(yáng)性藥物組大鼠灌胃給予2 mg/mL塞來(lái)昔布、12.5 mg/mL硫酸氨基葡萄糖溶液,劑量均為1 mL/100 g;正常組、模型組大鼠灌胃給予等體積蒸餾水。
2.2.2 淫羊藿-川芎藥對(duì)對(duì)骨關(guān)節(jié)炎大鼠血漿中MMP-13、MMP-3、IL-1β、NO、PGE2水平的影響 給藥8周后,大鼠禁食12 h,腹腔注射3%戊巴比妥(0.15 mL/100 g)麻醉,心臟取血,4 ℃、3 000 r/min離心20 min,分離血漿,按酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作,檢測(cè)血漿中MMP-13、MMP-3、IL-1β、NO、PGE2水平,結(jié)果見表4。由此可知,與正常組比較,模型組大鼠血漿中MMP-13、MMP-3、IL-1β、NO、PGE2水平升高(P<0.01);與模型組比較,各淫羊藿-川芎藥對(duì)組和陽(yáng)性藥組大鼠血漿中MMP-13、MMP-3、IL-1β、NO、PGE2水平降低(P<0.05,P<0.01)。
表4 淫羊藿-川芎藥對(duì)對(duì)大鼠血漿中MMP-13、MMP-3、IL-1β、NO、PGE2水平的影響
2.3 譜效關(guān)系研究 以20個(gè)共有峰峰面積為X,MMP-13、MMP-3、IL-1β、NO、PGE2水平分別為Y1、Y2、Y3、Y4、Y5,將數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理后,采用雙變量相關(guān)分析、灰色關(guān)聯(lián)度分析、遺傳神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[10-13]進(jìn)行分析,結(jié)果見表5。雙變量相關(guān)分析得出,1(綠原酸)、9(朝藿定A)、10(朝藿定B)、17(寶藿苷Ⅰ)號(hào)峰對(duì)抑制MMPs(MMP-13、MMP-3)水平的貢獻(xiàn)較大,5(阿魏酸)、10(朝藿定B)、18(洋川芎內(nèi)酯A)號(hào)峰對(duì)抑制炎性因子(IL-1β、NO、PGE2)水平的貢獻(xiàn)較大;灰色關(guān)聯(lián)度分析得出,2、11(朝藿定C)、12(淫羊藿苷)號(hào)峰與MMPs關(guān)聯(lián)度大于0.7,說(shuō)明這3種成分對(duì)抑制MMPs表達(dá)的貢獻(xiàn)較大,而其他共有峰均在0.6~0.7之間;遺傳神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析得出,9(朝藿定A)、16、12(淫羊藿苷)、13號(hào)峰對(duì)抑制MMPs表達(dá)貢獻(xiàn)較大,3、6、10(朝藿定B)、15、2號(hào)峰對(duì)抑制炎性因子的表達(dá)貢獻(xiàn)較大。3種分析方法表明,抑制MMPs表達(dá)貢獻(xiàn)較大的為1(綠原酸)、2、9(朝藿定A)、10(朝藿定B)、11(朝藿定C)、12(淫羊藿苷)、13、16、17(寶藿苷Ⅰ)號(hào)峰,均為淫羊藿成分;抑制炎性因子貢獻(xiàn)較大的為2、3、5(阿魏酸)、6、10(朝藿定B)、15、18(洋川芎內(nèi)酯A)號(hào)峰,均為淫羊藿-川芎藥對(duì)成分。
表5 相關(guān)系數(shù)測(cè)定結(jié)果
本研究考察提取方式(超聲、回流)、提取時(shí)間(15、30、45、60 min)、溶劑倍數(shù)(40、80、100、120、150、200倍)、浸泡時(shí)間(0、0.5、1、2 h)等,以綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯10個(gè)成分的提取率、色譜峰響應(yīng)及分離情況為評(píng)價(jià)指標(biāo),確定供試品溶液的制備方法。
骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制有基質(zhì)金屬蛋白酶、炎性因子和一氧化氮學(xué)說(shuō)等?;|(zhì)金屬蛋白酶過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致軟骨退化,MMP-13是作用于軟骨降解的主要酶[14-15];IL-1β是促使軟骨代謝平衡轉(zhuǎn)向分解和退化的細(xì)胞因子之一,誘導(dǎo)滑膜和軟骨產(chǎn)生MMPs等蛋白水解酶造成軟骨基質(zhì)的降解破壞;PGE2參與全身的炎癥反應(yīng),導(dǎo)致軟骨下骨的吸收,影響骨與軟骨合成代謝,并通過(guò)細(xì)胞間cAMP的積累誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡[16-17];炎性介質(zhì)導(dǎo)致NO合成增多,導(dǎo)致滑膜、軟骨的氧化損傷。選擇MMP-13、MMP-3、IL-1β、NO、PGE2進(jìn)行藥效評(píng)價(jià),可客觀準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)淫羊藿-川芎藥對(duì)對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的治療作用。4批淫羊藿-川芎藥對(duì)、陽(yáng)性藥給藥后,骨關(guān)節(jié)炎大鼠血漿中各指標(biāo)含量均下降,說(shuō)明淫羊藿-川芎藥對(duì)對(duì)骨關(guān)節(jié)炎確切有效。
采用3種統(tǒng)計(jì)方法聯(lián)用并進(jìn)行交叉驗(yàn)證,結(jié)果更準(zhǔn)確。結(jié)果顯示,淫羊藿中1(綠原酸)、2、9(朝藿定A)、10(朝藿定B)、11(朝藿定C)、12(淫羊藿苷)、13、16、17(寶藿苷Ⅰ)號(hào)峰對(duì)抑制MMPs表達(dá)貢獻(xiàn)較大,淫羊藿-川芎藥對(duì)中2、3、5(阿魏酸)、6、10(朝藿定B)、15、18(洋川芎內(nèi)酯A)號(hào)峰抑制炎性因子貢獻(xiàn)較大。綜上所述,淫羊藿對(duì)抑制MMPs表達(dá)貢獻(xiàn)較大,而抑制炎性因子的表達(dá)是淫羊藿-川芎藥對(duì)協(xié)同作用的結(jié)果,初步闡明了淫羊藿-川芎藥對(duì)治療骨關(guān)節(jié)炎的物質(zhì)基礎(chǔ)。