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    踝節(jié)菌屬真菌、膠孢炭疽菌化學成分的研究

    2022-12-29 16:12:50魏漢楠楊中鐸張義飛茍文博
    中成藥 2022年5期
    關鍵詞:燕麥片柱層析硅膠

    魏漢楠, 楊中鐸, 張義飛, 茍文博, 呂 敏, 張 干, 王 麗

    (蘭州理工大學,甘肅 蘭州 730050)

    內(nèi)生真菌廣泛存在于植物中,與宿主形成了和諧的共生關系,為宿主提供保護。踝節(jié)菌屬真菌Talaromyces又稱為籃狀菌,是一種在海洋和陸地中廣泛分布的真菌。研究發(fā)現(xiàn),踝節(jié)菌屬的內(nèi)生真菌能夠代謝出很多結構新穎的化合物[1]。因此,本研究對踝節(jié)菌屬真菌Talaromycesaurantiacus在燕麥片培養(yǎng)基下發(fā)酵得到的次級代謝產(chǎn)物進行化學成分研究,從中分離到4個化合物,其中化合物10~11為首次從踝節(jié)菌屬真菌T.aurantiacus分離。本課題組之前從植物鉤藤中分離得到了內(nèi)生真菌ColletotrichumgloeosporioidesGT-7(GenBank收錄號KR911618),經(jīng)過測定發(fā)現(xiàn)其PDB培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物對單胺氧化酶擁有較高的活性,IC50值為17.79 μmol/L,通過活性跟蹤,發(fā)現(xiàn)了4個結構新穎的酰胺類化合物colletotrilactam A~D[2]。為了能夠得到更多結構新穎的化合物,本研究選用綠豆固體培養(yǎng)基對該真菌進行發(fā)酵,研究其化學成分,從中分離到7個化合物,其中化合物4~7為首次膠孢炭疽菌C.gloeosporioides分離得到。

    1 材料

    1.1 儀器 YXQ-SG46-280SA型不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌鍋、HPX-9162MBE型數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱(上海博訊實業(yè)有限公司);JJ-CJ-ID型超凈工作臺(杭州凈化設備廠);SHZ-82型恒溫震搖箱(常州國華電器有限公司);RE-5286A型旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);NP7000C型高效液相色譜儀(江蘇漢邦科技有限公司);YMC-Pack ODS-A色譜柱(10 mm×250 mm,5 μm,日本YMC公司);0.45 μm微孔過濾器(美國Gibco公司)。

    1.2 試劑 乙酸乙酯(工業(yè)純,蘭州西固永達化工廠);甲醇(色譜純,天津康科德科技有限公司)。

    1.3 菌株 鉤藤內(nèi)生真菌ColletotrichumgloeosporioidesGT-7(GenBank收錄號KR911618)由課題組前期從鉤藤中分離得到,保存于蘭州理工大學生命科學與工程學院。踝節(jié)菌屬真菌Talaromycesaurantiacus購自中國微生物菌種查詢網(wǎng)(http://www.biobw.org),菌株編號bio-81655,保存于蘭州理工大學生命科學與工程學院。

    2 提取與分離

    2.1 膠孢炭疽菌 將菌種接種至PDA培養(yǎng)基后,在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d,作為種子培養(yǎng)基,培養(yǎng)完成后接種至121 ℃高壓滅菌30 min的綠豆培養(yǎng)基中(500 mL錐形瓶中加入80 g綠豆、100 mL蒸餾水),在28 ℃下培養(yǎng)45 d,其間定期噴灑醫(yī)用酒精進行殺菌。將發(fā)酵完全的綠豆培養(yǎng)基曬干后研磨成粉,以乙酸乙酯浸泡提取,得發(fā)酵物粗浸膏25 g,經(jīng)大孔吸附樹脂柱層析,乙醇-水(1∶9~9∶1)梯度洗脫,得Fr.A~Fr.E。

    Fr.A(2.1 g)經(jīng)MCI柱層析,甲醇-水(2∶8~1∶0)梯度洗脫,得Fr.A-1~Fr.A-4,F(xiàn)r.A-2(523 mg)經(jīng)硅膠柱層析,氯仿-甲醇(50∶1~2∶1)梯度洗脫,得化合物1(27 mg)。Fr.B(1.4 g)經(jīng)硅膠柱層析,氯仿-甲醇(100∶1~10∶1)梯度洗脫,得化合物2(15 mg)、Fr.B-2,F(xiàn)r.B-2(350 mg)經(jīng)硅膠柱層析,氯仿-甲醇(150∶1~50∶1)梯度洗脫,得化合物3(3 mg)、4(4.1 mg)。Fr.C(2.2 g)經(jīng)MCI柱層析,甲醇-水(2∶8~1∶0)梯度洗脫,得Fr.C-1~Fr.C-4,F(xiàn)r.C-1(355 mg)經(jīng)硅膠柱層析,石油醚-丙酮(100∶1~5∶1)梯度洗脫,得化合物5(3.2 mg)、6(2.7 mg);Fr.C-4(120 mg)經(jīng)硅膠柱層析,石油醚-丙酮(150∶1~20∶1)梯度洗脫,得化合物7(2.8 mg)。

    2.2 踝節(jié)菌屬真菌 將菌種接種至PDA培養(yǎng)基后,在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d,作為種子培養(yǎng)基,培養(yǎng)完成后接種到121 ℃高壓滅菌30 min的燕麥片培養(yǎng)基中(500 mL錐形瓶中加入80 g燕麥片、100 mL蒸餾水),在28 ℃下培養(yǎng)45 d,其間定期噴灑醫(yī)用酒精進行殺菌,發(fā)酵完成后取出燕麥片培養(yǎng)基,風干后研磨成粉,乙酸乙酯浸泡提取,得粗浸膏21 g,經(jīng)大孔吸附樹脂柱層析,乙醇-水(1∶9~9∶1)梯度洗脫,得Fr.FTy-A~Fr.JTy-E。

    Fr.GTy-B(1.2 g)經(jīng)硅膠柱層析,氯仿-甲醇(150∶1~20∶1)梯度洗脫,得Fr.G-1~Fr.G-3,F(xiàn)r.G-1(111 mg)經(jīng)半制備HPLC,58%甲醇洗脫,得化合物11(3.5 mg,tR=31 min);Fr.G-2(173 mg)經(jīng)硅膠柱層析,石油醚-丙酮(200∶1~20∶1)梯度洗脫,得化合物9(3.1 mg);Fr.G-3(163 mg)經(jīng)半制備HPLC,43%甲醇洗脫,得化合物10(3.5 mg,tR=27 min)。Fr.H(2.3 g)經(jīng)MCI柱層析,甲醇-水(2∶8~1∶0)梯度洗脫,得Fr.H-1~Fr.H-5,F(xiàn)r.H-3(232 mg)經(jīng)半制備HPLC,65%甲醇洗脫,得化合物8(2.2 mg,tR=33 min)。

    3 結構鑒定

    化合物1:針狀結晶,ESI-MSm/z:170.1[M+H]+。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:6.96(2H,Sh-2/6),9.18(3H,brs,3,4,5-OH);13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ:120.2(C-1),109.1(C-2),144.7(C-3),138.4(C-4),109.1(C-6),166.5(C-7),以上數(shù)據(jù)與文獻[3]基本一致,故鑒定為沒食子酸。

    化合物2:白色粉末,ESI-MSm/z:340.6[M+H]+。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:2.52(2H,t,J=5.4 Hz,H-2),2.34(2H,m,H-3),1.20(3H,t,J=6.9 Hz,H-22);13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ:129.9(C-1),35.9~22.7(多個CH2信號),14.1(C-22),以上數(shù)據(jù)與文獻[4]基本一致,故鑒定為behenic acid。

    化合物3:白色晶體,ESI-MSm/z:122.1[M+H]+。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:9.76(1H,s),7.79(2H,d,J=8.0 Hz),6.92(2H,d,J=8.0 Hz);13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ:129.2(C-1),132.1(C-2),116.7(C-3),164.1(C-4),116.7(C-5),132.1(C-6),192.5(-CHO),以上數(shù)據(jù)與文獻[5]基本一致,故鑒定為對羥基苯甲醛。

    化合物4:白色無定型粉末,ESI-MSm/z:189.2[M+H]+。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:8.75(1H,s),8.32(1H,d,J=8.2 Hz),7.28(2H,t,J=8.2 Hz),7.50(1H,d,J=8.2 Hz);13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ:138.1(C-2),111.7(C-3),126.5(C-3a),121.5(C-4),122.9(C-5),123.9(C-6),112.5(C-7),136.5(C-7a),181.7(C-8),166.7(C-9),以上數(shù)據(jù)與文獻[6-7]基本一致,故鑒定為(1H-indol-3-yl)oxoacetamide。

    化合物5:白色粉末,ESI-MSm/z:411.5[M+H]+。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:5.87(1H,d,J=9.5 Hz),4.43(1H,dd,J=6.8,6.9 Hz),2.49(1H,m),1.99(1H,m),1.66(3H,s);13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ:130.0(C-2),50.2(C-3),166.2(C-5),58.7(C-6),29.2(C-7),22.6(C-8),45.3(C-9),171.0(C-11),83.0(C-12),68.7(C-13),105.5(C-14),120.8(C-15),121.3(C-16),109.9(C-17),156.8(C-18),95.1(C-19),137.6(C-20),124.0(C-21),134.6(C-22),25.7(C-23),18.3(C-24),55.8(-OCH3),以上數(shù)據(jù)與文獻[8]基本一致,故鑒定為12,13-dihydroxy fumitremorgin C。

    化合物6:無定型淺黃色粉末,ESI-MSm/z:358.4[M+H]+。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:6.21(1H,s,-NH),7.54(1H,d,J=7.9 Hz,H-7),7.67(1H,t,J=7.9 Hz,H-8),7.43(1H,t,J=8.0 Hz,H-9),8.26(1H,d,J=8.0 Hz,H-10),5.58(1H,dd,J=5.5,3.2 Hz,H-14),3.55(1H,dd,J=15.0,5.5 Hz,H-15),3.61(1H,dd,J=15.0,3.2 Hz,H-15),1.35(3H,s,H-16),6.71(1H,Hs,H-18),8.15(1H,brs,H-19),7.31(1H,brd,J=8.0 Hz,H-21),7.13(1H,t,J=8.0 Hz,H-22),6.91(1H,t,J=8.0 Hz,H-23),7.39(1H,d,J=8.0 Hz,H-24);13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ:169.2(C-1),47.1(C-3),150.6(C-4),161.7(C-12),55.5(C-14),27.1(C-15),19.0(C-16),108.4(C-17),122.5(C-18),134.9(C-20),110.1(C-21),120.1(C-23),以上數(shù)據(jù)與文獻[9]基本一致,故鑒定為fumiquinazoline F。

    化合物7:ESI-MSm/z:154.1[M+H]+。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:3.55(3H,s,H-8),6.47(1H,d,J=9.4 Hz,H-4),8.38(1H,s,H-2),7.92(1H,d,J=9.4 Hz,H-5);13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ:145.7(C-2),112.7(C-3),141.7(C-4),119.3(C-5),176.2(C-6),176.3(C-7),38.6(C-8),以上數(shù)據(jù)與文獻[7]基本一致,故鑒定為1,6-dihydro-1-methyl-6-oxo-3-pyridinecarboxylic acid。

    化合物8:淡黃色固體,ESI-MSm/z:564.6[M+H]+。1H-NMR(CDCl3,600 MHz)δ:9.53(1H,s,9′-OH),9.47(1H,s,9-OH),6.45(2H,d,J=1.8 Hz,H-7,7′),6.11(1H,d,J=1.8 Hz,H-5′),5.98(1H,d,J=1.8 Hz,H-5),5.16(1H,d,J=15.7 Hz,C-1),4.72(1H,d,J=15.7 Hz,C-1),4.75(1H,d,J=15.7 Hz,C-1′),4.63(1H,d,J=15.7 Hz,C-1′),4.02(3H,s,8-OCH3),4.00(3H,s,8′-OCH3),3.80(1H,s,H-4),3.77(1H,s,H-4′),3.46(3H,s,6-OCH3),1.23(3H,d,J=6.5 Hz,H-11),1.21(3H,d,J=6.5 Hz,H-11′);13C-NMR(CDCl3,150 MHz)δ:157.7(C-6),154.5(C-6′),157.6(C-8),157.4(C-8′),136.1(C-10a),136.1(C-10a′),123.9(C-10),123.1(C-10′),110.3(C-8a),109.8(C-8a′),73.8(C-3),74.0(C-3′),66.5(C-4),65.0(C-1),64.5(C-1′),56.3(-OCH3),56.2(-OCH3),55.2(-OCH3),16.9(C-11),16.8(C-11′),以上數(shù)據(jù)與文獻[10]基本一致,故鑒定為6′-O-desmethylES-242-4。

    化合物9:無色針晶,ESI-MSm/z:428.7[M+H]+。1H-NMR(CDCl3,600 MHz)δ:3.94(1H,m,H-3),6.50(1H,d,J=8.5 Hz,H-7),0.88(3H,s,H-18),1.09(3H,s,H-19),1.0(3H,d,J=6.5 Hz,H-21),5.11(1H,dd,J=6.6,15.2 Hz,H-22),5.19(1H,dd,J=7.6,15.1 Hz,H-23),0.83(3H,d,J=5.0 Hz,H-26),0.82(3H,d,J=5.0 Hz,H-27),0.89(3H,m,H-28);13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ:34.7(C-1),30.1(C-2),66.4(C-3),36.9(C-4),82.1(C-5),135.4(C-6),130.7(C-7),79.4(C-8),51.1(C-9),36.9(C-10),23.4(C-11),39.3(C-12),44.5(C-13),51.7(C-14),20.6(C-15),28.6(C-16),56.2(C-17),12.9(C-18),18.1(C-19),39.7(C-20),20.9(C-21),135.2(C-22),132.3(C-23),42.8(C-24),33.0(C-25),19.6(C-26),19.9(C-27),17.5(C-28),以上數(shù)據(jù)與文獻[11]基本一致,故鑒定為麥角甾醇過氧化物。

    化合物10:ESI-MSm/z:484.5[M+H]+。1H-NMR(CDCl3,600 MHz)δ:7.16(1H,d,J=10.3 Hz,H-1),6.00(1H,d,J=10.3 Hz,H-2),2.18(1H,dd,J=14.0,4.6 Hz,H-5),1.85,2.2(2H,dd,J=14.0,2.4 Hz,H-6),4.18(1H,dd,J=8.2,2.0 Hz,H-7),2.27(2H,dd,J=14.0,5.0 Hz,H-9),2.62(2H,dd,J=15.0,5.0 Hz,H-11),1.27(1H,s,H-12),1.1(3H,s,H-13),1.12(3H,s,H-14),1.36(3H,s,H-15),6.50(1H,s,H-5′),6.17(1H,d,J=1.7 Hz,H-7′),1.49(3H,d,J=6.6 Hz,H-9′);13C-NMR(CDCl3,150 MHz)δ:156.2(C-1),127.5(C-2),203.7(C-3),44.6(C-4),42.4(C-5),26.5(C-6),71.8(C-7),79.7(C-8),41.8(C-9),38.4(C-10),21.5(C-11),21.5(C-12),21.4(C-13),27.7(C-14),27.4(C-15),102.2(C-1′),135.8(C-2′),112.3(C-3′),162.2(C-4′),106.3(C-5′),159.6(C-6′),64.1(C-7′),76.0(C-8′),16.4(C-9′),168.8(C-10′),以上數(shù)據(jù)與文獻[12]基本一致,故鑒定為thailandolides B。

    化合物11:ESI-MSm/z:372.4[M+H]+。1H-NMR(CDCl3,600 MHz)δ:0.96(3H,d,J=14.5 Hz,5′-CH3),0.99(3H,d,J=6.1 Hz,4′-CH3),1.67(1H,dd,J=14.5,8.9 Hz,2′-CH2),1.79(1H,m,3′-CH),2.24(3H,s,H-9′),3.98(3H,s,4-OCH3),5.07(3H,m,H-1′),6.37(1H,d,J=1.8 Hz,H-8),6.85(1H,d,J=1.8 Hz,H-10),6.87(1H,d,J=8.5 Hz,H-1),7.56(1H,d,J=8.5 Hz,H-2);13C-NMR(CDCl3,150 MHz)δ:117.7(C-1),131.0(C-2),136.8(C-3),154.3(C-4),119.4(C-5),167.9(C-6),69.1(C-7),125.7(C-7a),120.6(C-8),134.9(C-9),117.7(C-10),147.5(C-11),141.3(C-11a),151.3(C-12a),66.6(C-1′),47.6(C-2′),24.9(C-3′),21.8(C-4′),23.3(C-5′),62.6(4-OCH3),20.8(9-CH3),以上數(shù)據(jù)與文獻[13]基本一致,故鑒定為penicillide。

    4 討論

    藥用真菌是天然藥物發(fā)現(xiàn)的重要微生物資源寶庫,我國真菌資源種類豐富,但多種資源尚待發(fā)現(xiàn),且大多數(shù)真菌主要來源于自然野生資源,其可持續(xù)利用面臨挑戰(zhàn)。本研究從膠孢炭疽菌C.gloeosporioides綠豆培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物中得到7個單體化合物,其中,化合物4~7為首次從該真菌中分離得到。從踝節(jié)菌屬真菌T.aurantiacus的燕麥片培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物得到4個單體化合物,其中化合物10~11均為首次從該菌中發(fā)現(xiàn)。此次分離得到的化合物與同一菌種代謝產(chǎn)物有所不同,可能是由于菌種來源以及培養(yǎng)條件不同對基因表達產(chǎn)生影響,導致其代謝產(chǎn)物的差異,而且植物內(nèi)生菌自身種類的多樣性和代謝途徑的多樣性也決定了其次級代謝產(chǎn)物的豐富多樣,今后可以通過改變培養(yǎng)基以及表觀遺傳修飾等手段進行優(yōu)化。在下一步研究中,本課題組將對本研究分離得到的化合物進行活性篩選。目前,國內(nèi)外對藥用真菌次級代謝產(chǎn)物的研究相對較少,本研究不僅豐富了藥用真菌化學成分的多樣性,也為從藥用真菌中發(fā)現(xiàn)更多具有生物活性的新穎結構化合物提供了科學依據(jù)。

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