合成納米銀活性黃芪內(nèi)生真菌篩選及其抑菌作用研究

張弘弛， 趙翊婷， 廉佳佩， 李 慧， 周 鳳， 劉 瑞*

(1.山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 大同 037009；2.云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650091)

納米銀具有廣譜的抗菌和殺菌活性，由納米銀釋放出的Ag+具有抗微生物活性[1]。研究發(fā)現(xiàn)，納米銀對(duì)多種細(xì)菌及病毒有抑制作用[2]，因優(yōu)秀的抑菌活性，其在化妝品、紡織品、食品儲(chǔ)藏保鮮、膳食補(bǔ)充劑、食品和醫(yī)藥包裝等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[2-4]。除了傳統(tǒng)的物理和化學(xué)合成納米材料的方法，近年來(lái)，利用真菌胞外生物合成納米銀被廣泛關(guān)注，此工藝有利于對(duì)合成條件的優(yōu)化，具有使用常規(guī)設(shè)備、成本低，后期不需要破碎真菌細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)，表現(xiàn)出工業(yè)化的潛力[5-6]。

植物內(nèi)生真菌幾乎在所有植物中都能分離得到[7]，因其與宿主植物的長(zhǎng)期共生關(guān)系，具有更加復(fù)雜的酶體系，成為了一類特殊的納米銀合成載體。已有的內(nèi)生真菌合成納米銀研究發(fā)現(xiàn)，其合成的納米銀粒徑、大小、形狀更具有優(yōu)勢(shì)，如薛柏吉[8]通過(guò)粉節(jié)皮菌和秘魯小帚梗柱孢霉合成金屬納米銀材料；黃檗通過(guò)黑附球菌合成金屬納米銀材料[9]；曲明星等[10]利用木霉屬真菌輔助合成納米銀。毛迪等[11]利用黃芪提取物生物還原制備納米銀，但利用黃芪內(nèi)生真菌生物合成納米銀的研究未有報(bào)道。基于此，本研究篩選出能夠產(chǎn)生納米銀的黃芪內(nèi)生真菌，為內(nèi)生真菌合成金屬納米粒子提供了技術(shù)支持，同時(shí)對(duì)納米銀的合成條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 菌株和培養(yǎng)基

1.1.1 內(nèi)生真菌 課題組前期從恒山黃芪根部分離而來(lái)38株內(nèi)生真菌[12-13]，保存于山西大同大學(xué)應(yīng)用生物技術(shù)研究所，批號(hào)Am-R01～Am-R38。活化采用察氏固體培養(yǎng)基，發(fā)酵采用察氏液體培養(yǎng)基。

1.1.2 供試細(xì)菌 大腸桿菌(貨號(hào)CGMCC 1.12874)、銅綠假單胞菌(貨號(hào)CGMCC 1.9054)、金黃色葡萄球菌(貨號(hào)CGMCC 1.6750)、枯草芽孢桿菌(貨號(hào)CGMCC 1.9086)均由山西大同大學(xué)應(yīng)用生物技術(shù)研究所提供。活化采用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，抑菌作用測(cè)定采用LB液體培養(yǎng)基。

1.2 試劑 硝酸銀、蔗糖、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、氯化鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、牛肉膏、蛋白胨均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儀器 SW-CJ-2F型超凈工作臺(tái)(金壇市盛威實(shí)驗(yàn)儀器廠)；GW-D-100B型振蕩培養(yǎng)箱(北京市六一儀器廠)；UV-3200S型紫外分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)；HS 902720型電泳儀(美國(guó)Thermo公司)；HEAL FORCE型PCR儀(日本島津公司)；ABI 3730XL型測(cè)序儀(日本尼康公司)；MASTERSIZER 3000E型粒度分析儀(德國(guó)賀利氏公司)；HT7700型透射電子顯微鏡(日本日立公司)。

2 方法

2.1 菌株篩選

2.1.1 內(nèi)生真菌活化及1次發(fā)酵 將38株黃芪內(nèi)生真菌菌株轉(zhuǎn)接于平板上，在28 ℃下培養(yǎng)7 d，無(wú)菌狀態(tài)下取出活化的內(nèi)生真菌菌餅，按4餅/100 mL培養(yǎng)液的密度接種于滅菌的含100 mL察氏培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，振蕩搖床培養(yǎng)，設(shè)置發(fā)酵條件為轉(zhuǎn)速130 r/min，溫度28 ℃，時(shí)間10 d。

2.1.2 內(nèi)生真菌2次發(fā)酵 1次發(fā)酵結(jié)束后無(wú)菌過(guò)濾，菌絲體用無(wú)菌水洗滌2～3次，按接種量4 g/100 mL接種于含100 mL無(wú)菌去離子水的250 mL錐形瓶中，振蕩搖床培養(yǎng)，設(shè)置發(fā)酵條件為轉(zhuǎn)速130 r/min，溫度28 ℃，發(fā)酵24 h，結(jié)束后無(wú)菌過(guò)濾，即得發(fā)酵液。

2.1.3 合成納米粒子篩選 稱取0.17 g AgNO3固體，無(wú)菌水定容至1 000 mL，得到1 mmol/L AgNO3溶液，置于棕色試劑瓶中，在4 ℃下保存，將2次發(fā)酵液與1 mmol/L AgNO3按9∶1比例混合，在28 ℃下振蕩培養(yǎng)24 h。以未加AgNO3的真菌發(fā)酵液作為空白對(duì)照，目測(cè)反應(yīng)液顏色變化，以顏色發(fā)生明顯反差變化的反應(yīng)液為初步判斷該內(nèi)生真菌具有合成金屬納米粒子的標(biāo)志，鑒于發(fā)酵過(guò)程中生物反應(yīng)量濃度較低，為了增加篩選確定性，將反應(yīng)液濃縮5倍后以納米銀粒子的特殊吸收波長(zhǎng)范圍(400～460 nm，特定波長(zhǎng)420 nm)為檢測(cè)依據(jù)[14]，全波長(zhǎng)掃描范圍300～600 nm，間隔1 nm，觀察38株內(nèi)生真菌的反應(yīng)液是否在此范圍內(nèi)出現(xiàn)吸收峰。參考文獻(xiàn)[14]報(bào)道，精確篩選出具有合成金屬納米粒子活性的內(nèi)生真菌以及活性強(qiáng)弱。

2.1.4 具有納米粒子合成活性菌株的粒度分析 取具有合成金屬納米粒子生物活性菌株的2次發(fā)酵液適量，采用粒度分析儀檢測(cè)納米銀粒徑，并進(jìn)行粒度分析。

2.2 具有金屬納米粒子合成活性內(nèi)生真菌的分子鑒定 高活性內(nèi)生真菌Am-R02經(jīng)平板培養(yǎng)后，無(wú)菌提取真菌菌塊，經(jīng)真空干燥后制備干燥的菌絲，在液氮條件下將菌絲組織塊研磨至100目粉狀，采用CTAB法來(lái)提取內(nèi)生真菌DNA，并檢測(cè)DNA純度和濃度，經(jīng)PCR反應(yīng)后，送三聯(lián)兄弟生物醫(yī)藥研究(北京)有限公司測(cè)序，獲得ITS序列在GenBank，Blast進(jìn)行比對(duì)分析，選擇相似率最高的真菌ITS序列，用MEGA軟件Clustal X方法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用Neighbor-Joining法，Boottrap值設(shè)置1 000構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹對(duì)內(nèi)生真菌鑒定[15]。

2.3 內(nèi)生真菌Am-R02生物合成納米銀條件優(yōu)化

2.3.1 單因素試驗(yàn) 對(duì)反應(yīng)時(shí)間(1、2、4、6、8、10、12、24 h)、AgNO3濃度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L)、反應(yīng)溫度(24、26、28、30、32 ℃)、pH值(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)進(jìn)行考察。

2.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以AgNO3濃度(A)、反應(yīng)溫度(B)、pH值(C)為影響因素，吸光度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用Design-Expert V 8.05軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，因素水平見表1。

表1 因素水平

2.4 透射電鏡分析 在馬弗爐中灼燒納米銀后，研磨再溶解于乙醇，超聲清洗器分散5 min，取10 μL制備液滴在碳支持膜銅網(wǎng)，靜置5 min，去除多余液體，滴加2%磷鎢酸于碳支持膜銅網(wǎng)靜置2 min，去除多余液體，室溫干燥后置于透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像分析。

2.5 抑菌試驗(yàn)

2.5.1 納米銀制備 按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備Am-R02二次發(fā)酵液共3 L，按“2.3”項(xiàng)下優(yōu)化條件制備納米銀，收集反應(yīng)液，15 000 r/min離心10 min，收集沉淀，進(jìn)行冷凍干燥，即得。取適量在無(wú)菌條件下超聲分散于去離子水中，得到1.0 mg/mL溶液。

2.5.2 抑菌作用測(cè)定 采用二倍梯度稀釋法[16]測(cè)定。取1.0 mg/mL納米銀溶液100 μL至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用LB液體培養(yǎng)基以二倍梯度稀釋法依次稀釋至0.03～500 μg/mL。將2.0×107CFU/mL細(xì)菌懸液以100 μL/孔密度接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，設(shè)培養(yǎng)基對(duì)照孔、菌液對(duì)照孔、陽(yáng)性對(duì)照孔(氨芐西林、四環(huán)素)，微孔板加蓋，保鮮膜密封以減少孵育過(guò)程中的水分蒸發(fā)，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，在630 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，確定最小抑菌濃度(MIC)。

3 結(jié)果

3.1 活性菌株篩選 根據(jù)反應(yīng)液顏色變化(圖1)和全波長(zhǎng)掃描測(cè)定結(jié)果，篩選得到具有合成納米銀活性的黃芪內(nèi)生真菌有4株，分別為Am-R02、Am-R11、Am-R16、Am-R24，見表2。在400～460 nm波長(zhǎng)處，Am-R02、Am-R11、Am-R16、Am-R24均有最大吸收峰，在420 nm處的光密度分別為1.532 1、0.436 2、0.747 9、0.423 3，表明Am-R02合成納米銀能力最強(qiáng)，其次為Am-R16、Am-R11，Am-R24最弱。

注：左邊二次發(fā)酵液無(wú)金屬離子，右邊二次發(fā)酵液添加了金屬離子。圖1 活性菌株Am-R02顏色

3.2 粒度分析 Am-R02產(chǎn)生的納米銀粒徑分布較均勻，以0～5 nm為主，占總數(shù)的1/3，5～10、10～15、15～20 nm的粒徑均占15%；Am-R11產(chǎn)生的納米銀粒徑大多在25 nm以下，以0～5 nm為主，占總數(shù)50%以上，而5～10 nm占1/3，10～25 nm在10%以內(nèi)；Am-R16產(chǎn)生的納米銀粒徑大多在30 nm以下，以0～5 nm為主，占總數(shù)50%以上，

表2 活性菌株篩選結(jié)果

而5～10 nm占1/3，10～20 nm在20%以內(nèi)；Am-R24產(chǎn)生的納米銀粒徑大多在30 nm以下，以0～5 nm為主，占總數(shù)70%，而5～10 nm占10%，10～25 nm占20%，見圖2。

圖2 納米銀粒徑分布

3.3 Am-R02測(cè)序和進(jìn)化樹分析 Am-R02的ITS序列長(zhǎng)度為556 bp，BLAST比對(duì)結(jié)果表明，其rDNA-ITS序列與Aspergillusparvisclerotigenus的相應(yīng)序列的同源性為100%。系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)顯示，該菌株與Aspergillusparvisclerotigenus聚在一支，支持率為100。最終，將Am-R02鑒定為Aspergillusparvisclerotigenus。

圖3 Am-R02系統(tǒng)發(fā)育分析

3.4 合成條件優(yōu)化

3.4.1 反應(yīng)時(shí)間 由圖4可知，反應(yīng)10 min時(shí)開始有納米銀合成，隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增多，在12 h時(shí)吸光度最高，但之后逐漸降低，可能是因?yàn)榧{米銀開始大量分解，故選擇12 h作為反應(yīng)時(shí)間。另外，超過(guò)12 h后納米銀積累值趨于飽和，故響應(yīng)面試驗(yàn)不再將反應(yīng)時(shí)間作為影響因素。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)合成納米銀的影響

3.4.2 AgNO3濃度 由圖5可知，不同濃度AgNO3溶液與發(fā)酵液反應(yīng)時(shí)，吸光度呈明顯差異，在2 mmol/L時(shí)最高，故選擇2 mmol/L左右作為AgNO3濃度。

圖5 AgNO3濃度對(duì)合成納米銀的影響

3.4.3 反應(yīng)溫度 由圖6可知，隨著反應(yīng)溫度增加，納米銀合成速率加快，在28 ℃時(shí)吸光度最高，故選擇28 ℃左右作為反應(yīng)溫度。

3.4.4 pH 由圖7可知，在pH為8.0時(shí)吸光度最高，即納米銀合成效率最高，而在9.0時(shí)吸光度略有下降，5.0時(shí)最低，說(shuō)明在酸性條件下抑制了納米銀合成，故選擇8.0左右作為pH。另外，pH對(duì)合成納米銀的影響程度大于反應(yīng)時(shí)間、AgNO3濃度，其原因可能是pH影響了納米銀合成通路的酶活性，具體需要深入研究。

3.4.5 響應(yīng)面試驗(yàn) 以AgNO3濃度(A)，反應(yīng)溫度(B)、pH(C)為影響因素，吸光度(Y)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化合成條件，結(jié)果見表3。

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4 方差分析

響應(yīng)面分析顯示，隨著各因素增加或延長(zhǎng)，吸光度隨之升高，但之后反而有降低趨勢(shì)，并且各因素之間交互作用不顯著，與方差分析結(jié)果一致。殘差圖分析顯示，模型呈正態(tài)分布，殘差擬合曲線為線性，預(yù)測(cè)值呈散點(diǎn)分布，表明擬合結(jié)果可靠。另外，預(yù)測(cè)值與實(shí)際值的擬合情況良好，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)呈散點(diǎn)分布并位于直線兩側(cè)，同時(shí)誤差較小。

最終確定，最優(yōu)條件為AgNO3濃度1.97 mmol/L，反應(yīng)溫度27.67 ℃，pH 8.01，吸光度0.711，考慮到實(shí)驗(yàn)操作的可行性，將其修正為AgNO3濃度2.0 mmol/L，反應(yīng)溫度28 ℃，pH 8。

3.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 按“3.4”項(xiàng)下優(yōu)化條件進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得吸光度分別為0.681、0.702、0.715，平均值為0.699，RSD為2.45%，表明該條件穩(wěn)定可靠。

3.6 形態(tài)表征 Am-R02胞內(nèi)提取物合成的納米銀呈球形或近球形，大小形態(tài)均一，粒徑主要為1～20 nm，分散性較好，呈單一分散狀態(tài)，見圖8。

圖8 納米銀透射電鏡圖

3.7 抑菌作用實(shí)驗(yàn) 由表5可知，納米銀對(duì)各細(xì)菌均有較強(qiáng)的抑制效果，介于氨芐西林和四環(huán)素之間。

4 討論

本研究從黃芪根的38株內(nèi)生真菌篩選具有合成金屬納米粒子能力的內(nèi)生真菌，獲得了4株能合成納米銀的菌株，其中合成活性最高的內(nèi)生真菌Am-R02鑒定為Aspergillusparvisclerotigenus。對(duì)Am-R02合成納米銀的條件優(yōu)化得到最佳條件為pH 8.0，AgNO3濃度2 mmol/L，反應(yīng)時(shí)間12 h。在影響納米銀合成的條件中，pH值屬于顯著性因素，后續(xù)pH值的影響機(jī)制需要深入研究。

表5 抑菌作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Mohan等[17]研究發(fā)現(xiàn)，較低濃度的納米銀即能夠抑制銅綠假單胞菌和大腸桿菌的生長(zhǎng)。Morones等[18]發(fā)現(xiàn)粒徑1～100 nm的納米銀對(duì)革蘭氏陰性菌有很好的殺菌作用，推測(cè)可能是納米銀緩釋銀離子，進(jìn)而起到一定的殺菌效果。本研究發(fā)現(xiàn)，Am-R02合成的納米銀的粒徑主要分布在20 nm以下，抑菌作用實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了其在低濃度時(shí)就對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有很好的抑制作用，本研究合成的納米銀表征形態(tài)以及其在低濃度的抗菌活性數(shù)據(jù)與張映[19]利用鉤狀木霉生物還原制備納米銀的性質(zhì)類似，而抑菌性研究結(jié)果與以上學(xué)者利用其它植物內(nèi)生真菌合成納米銀的研究結(jié)果有一定的差異性，說(shuō)明真菌胞外生物合成納米銀的抑菌能力與真菌種屬類別有一定的關(guān)系。