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    西方蜜蜂工蜂不同蟲態(tài)發(fā)育的轉錄組學分析

    2022-06-15 06:05:40宋文菲胡宗文苗春輝余玉生楊爽李亞輝
    南方農業(yè)學報 2022年3期
    關鍵詞:差異表達基因信號通路生長發(fā)育

    宋文菲 胡宗文 苗春輝 余玉生 楊爽 李亞輝

    摘要:【目的】基于轉錄組學對西方蜜蜂工蜂不同蟲態(tài)間的差異表達基因(DEGs)進行篩選和功能注釋分析,揭示與工蜂生長發(fā)育相關的信號通路,為深入解析工蜂生長發(fā)育的分子調控機理提供基礎數(shù)據。【方法】以西方蜜蜂工蜂的3日齡幼蟲、1日齡蛹和1日齡羽化工蜂3個蟲態(tài)為研究對象,利用llumina NovaSeq 6000平臺進行轉錄組測序,采用DESeq2篩選不同蟲態(tài)樣品間的表達差異基因,然后分別進行GO功能注釋分析及KEGG信號通路富集分析,并通過實時熒光定量PCR進行驗證?!窘Y果】經轉錄組測序,在西方蜜蜂工蜂3日齡幼蟲與1日齡蛹間篩選出4823個差異表達基因(51.86%上調,48.14%下調),在1日齡蛹與1日齡羽化工蜂間篩選出3295個差異表達基因(57.51%上調,42.49%下調),在3日齡幼蟲與1日齡羽化工蜂間篩選出5267個差異表達基因(52.95%上調,47.05%下調)。GO功能注釋分析結果顯示,3日齡幼蟲與1日齡蛹間的差異表達基因注釋到43個GO功能條目,1日齡蛹與1日齡羽化工蜂間的差異表達基因注釋到45個GO功能條目,3日齡幼蟲與1日齡羽化工蜂間的差異表達基因注釋到44個GO功能條目,主要涉及細胞過程、細胞部分及結合等。KEGG信號通路富集分析發(fā)現(xiàn),3日齡幼蟲與1日齡蛹間有2905個差異表達基因富集到332條KEGG信號通路上,其中17條KEGG信號通路呈顯著富集,涉及核糖體、氧化磷酸化和昆蟲激素生物合成等;1日齡蛹與1日齡羽化工蜂間有1644個差異表達基因富集到331條KEGG信號通路上,其中45條KEGG信號通路呈顯著富集,涉及氧化磷酸化、生熱作用和胰島素分泌等;3日齡幼蟲與1日齡羽化工蜂間有2958個差異表達基因富集到337條KEGG信號通路上,其中14條KEGG信號通路呈顯著富集,涉及核糖體、蛋白酶體和胰島素分泌等。6個隨機挑選差異表達基因的實時熒光定量PCR檢測結果與轉錄組測序結果相符,即轉錄組測序結果可靠。【結論】昆蟲激素生物合成通路相關差異表達基因調控與西方蜜蜂工蜂各蟲態(tài)JH滴度變化規(guī)律一致,氧化磷酸化信號通路則與各蟲態(tài)的營養(yǎng)攝入和活動行為相關,而胰島素分泌通路涉及各蟲態(tài)的營養(yǎng)調控、脂肪體合成及細胞凋亡??梢?,昆蟲激素生物合成、胰島素分泌和氧化磷酸化3種信號通路在西方蜜蜂工蜂幼蟲、蛹和成蟲的發(fā)育調控中發(fā)揮著重要作用。

    關鍵詞:西方蜜蜂;工蜂;生長發(fā)育;差異表達基因;信號通路;轉錄組測序

    中圖分類號:S891? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼: A 文章編號:2095-1191(2022)03-0748-11

    Transcriptome analysis of development of different stages in Apis mellifera worker bees

    SONG Wen-fei HU Zong-wen MIAO Chun-hui YU Yu-sheng YANG Shuang LI Ya-hui

    (1College of Animal Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming, Yunnan? 650201, China;

    2Sericulture and Apiculture Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences,

    Mengzi, Yunnan? 661101, China)

    Abstract:【Objective】To screen and functional annotation analysis of differentially expressed genes (DEGs) among different stages of Apis mellifera worker bees based on transcriptomics, reveal signaling pathways related to development of worker bees,so as to provide basic data for in-depth analysis of the molecular regulation mechanism of growth and deve-lopment of worker bees. 【Method】The 3-day-old larvae,1-day-old pupae and 1-day-old eclosion worker bees were takenas the research objects. Transcriptome sequencing was performed by Illumina NovaSeq 6000 platform,and screening of DEGs among different worker bees samples by DESeq2. GO functional annotation analysis and KEGG signaling pathway enrichment analysis were performed, and then real-time quantative PCR (qRT-PCR) verification was conducted. 【Result】After transcriptome sequencing, 4823 DEGs (51.86% up-regulated, 48.14% down-regulated) were screened between 3-day-old larvae and 1-day-old pupae of A. mellifera worker bees. 3295 DEGs were screened between 1-day-old pupae and 1-day-old eclosion worker bees (57.51% up-regulated, 42.49% down-regulated), 5267 DEGs (52.95% up-regulated, 47.05% down-regulated) were screened between 3-day-old larvae and 1-day-old eclosion worker bees. The annotated GO function entries in the GO database of the three instar differential genes were 43 (between 3-day-old larvae and 1-day-old pupae), 45 (between 1-day-old pupae and 1-day-old eclosion worker bees), and 44 (between 3-day-old larvae and 1-day-old eclosion worker bees) respectively, mainly involving cellular process, cell part, binding, etc. KEGG signaling pathway enrichment analysis results showed that 2905 DEGs were enriched in 332 KEGG signaling pathways between 3-day-old larvae and 1-day-old pupae, of which 17 KEGG signaling pathways were significantly enriched, involving ribosomes, oxidation phosphorylation and insect hormone biosynthesis.1644 DEGs were enriched in 331 KEGG signaling pathways between 1-day-old pupae and 1-day-old eclosion worker bees, of which 45 KEGG signaling pathways were significantly enriched, involving oxidative phosphorylation, thermogenesis and insulin secretion. 2958 DEGs were enriched in 337 KEGG signaling pathways between 3-day-old larvae and 1-day-old eclosion worker bees, of which 14 KEGG signaling pathways were significantly enriched, involving ribosomes, proteasomes and insulin secretion. The qRT-PCR results of 6 randomly selected DEGs were consistent with the transcriptome sequencing results, indicating that the transcriptome sequencing results were reliable. 【Conclusion】The regulation of DEGs related to insect hormone biosynthesis pathway is consistent with the change rule of juvenile hormone(JH) titer in different stages of A. mellifera worker bees. The oxidative phosphorylation signaling pathway is related to the nutrient intake and activity behavior of different stages, and the insulin secretion pathway involves in the regulation of nutritional regulation, fat body synthesis and apoptosis of diffe-rent stages. The results showsthat three signaling pathways of insect hormone biosynthesis, insulin secretion and oxidative phosphorylation play important roles in the developmental regulation of larvae, pupae and adult of A. mellifera worker bees.4293EE6F-6C74-4C82-858F-238197A4E9A1

    Key words:Apis mellifera;worker bees; growth and development; differentially expressed genes;signaling pathway; transcriptome sequencing

    Foundation items:National Modern Agriculture Industry Technology System(Honey Bee) Construction Project(CARS-44-SYZ16); Yunnan Province Science and Technology Plan Project (202105AF150052); Yunan Science and Technology Mission Funding Project (202204BI090013)

    0 引言

    【研究意義】西方蜜蜂(Apis mellifera L.)是一類以雌性為主的社會性昆蟲,受級型分化影響雌性單元分化為蜂王和工蜂,蜂王負責繁殖后代和維持秩序,而數(shù)量最多的工蜂承擔著覓食、哺育及筑巢等職能分工(Amdam and Seehuus,2006;Barchuk et al.,2007;宋文菲等,2021)。工蜂在生長發(fā)育過程中受到營養(yǎng)物質和內激素的共同影響(李成成等,2011;Wang et al.,2014),如缺少花粉會引起幼蟲和成年工蜂的發(fā)育受阻(Wang et al.,2014;Di Pasquale et al.,2016;Martin et al.,2021)。內激素主要包括保幼激素(Juvenile hormone,JH)和蛻皮激素(20-hydroxyecdysone,20E),會影響工蜂的變態(tài)發(fā)育和級型分化(李茫等,2019)。至今,針對西方蜜蜂(工蜂和蜂王)幼蟲階段差異表達基因(Differentially expressed genes,DEGs)和代謝通路的研究已有相關報道,證實工蜂和蜂王的幼蟲在不同發(fā)育階段的基因種類和表達水平存在明顯差異,蜂王在幼蟲早期具有獨特的基因表達譜,hexamerin 70b基因和雷帕霉素靶蛋白(TOR)信號通路與其級型分化密切相關(Chen et al.,2012;Cameron et al.,2013;He et al.,2017)。但關于西方蜜蜂工蜂胚后發(fā)育的分子調控機理尚不清楚,因此分析工蜂各蟲態(tài)的差異表達基因及其信號通路,可為深入探究工蜂生長發(fā)育的分子調控機理提供理論依據。【前人研究進展】隨著昆蟲基因組學及轉錄組學等分子生物信息學的快速發(fā)展,有關西方蜜蜂級型分化、行為分化和生長發(fā)育等方面的代謝通路調控機理研究已取得階段性進展(Patel et al.,2007;Wang et al.,2013;Harpur et al.,2014)。研究表明,JH是調控西方蜜蜂變態(tài)發(fā)育和級型分化的關鍵因子,其表達水平受表皮生長因子受體(EGFR)信號調控,以及胰島素受體底物(IRS)和TOR信號通路的影響(Patel et al.,2007;Kamakura,2011;Mutti et al.,2011);對蜜蜂幼蟲的IRS和TOR基因進行RNA干擾,可引起體內JH水平下降,進而誘導幼蟲發(fā)育成為工蜂(Patel et al.,2007;Muttiet al.,2011)。胰島素/胰島素樣生長因子信號(IIS)也是工蜂生長發(fā)育的調控因子,通過營養(yǎng)調控和行為分化等方式影響工蜂的發(fā)育。Ament等(2008)研究發(fā)現(xiàn),采集蜂在大腦和腹部的IIS基因表達水平高于哺育蜂,說明IIS可調控成年工蜂的行為分化。Wang等(2013)研究表明,IIS信號通路中的AmILP1和AmILP2基因在工蜂幼蟲發(fā)育過程中發(fā)揮著不同作用,AmILP1基因能顯著降低JH水平,AmILP2基因對脂肪體起調控作用,對幼蟲發(fā)育及其體重均有影響。AmILP-2基因是胰島素樣肽主要轉錄基因,在工蜂中的表達量明顯高于蜂王,說明組織特異性與IIS信號通路相對獨立(de Azevedo and Hartfelder,2008)。與蜂王相比,在工蜂幼蟲早期和中期發(fā)育中以氨基酸、肌肉發(fā)育和一般代謝相關基因的表達較高,在幼蟲中后期則是與細胞凋亡(組織蛋白酶)和自噬細胞死亡的相關基因表達較高(Cameron et al.,2013);不同年齡段工蜂的勞動分工也是通過JH信號通路、胰島素樣/TOR信號通路相互作用來調節(jié),其體內存在著較多的高表達新基因(Johnson and Tsutsui,2011;Harpur et al.,2014)。有關20E對工蜂生長發(fā)育的影響,Hartfelder和Engels(1998)研究發(fā)現(xiàn),20E在工蜂幼蟲階段的滴度水平較低,但在預蛹期和成蟲期分別出現(xiàn)一個峰值;祝智威等(2022)研究證實,3種微小RNA可通過調控20E基因及Hippo和FoxO信號通路的相關基因而影響工蜂蛹期的變態(tài)發(fā)育過程?!颈狙芯壳腥朦c】工蜂是西方蜜蜂蜂群中數(shù)量最多的類型,其生長發(fā)育對蜂群的發(fā)展至關重要。近年來,基于轉錄組學對西方蜜蜂工蜂哺育行為相關基因、工蜂中腸發(fā)育基因的研究表明,工蜂的哺育行為受信號轉導和能量代謝等途徑的調控(高艷等,2020),而TGF-β、Wnt及Hippo等信號通路影響工蜂中腸的生長發(fā)育和免疫能力(杜宇等,2020)。目前有關蜜蜂工蜂和蜂王級型分化差異表達基因及代謝通路的研究已有相關報道(Chen et al.,2012;Cameron et al.,2013;He et al.,2017),但針對工蜂不同蟲態(tài)間的信號通路及調控作用研究鮮見報道?!緮M解決的關鍵問題】通過對西方蜜蜂工蜂的3日齡幼蟲、1日齡蛹和1日齡羽化工蜂3個蟲態(tài)進行轉錄組測序,并對各蟲態(tài)間的差異表達基因進行篩選和功能注釋分析,揭示與工蜂生長發(fā)育相關的信號通路,為深入解析工蜂生長發(fā)育的分子調控機理提供基礎數(shù)據。4293EE6F-6C74-4C82-858F-238197A4E9A1

    1 材料與方法

    1. 1 試驗材料

    供試西方蜜蜂蜂群由云南省農業(yè)科學院蠶桑蜜蜂研究所國家現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系(蜜蜂)紅河綜合試驗站西方蜜蜂試驗蜂場提供。2021年4—5月選擇3群群勢相當?shù)姆淙海咳悍?張空巢脾,待蜂王產卵后收集幼蟲、蛹和成蟲3個發(fā)育蟲態(tài)。為保證相鄰蟲態(tài)間發(fā)育時間相同,以相鄰蟲態(tài)間隔6~7 d取樣(Wang et al.,2015),分別以3日齡幼蟲、1日齡蛹和1日齡羽化工蜂代表幼蟲期、蛹期及成蟲期。3日齡幼蟲以6頭為1個樣本,1日齡蛹和1日齡羽化工蜂則以3頭為1個樣本,每個樣本設3個生物學重復。樣品采集后立即放入液氮中凍斃,-80 ℃保存?zhèn)溆?。TRIzol試劑(Invitrogen)、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser RT-qPCR反轉錄試劑盒及TB Green Premix Ex Taq II購自寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司,DEPC水購自北京索萊寶科技有限公司。主要儀器設備有NanoDrop 2000型分光光度計(Thermo Scientific)、StepOnePlusTM型qPCR儀(Applied Biosystems公司)、梯度PCR儀(Applied Biosystems公司)、低溫高速離心機(Sigma公司)及HWS智能型恒溫恒濕箱(寧波江南儀器廠)等。

    1. 2 cDNA文庫構建及轉錄組測序

    采集樣品在液氮中充分研磨后,根據TRIzol試劑操作說明提取總RNA,利用NanoDrop 2000進行RNA濃度和純度檢測,以瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性,采用Agilent 2100 Nano測定RIN值。質檢合格的RNA,根據TruseqTM RNA Sample Preparation Kit (Illumina)試劑盒說明構建cDNA文庫,然后利用llumina HiSeq Xten/NovaSeq 6000平臺進行高通量測序,獲得原始數(shù)據?;谖鞣矫鄯浠蚪M序列,利用HISAT2序列比對軟件與蜜蜂的基因組注釋信息進行比對(Kim et al.,2015),并將基因/轉錄本在Nr、Swiss-Prot、Pfam、EggNOG、GO和KEGG等數(shù)據庫中進行注釋,全面獲得基因/轉錄本的注釋信息。

    1. 3 轉錄組數(shù)據處理及注釋分析

    利用Cufflinks計算FPKM值,即每百萬個外顯子映射的片段數(shù),用以評估基因表達水平(Trapnell et al.,2010;張蕾等,2020)。采用DESeq2篩選不同蟲態(tài)樣品組間的表達差異基因,篩選參數(shù)設為P<0.01且|log2Fold Change|≥1,上調/下調差異倍數(shù)為2。

    1. 4 實時熒光定量PCR驗證

    從西方蜜蜂工蜂不同蟲態(tài)轉錄組數(shù)據中隨機挑選6個差異表達基因進行實時熒光定量PCR驗證,分別是腺苷酸環(huán)化酶 3基因(Ac3)、蛋白激酶C基因(Pkc)、細胞色素 P450 302a1基因(LOC727118)、胰島素樣肽2基因(ILP-2)、法尼酸甲酯環(huán)氧酶基因(LOC551179)和保幼激素酸O-甲基轉移酶基因(LOC724216)。采用Primer Premier 5.0設計6個差異表達基因的擴增引物,參照Zhang等(2020)的方法設計內參基因(GAPDH)擴增引物,所有引物(表1)均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用反轉錄試劑盒將提取的RNA反轉錄合成cDNA,獲得的cDNA 置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。實時熒光定量PCR反應體系20.0 μL:TB Green Premix Ex Taq II 10.0 μL,正、反向引物(10 μmol/L)各0.8 μL,ROX Reference Dye(50×)0.4 μL,cDNA模板2.0 μL,ddH2O 6.0 μL。擴增程序:95 ℃預變性10 min;95 ℃ 15 s,57 ℃ 1 min,進行40個循環(huán);添加熔解曲線。設3個水平重復孔,采用2-DDCt法換算目的基因相對表達量。

    2 結果與分析

    2. 1 轉錄組測序數(shù)據質控分析結果

    Illumina HiSeq 6000平臺高通量測序結果(表2)顯示,西方蜜蜂工蜂3日齡幼蟲、1日齡蛹和1日齡羽化工蜂的有效序列(Clean reads)分別為44384567、42199177和41901170條。各樣本的Q30均在93.00%以上,GC含量在35.66%~39.61%,表明轉錄組測序數(shù)據質量良好,可用于后續(xù)的研究分析。

    2. 2 西方蜜蜂工蜂不同蟲態(tài)間差異表達基因分析結果

    在西方蜜蜂工蜂3個蟲態(tài)中,3日齡幼蟲與1日齡蛹間存在4823個差異表達基因,表現(xiàn)為51.86%的差異表達基因上調、48.14%的差異表達基因下調(圖1-A);1日齡蛹與1日齡羽化工蜂間存在3295個差異表達基因,表現(xiàn)為57.51%的差異表達基因上調、42.49%的差異表達基因下調(圖1-B);3日齡幼蟲與1日齡羽化工蜂間存在5267個差異表達基因,表現(xiàn)為52.95%的差異表達基因上調、47.05%的差異表達基因下調(圖1-C)。

    2. 3 差異表達基因GO功能注釋分析結果

    3日齡幼蟲與1日齡蛹間的4823個差異表達基因共注釋到43個GO功能條目。其中,以注釋到生物學過程(Biological process)的功能條目最多,有16個(占37.21%),主要涉及細胞過程(Cellular process)(935個差異表達基因,占19.39%)、代謝過程(Metabolic process)(978個差異表達基因,占20.28%)、生物調節(jié)(Biological regulation)(333個差異表達基因,占6.90%)等;注釋到細胞組分(Cellular component)的功能條目有15個(占34.88%),主要涉及膜部分(Membrane part)(839個差異表達基因,占17.40%)、細胞部分(Cell part)(756個差異表達基因,占15.67%)、含蛋白質復合物(Protein-containing complex)(315個差異表達基因,占6.53%)等;注釋到分子功能(Molecular function)的功能條目有12個(占27.91%),主要涉及結合(Binding)(1032個差異表達基因,占21.40%)、催化活性(Catalytic activity)(948個差異表達基因s,占19.66%)、轉運蛋白活性(Transporter activity)(161個差異表達基因,占3.34%)等(圖2-A)。4293EE6F-6C74-4C82-858F-238197A4E9A1

    1日齡蛹與1日齡羽化工蜂間的3295個差異基因共注釋到45個GO功能條目,同樣以注釋到生物學過程的功能條目最多,有17個(占37.78%),主要涉及細胞過程(549個差異表達基因,占16.67%)、代謝過程(562個差異表達基因,占17.06%)、生物調節(jié)(264個差異表達基因,占8.01%)等;注釋到細胞組分的功能條目有15個(占33.33%),主要涉及膜部分(670個差異表達基因,占20.33%)、細胞部分(383個差異表達基因,占11.62%)、膜(Membrane)(199個差異表達基因,占6.04%)等;注釋到分子功能的功能條目有13個(占28.89%),主要涉及結合(624個差異表達基因,占18.94%)、催化活性(619個差異表達基因,占18.79%)、轉運蛋白活性(153個差異表達基因,占4.64%)等(圖2-B)。

    3日齡幼蟲與1日齡羽化工蜂間的5267個差異基因共注釋到44個GO功能條目,同樣以注釋到生物學過程的功能條目最多,占50.00%,主要涉及細胞過程(1020個差異表達基因,占19.37%)、代謝過程(1022個差異表達基因,占19.4%)、生物調節(jié)(430個差異表達基因,占8.16%)等;注釋到細胞組分的功能條目有15個(占34.09%),主要涉及膜部分(936個差異表達基因,占17.77%)、細胞部分(786個差異表達基因,占14.92%)、細胞器(Organelle)(313個差異表達基因,占5.94%)等;注釋到分子功能的功能條目有12個(占27.27%),主要涉及結合(1112個差異表達基因,占21.11%)、催化活性(1010個差異表達基因,占19.18%)、轉運蛋白活性(165個差異表達基因,占3.13%)等(圖2-C)。

    2. 4 差異表達基因KEGG信號通路富集分析結果

    在KEGG數(shù)據庫中比對獲得差異表達基因6351個,涉及有機體系統(tǒng)(Organismal systems)、細胞過程(Cellular process)、環(huán)境信息處理(Environmental information processing)、遺傳信息處理(Genetic information processing)和新陳代謝(Metabolism)五大類(圖3)。其中,有機體系統(tǒng)通路富集到的差異表達基因數(shù)最多(1736個),占可注釋基因數(shù)的27.33%,且以與內分泌系統(tǒng)相關的基因最多;新陳代謝通路富集到的差異表達基因次之(1521個),占23.95%,以與碳水化合物代謝相關的基因最多;遺傳信息處理通路富集到1095個差異表達基因,占17.24%,以與翻譯相關的基因最多;細胞過程通路富集到1076個差異表達基因,占16.94%,以與運輸和分解代謝相關的基因最多;環(huán)境信息處理通路富集到923個差異表達基因,占14.53%,以與信號轉導相關的基因最多。

    在西方蜜蜂工蜂3個蟲態(tài)中,3日齡幼蟲與1日齡蛹間有2905個差異表達基因富集到332條KEGG信號通路上,其中17條KEGG信號通路呈顯著富集(圖4-A),包括核糖體(Ribosome,102個)、氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation,74個)和昆蟲激素生物合成(Insect hormone biosynthesis,19個)等。1日齡蛹與1日齡羽化工蜂間有1644個差異表達基因富集到331條KEGG信號通路上,其中45條KEGG信號通路呈顯著富集(圖4-B),包括氧化磷酸化(74個)、生熱作用(Thermogenesis,83個)和胰島素分泌(Insulin secretion,25個)等。3日齡幼蟲與1日齡羽化工蜂間有2958個差異表達基因富集到337條KEGG信號通路上,其中14條KEGG信號通路呈顯著富集(圖4-C),包括核糖體(104個)、蛋白酶體(Proteasome,32個)和胰島素分泌(28個)等。

    從昆蟲激素生物合成通路上挑選6個差異表達基因進行分析,結果(表3)顯示,這6個差異表達基因從3日齡幼蟲到1日齡蛹出現(xiàn)整體下調的表達趨勢,但從1日齡蛹到1日齡羽化工蜂呈整體上調的表達趨勢。同時從胰島素信號通路上挑選6個差異表達基因進行分析,結果(表4)發(fā)現(xiàn)從3日齡幼蟲到1日齡羽化工蜂,40S核糖體蛋白S6基因(LOC725647)持續(xù)下調;ILP-2基因、胰島素樣受體樣轉錄變體 X3基因(InR-2)和mTOR調節(jié)相關蛋白基因(LOC551668)呈先上調后下調的表達趨勢;己糖激酶1樣基因(LOC408818)和脂肪酸合酶基因(LOC412815)則呈先下調后上調的表達趨勢。

    2. 5 轉錄組數(shù)據實時熒光定量PCR驗證結果

    從西方蜜蜂工蜂不同蟲態(tài)的轉錄組數(shù)據中隨機挑選6個差異表達基因(Ac3、Pkc、ILP-2、LOC727118、LOC551179和LOC724216),采用實時熒光定量PCR進行驗證,結果(圖5)表明,在不同蟲態(tài)中6個差異表達基因的實時熒光定量PCR檢測結果與轉錄組測序結果相符,進一步證實了轉錄組數(shù)據結果的可靠性。

    3 討論

    氧化磷酸化是生物體分解過程中氧化步驟所釋放的能量,并驅動ATP的合成過程(Waites and? Garner,2011)。本研究對西方蜜蜂工蜂的3日齡幼蟲、1日齡蛹和1日齡羽化工蜂進行轉錄組測序分析,結果發(fā)現(xiàn):3日齡幼蟲與1日齡蛹間有102個差異表達基因顯著富集在核糖體通路上,包括RpL32、RpL41及Rps14等101個下調基因,僅有1個基因(LOC724629)上調;有74個差異表達基因顯著富集在氧化磷酸化通路上,包括Cox6c、Ndufs1和Ndufs5等72個下調基因,而LOC408734和LOC100578821基因上調。1日齡蛹與1日齡羽化工蜂間有74個差異表達基因顯著富集在氧化磷酸化通路上,包括Uqcr11、Cox6c和Ndufs5等72個上調基因,而LOC727212和LOC551917基因下調。與蛹和羽化工蜂相比,工蜂會在幼蟲期攝入更多食物,如蜂王漿、花粉及哺育蜂下顎腺分泌物混合物質,因而表現(xiàn)為幼蟲發(fā)育階段的氧化磷酸化增強(Cameron et al.,2013),與本研究中3日齡幼蟲與1日齡蛹間的氧化磷酸化通路差異表達基因下調的結果一致。氧化磷酸化通路差異表達基因在1日齡蛹與1日齡羽化工蜂間上調,故推測是羽化工蜂的行為活動引起氧化磷酸化增強所致。核糖體是由rRNA及核糖體蛋白組成的顆粒狀結構,其中核糖體蛋白主要參與蛋白質的合成、調控轉錄和細胞凋亡等生理過程(Warner and Mclntosh,2009)。Verras等(2004)在地中海實蠅(Ceratitis capitate)中也發(fā)現(xiàn),核糖體蛋白基因CcRpS21在胚胎和幼蟲的表達量高于蛹和成蟲,該結論在本研究中得到進一步驗證。此外,有研究發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白對昆蟲卵的滯育有重要調控作用(李艷艷等,2021),因此相關核糖體蛋白基因的功能值得后續(xù)深入研究。4293EE6F-6C74-4C82-858F-238197A4E9A1

    昆蟲變態(tài)發(fā)育主要由JH和20E協(xié)同調控完成,其中,JH在調控西方蜜蜂工蜂生長和變態(tài)發(fā)育過程中發(fā)揮關鍵作用(洪芳等,2016;李茫等,2019;張慧等,2021)。本研究中,西方蜜蜂工蜂3日齡幼蟲與1日齡蛹間的昆蟲激素生物合成通路顯著富集,對昆蟲內分泌激素相關的6個差異表達基因進行分析,結果發(fā)現(xiàn)3日齡幼蟲與1日齡蛹間的6個差異表達基因整體下調,而1日齡蛹到1日齡羽化工蜂呈整體上調趨勢。在西方蜜蜂工蜂的生長發(fā)育過程中,JH滴度也表現(xiàn)出3日齡幼蟲高于蛹和羽化工蜂(Hartfelder and Engels,1998)。由于工蜂3日齡仍處于幼蟲早期,在完全變態(tài)昆蟲中其幼蟲期體內需保持一定的JH水平,以維持蟲體處于幼蟲蟲態(tài),而化蛹前的JH水平下降及蛻皮激素上升,幼蟲才能正?;迹═ruman and Riddiford,1999)。此外,3~5日齡幼蟲是西方蜜蜂幼蟲級型分化的關鍵期,此時幼蟲在攝入蜂王漿后可進一步提高JH滴度,且能通過蜂王漿和JH轉向蜂王發(fā)育,低齡幼蟲維持一定的JH水平以實現(xiàn)幼蟲的可塑性(Mutti et al.,2011)。故推測西方蜜蜂工蜂由于受到變態(tài)發(fā)育和級型分化的影響,導致從3日齡幼蟲到羽化工蜂其昆蟲激素生物合成相關差異表達基因的表達發(fā)生明顯變化。

    胰島素是一種蛋白質激素,通過IIS信號通路發(fā)揮作用,可調節(jié)生物細胞的生長、代謝及繁殖等(Oldham and Hafen,2003;Wullschleger et al.,2006;Corona et al.,2007)。本研究發(fā)現(xiàn)1日齡蛹與1日齡羽化工蜂、3日齡幼蟲與1日齡羽化工蜂的胰島素分泌信號通路顯著富集,通過對胰島素分泌及胰島素信號通路中的6個差異表達基因進行分析,結果表明,從3日齡幼蟲到1日齡成蟲間,ILP-2、InR-2和LOC551668基因呈現(xiàn)出先上調后下調的表達趨勢,且下調幅度較明顯;而LOC408818和LOC412815基因呈先下調后上調的表達趨勢,下調幅度較明顯;LOC725647基因的表達則持續(xù)下調。李兆英(2013)研究發(fā)現(xiàn),意大利蜜蜂工蜂在幼蟲期的脂肪體細胞數(shù)量增長較快,而在蛹早期出現(xiàn)脂肪體細胞凋亡,之后組建成蟲新的脂肪體,與本研究中的LOC412815基因調控結果基本一致。此外,mTOR調節(jié)相關蛋白和40S核糖體蛋白S6可調節(jié)細胞的生長、增殖和凋亡(Miron and Sonenberg,2001;Wolschin et al.,2011),故推測LOC725647和LOC551668基因可能參與工蜂胚后發(fā)育過程中脂肪體細胞的增殖和凋亡過程。de Azevedo和Hartfelder(2008)研究發(fā)現(xiàn),西方蜜蜂工蜂ILP2基因從3齡幼蟲到5齡呈上調表達趨勢,在5齡幼蟲攝食期間顯著上升,之后呈下調表達;InR-2基因從3齡幼蟲到5齡整體也呈上調趨勢,5齡幼蟲攝食期后開始下調。說明胰島素信號通路可能參與了工蜂幼蟲期的營養(yǎng)調控、脂肪體合成,以及蛹期的脂肪體凋亡過程。

    4 結論

    昆蟲激素生物合成通路相關差異表達基因調控與西方蜜蜂工蜂各蟲態(tài)JH滴度變化規(guī)律一致,氧化磷酸化信號通路則與各蟲態(tài)的營養(yǎng)攝入和活動行為相關,而胰島素分泌通路涉及各蟲態(tài)的JH水平、脂肪體合成及行為分化調控??梢?,昆蟲激素生物合成、胰島素分泌和氧化磷酸化3種信號通路在西方蜜蜂工蜂生長發(fā)育調控中發(fā)揮著重要作用。

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    (責任編輯 蘭宗寶)4293EE6F-6C74-4C82-858F-238197A4E9A1

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