山奈酚增強(qiáng)阿霉素在乳腺癌模型中的抗癌作用*

杜新峰 高 潔 張 浩

（南陽市中心醫(yī)院乳腺甲狀腺外科，南陽 473000）

乳腺癌是女性最致命的疾病之一[1]。阿霉素（doxorubicin，DOX）用于治療早期或淋巴結(jié)陽性、人表皮生長因子受體2陽性和轉(zhuǎn)移性乳腺癌，心臟毒性為其主要的毒副作用，這嚴(yán)重影響了阿霉素的臨床應(yīng)用[2]。據(jù)估計(jì)，癌癥患者中與DOX治療相關(guān)的心臟事件的發(fā)生率在10%～25%之間[3]。山奈酚（Kaempferol，KPL）是一種安全的植物化學(xué)和膳食補(bǔ)充劑，動(dòng)物模型研究證實(shí)其能減少氧化應(yīng)激和對抗阿霉素心臟毒性[4-5]。此外，KPL還通過多種機(jī)制抑制腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，包括激活抑癌基因，激活caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯，降低雌激素受體α（ERα）水平以及抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶[6-7]。然而，KPL作為佐劑應(yīng)用于癌癥治療方案的研究鮮有報(bào)道。本研究假設(shè)KPL聯(lián)合DOX治療可以增強(qiáng)DOX的抗癌潛能，并在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證，以期為阿霉素治療乳腺癌的臨床治療方案提供研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞培養(yǎng)

32只健康雌性BALB/c裸鼠（SPF級(jí)，4～6周齡，體質(zhì)量20～25 g），購自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK（豫）2010-0002]，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房[SYXK（豫）2010-0016]。裸鼠分籠飼養(yǎng)，自然晝夜節(jié)律變化，自由飲食。室溫23℃±2℃，相對濕度40%～60%。

乳腺上皮細(xì)胞MCF10A（ATCC CRL-10317）和乳腺癌來源的細(xì)胞系MCF-7（ATCC HTB-22）均購自美國ATCC公司。將MCF-10A細(xì)胞置于含有1.5 nmol/L霍亂毒素的乳腺上皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基（ MEGM）中、MCF-7細(xì)胞置于含有10% FBS和0.01 mg/mL人重組胰島素的Eagle氏最低要素培養(yǎng)基（MEM）中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待其融合度達(dá)90%時(shí)以1∶2比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.2 試劑與耗材

MEGM、0.01 mg/mL人重組胰島素的MEM（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Opsys酶標(biāo)儀（美國Dynex Technologies公司）；阿霉素、山奈酚（美國Sigma公司）；VEVO 770高分辨率活體顯微成像系統(tǒng)（加拿大Visualonics公司）；MTT試劑盒、RIPA裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；兔抗組蛋白去乙酰化酶（HDAC）抗體、兔抗DNA甲基化酶（DNMT）抗體、兔抗ERα抗體、兔抗caspase-3抗體、兔抗核因子EZ相關(guān)因子2（Nrf2）及β-actin抗體、HRP結(jié)合二抗（美國Santa Cruz Biotechnology公司）；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)（英國Amersham公 司）；ELISA試 劑 盒（美 國R&D Systems公司）；過氧化脂質(zhì)（LPO）和還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒（上海恪敏生物科技有限公司）；CX31顯微鏡（日本Olympus公司）；兔抗caspase-3抗體及兔抗PARP抗體（美國Santa Cruz公司）等。

1.3 MTT法測定細(xì)胞毒性

取對數(shù)生長期的MCF-10A細(xì)胞或MCF-7細(xì)胞，以5 000～6 000個(gè)/孔密度接種于96孔板，于 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞用不同濃度（0.010、0.100、1.000、10.000 μmol/L）的藥物（每孔20 μL）處理72 h，隨后每孔加入20 μL MTT溶液（4 mg/mL）。于37℃下孵育4 h后，棄去含MTT的培養(yǎng)基，每孔加入100 μL DMSO。將板置于搖床上振搖15 min。借助Opsys酶標(biāo)儀在570 nm處測定其吸光度。計(jì)算藥物半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.4 動(dòng)物模型的構(gòu)建、分組及給藥

使用原位乳腺癌模型評估KPL對DOX誘導(dǎo)的腫瘤消退的影響。取對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞，經(jīng)蛋白胰酶消化、離心后將其重懸于PBS中，以1×107細(xì)胞/mL細(xì)胞密度取100 μL注射到裸鼠頸部皮下。當(dāng)腫瘤體積為5～6 mm3時(shí)，小鼠開始接受治療。

根據(jù)腫瘤體積將乳腺癌小鼠分為4組，每組8只：溶媒組給予PBS，每天1次，每周5 d，共3周；DOX組小鼠腹腔注射DOX，劑量為5 mg/kg，每周1次，共計(jì)15 mg/kg；KPL組以4 mg/kg的劑量口服KPL每天1次，每周5 d，共3周；DOX+KPL組聯(lián)合DOX組和KPL組的給藥方案進(jìn)行治療。每3 d監(jiān)測1次動(dòng)物體質(zhì)量，以調(diào)整藥物劑量，確定治療相關(guān)毒性和疾病進(jìn)展。每隔3 d用卡尺測量腫瘤大小，記錄腫瘤的2個(gè)垂直直徑，即腫瘤的最短和最長直徑。腫瘤體積計(jì)算為π/6（a）2×（b），其中a為最短直徑和b為最長直徑。在完成給藥方案處理后的次日，小鼠眼球取血，置于肝素化的離心管中，以2 300×g離心分離血漿。脫頸處死小鼠，切除心和腫瘤組織，并在-80℃下保存。在整個(gè)研究期間，所有小鼠都能自由飲食和飲水。

1.5 超聲心動(dòng)圖評價(jià)各組小鼠的心功能

在治療開始前1 d和完成終次治療后次日，使用VEVO 770高分辨率活體顯微成像系統(tǒng)和RMV 707B掃描頭（中心頻率17.5 MHz，頻段11.5～23.5 MHz，焦距17.5 mm），在每只小鼠左心室中部水平，從2～3個(gè)短軸M型記錄中獲得超聲心動(dòng)圖參數(shù)。

1.6 免疫印跡檢測HDAC、DNMT、ERα、caspase-3及Nrf2蛋白的表達(dá)情況

取對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞，以1×105個(gè)/孔的密度接種在6孔板，待其完全貼壁后，分別用KPL（2.5 μmol/L）和/或DOX（2.5 μmol/L）處理48 h，僅收集貼壁細(xì)胞。將細(xì)胞或心組織（50 mg）置于含PMSF的RIPA裂解液中，置于冰浴上裂解30 min。在12 000×g下4℃離心15 min，收集上清液，采用BCA蛋白試劑測定各組樣品蛋白質(zhì)濃度，沸水浴蛋白變性10 min。每孔30 μg蛋白樣品，于12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離，隨后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜（PVDF）。用含5%脫脂乳在20℃封閉膜2 h，分別置于含兔抗HDAC抗體（1∶1 000）、兔抗DNMT抗體（1∶500）、兔抗ERα抗體（1∶500）、兔抗caspase-3抗體（1∶1 500）、兔抗Nrf2抗體（1：1 000）和β-actin（1∶2 000）一抗稀釋液中于4℃孵育過夜。次日用TBST洗膜3次，每次10 min。在室溫下用HRP標(biāo)記的二抗稀釋液（1∶5 000）孵育2 h。在增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)中觀察結(jié)果。以β-actin為內(nèi)參照，使用Image J軟件對圖片進(jìn)行定量分析。

1.7 ELISA試劑盒檢測炎性標(biāo)志物腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白介素6（IL-6）的水平

根據(jù)制造商的說明，使用ELISA試劑盒測定血漿中TNF-α和IL-6的水平。

1.8 過氧化脂質(zhì)（LPO）及還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒檢測各組小鼠心氧化應(yīng)激水平

根據(jù)制造商的說明，使用LPO及GSH試劑盒測定從治療組和溶媒治療組獲得的心活檢樣本中LPO和GSH的水平。

1.9 乳腺腫瘤的組織病理學(xué)分析

將乳腺腫瘤組織用多聚甲醛固定，石蠟包埋24 h，H-E染色，然后通過CX31顯微鏡進(jìn)行檢查。組織學(xué)由病理學(xué)專家雙盲評價(jià)。

1.10 免疫組織化學(xué)檢測各組小鼠心組織中caspase-3、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）的表達(dá)

將甲醛固定、石蠟包埋的組織樣品切成4 μm切片，置于60℃培養(yǎng)箱中孵育3～12 h。脫蠟和再水化后，在蒸汽壓力鍋中用檸檬酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)2 min，切片迅速冷卻至室溫。采用3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗滌。加入兔抗caspase-3抗體（1∶150）、兔抗PARP抗體（1∶200）后在4℃下孵育過夜。然后在室溫下用二抗孵育20 min，用0.05% 3，3’-二氨基聯(lián)苯胺顯影，并用蘇木精-伊紅（H-E試劑盒）復(fù)染。由病理學(xué)專家雙盲使用CX31顯微鏡，并隨機(jī)選擇5個(gè)視場對所有載玻片進(jìn)行檢查。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用±s表示，組間比較采用單因素方差分析及t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KPL與DOX協(xié)同作用的細(xì)胞毒性分析

為了研究DOX聯(lián)合KPL對乳腺的正常上皮細(xì)胞和癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性，使用正常乳腺上皮細(xì)胞MCF10A和乳腺癌來源的細(xì)胞系MCF-7進(jìn)行了MTT分析。在MCF10A和MCF-7細(xì)胞系中，KPL的IC50值分別為4.430、4.075 μmol/L，DOX的IC50值分別為0.190、0.077 μmol/L，DOX+KPL的IC50值分別為0.043、0.009 μmol/L。此外，這2個(gè)細(xì)胞系中，DOX+KPL的細(xì)胞毒性均高于DOX（圖1A、B）。MCF-7細(xì)胞對DOX+KPL的敏感性是MCF10A的4.8倍，這表明DOX+KPL具有較好的抗癌選擇性，對乳腺癌細(xì)胞具有較高的細(xì)胞毒性。

圖1 用DOX聯(lián)合KPL處理的正常乳腺上皮細(xì)胞MCF10A（A）和乳腺癌來源的細(xì)胞系MCF-7（B）的濃度反應(yīng)曲線

2.2 KPL與DOX協(xié)同作用對HDAC、DNMT、ERα、caspase-3蛋白表達(dá)的影響

乳腺癌細(xì)胞經(jīng)處理48 h后，單用KPL治療可以抑制HDAC表達(dá)并降低ERα水平。當(dāng)KPL＋DOX處理時(shí)，這種抑制作用會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)（P＜0.05）。此外，KPL＋DOX顯著降低了DNMT表達(dá)（P＜0.05）（圖2）。

圖2 KPL與DOX在體外協(xié)同抑制MCF-7癌細(xì)胞HDAC、DNMT和ERα表達(dá)，提高caspase-3表達(dá)

2.3 KPL與DOX協(xié)同抗癌作用

為了研究KPL與DOX在癌癥治療中的功效，使用乳腺癌小鼠模型。治療后MCF-7腫瘤大小的變化如圖3A和3B所示，溶媒、KPL、DOX和DOX+KPL治療21d后MCF-7腫瘤體積分別為2 685.8、1 885.9 、1 062.1 mm3和438.4 mm3，腫瘤質(zhì)量分別為3.57 、2.33 、1.33 g和0.51 g（圖3C）。在21 d的治療期內(nèi)，KPL顯著增強(qiáng)了DOX對MCF-7腫瘤生長的抑制作用。KPL＋DOX比單獨(dú)使用DOX對MCF-7腫瘤的生長具有更強(qiáng)的抑制作用，這與之前的體外結(jié)果一致。

圖3 KPL與DOX協(xié)同作用對乳腺癌小鼠腫瘤生長的影響（n=8）

2.4 KPL與DOX協(xié)同對小鼠心功能的影響

為了確定KPL是否在DOX治療期間提供心保護(hù)作用，在整個(gè)療程結(jié)束后，通過超聲心動(dòng)圖評估心功能。結(jié)果顯示，治療后DOX組的每搏輸出量、射血分?jǐn)?shù)、短軸縮短率和心輸出量均較治療前顯著降低（P＜0.05），而KPL＋DOX組的上述指標(biāo)在治療前后未出現(xiàn)明顯差異（P＞0.05）（圖4）。結(jié)果表明，KPL可以防止由DOX引起的心功能障礙。

圖4 KPL與DOX協(xié)同對乳腺癌小鼠每搏輸出量（A）、射血分?jǐn)?shù)（B）、短軸縮短率（C）和心輸出量（D）的影響

2.5 KPL與DOX協(xié)同對小鼠心氧化應(yīng)激和炎性標(biāo)志物水平的影響

氧化應(yīng)激檢查結(jié)果顯示，單用DOX治療后，心組織中Nrf2幾乎不表達(dá)，MDA水平顯著升高，而GSH則降至溶媒組心水平的50%以下。KPL+DOX治療促進(jìn)了心組織中Nrf2的表達(dá)，減少了MDA的形成，也防止了DOX誘導(dǎo)的GSH水平降低（P＜0.05，P＜0.01）（圖5A～C）。此外，KPL和DOX聯(lián)合治療顯著降低了單用DOX誘導(dǎo)的TNF-α和IL-6炎性細(xì)胞因子水平升高（P＜0.05，P＜0.01）（圖5D）。

圖5 KPL與DOX協(xié)同對小鼠心氧化應(yīng)激和炎性標(biāo)志物水平的影響

2.6 MCF-7腫瘤的組織學(xué)和免疫組織化學(xué)分析

H-E染色結(jié)果顯示KPL+DOX組和DOX組呈現(xiàn)明顯的核凝聚和碎裂。相比之下，溶媒組細(xì)胞保持正常形態(tài)和KPL組表現(xiàn)出部分核凝聚和碎裂。KPL+DOX組 的caspase-3和PARP表達(dá)水平顯著升高，表明KPL+DOX導(dǎo)致MCF-7腫瘤細(xì)胞凋亡水平高于其他3組。因此，組織學(xué)和免疫組織化學(xué)分析支持KPL+DOX的有效抗癌活性（圖6，見封三）。

圖6 MCF-7腫瘤的組織學(xué)和免疫組織化學(xué)顯色比較，×100，標(biāo)尺=20 μm

3 討論

乳腺癌是世界上女性發(fā)病率和死亡率最高的疾病[6]。根據(jù)最新的癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌的最高發(fā)病率是在澳大利亞和新西蘭（每10萬人有94.2人），其次是西歐（每10萬人有92.6人）和北部歐洲（10萬人有90.1人），而東亞地區(qū)的乳腺癌發(fā)病率相對較低（每10萬人有39.2人）[6]。研究表明，在東亞，尤其是在中國，乳腺癌的低發(fā)病率與日常食用含有大量類黃酮的食物有關(guān)[7]。此外，許多研究已證實(shí)類黃酮在預(yù)防和治療乳腺癌中的作用[8]。實(shí)際上，天然化合物的抗乳腺癌作用一直是科學(xué)家關(guān)注的領(lǐng)域之一。目前，抗腫瘤藥物的發(fā)現(xiàn)旨在降低癌細(xì)胞凋亡的閾值，使癌細(xì)胞對藥物敏感，同時(shí)使其毒性更易于控制[9]。本研究評估了KPL作為DOX化療輔助劑的療效，MTT結(jié)果顯示，KPL+DOX對正常乳腺上皮細(xì)胞MCF10A和乳腺癌來源的細(xì)胞系MCF-7的毒性比DOX高，并且MCF-7細(xì)胞比MCF10A更容易受到KPL+DOX的侵害，這表明KPL+DOX不僅具有改善抗癌功效，而且具有良好的抗癌選擇性。研究進(jìn)一步建立了原位乳腺癌小鼠模型評估KPL+DOX的體內(nèi)抑癌活性，結(jié)果顯示DOX和KPL+DOX可以將MCF-7腫瘤的質(zhì)量和體積縮小為溶媒組的2.5倍和6.1倍。這些結(jié)果表明KPL+DOX可能在乳腺癌的治療中具有更好的應(yīng)用。

DOX引起的心毒性可能是急性或慢性的，兩者都可能導(dǎo)致心肌病和隨后的嚴(yán)重心力衰竭。本研究中，乳腺癌小鼠經(jīng)DOX治療后，每搏輸出量、射血分?jǐn)?shù)、短軸縮短率和心輸出量均較治療前顯著降低，而KPL+DOX組的上述指標(biāo)在治療前后未出現(xiàn)明顯差異，結(jié)果表明KPL可以降低DOX誘發(fā)心毒性。這可能與KPL處理可顯著減少心氧化應(yīng)激的現(xiàn)象有關(guān)。已證實(shí)，KPL是Nrf2的有效激活劑，它是細(xì)胞對親電/氧化應(yīng)激反應(yīng)的中央調(diào)節(jié)劑?；钚匝醯漠a(chǎn)生增加，氧化還原狀態(tài)的改變和有氧糖酵解產(chǎn)生的能量使心肌細(xì)胞膜受損和心肌線粒體DNA損傷[10]。本研究結(jié)果顯示，KPL上調(diào)了經(jīng)DOX處理的大鼠心中Nrf2蛋白的表達(dá)，同時(shí)增加了Nrf2靶酶GSH的活性和降低了MDA的形成，有效減少氧化應(yīng)激并抵消DOX的心毒性。除了直接的毒性作用外，DOX誘導(dǎo)的ROS還可以誘導(dǎo)NF-κB活化，從而導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子如TNF-α和IL-6的表達(dá)[11]。本研究的結(jié)果表明，KPL降低了DOX處理產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子的血清水平，表明KPL在減少DOX介導(dǎo)的炎癥中起主要作用。

KPL通過激活caspase-3，抑制DNMT和HDAC活性以及降低ERα水平來表現(xiàn)出抗癌活性[12-13]。這些抗癌活性的機(jī)制不同于DOX殺死癌細(xì)胞的機(jī)制[14]。因此，研究假設(shè)與KPL共同治療可以通過激活DOX以外的其他關(guān)鍵抗腫瘤機(jī)制來增強(qiáng)腫瘤消退。MCF-7腫瘤切片的組織學(xué)分析證明KPL+DOX具有顯著的抗腫瘤活性。Caspase-3是細(xì)胞程序性死亡（凋亡）的重要調(diào)節(jié)因子。PARP是caspase-3和7的主要底物，是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志物[15]。Caspase-3和PARP染色顯示，與其他3組相比，KPL+DOX組MCF-7腫瘤細(xì)胞凋亡水平最高。據(jù)報(bào)道，DOX可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯（G2/M和/或G1/S），然后是細(xì)胞質(zhì)FasL三聚體數(shù)量的下降，caspase-3、caspase-8、caspase-9的激活，PARP的裂解，最終導(dǎo)致細(xì)胞的死亡[16]。本研究結(jié)果表明KPL+DOX導(dǎo)致MCF-7腫瘤細(xì)胞凋亡水平高于其他3組，與體外觀察的結(jié)果一致。此外，KPL可能通過降低雌激素受體α水平以及抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶，抑制腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果證實(shí)了上述結(jié)論，DOX與KPL共同處理會(huì)減弱MCF-7腫瘤細(xì)胞中DNMT和HDAC活性，降低了ERα水平，表明KPL可能通過其他不同于DOX殺死癌細(xì)胞的機(jī)制來增強(qiáng)DOX的抗癌潛能。

總之，目前的結(jié)果表明KPL作為一種常見且安全的膳食補(bǔ)充劑，可增強(qiáng)DOX殺死癌細(xì)胞的能力，同時(shí)減少DOX相關(guān)的心臟毒性。研究提示KPL的應(yīng)用，對于提高乳腺癌治療有效性和安全性具有重要意義。