LncRNA HOTTIP在胃癌D2根治術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)、耐藥及預(yù)后中的作用

沈珠花 徐永燦 喬鵬

[摘要] 目的 分析LncRNA HOTTIP在 胃癌D2根治術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)、耐藥及預(yù)后中的作用。 方法 隨機(jī)選取2018年1月至2020年6月在湖州市中心醫(yī)院行胃癌D2根治術(shù)的126例胃癌患者作為研究對(duì)象。 結(jié)果 胃癌組織中LncRNA HOTTIP表達(dá)水平明顯升高，胃癌組織LncRNA HOTTIP表達(dá)水平與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵襲深度及術(shù)后復(fù)發(fā)明顯相關(guān)。TNM分期、侵襲深度越高并伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)的患者LncRNA HOTTIP越高。Kaplan-Meier生存曲線分析，LncRNA HOTTIP高表達(dá)組患者生存期均明顯低于LncRNA HOTTIP低表達(dá)組患者。SGC7901/DDP組細(xì)胞LncRNA HOTTIP表達(dá)水平明顯高于SGC7901組（P<0.01）。LncRNA HOTTIP低表達(dá)組細(xì)胞增殖能力及凋亡能力明顯強(qiáng)于對(duì)照組，存活率明顯低于對(duì)照組（P<0.05）。 結(jié)論 LncRNA HOTTIP在胃癌組織中的表達(dá)水平明顯升高，且其表達(dá)水平與患者的復(fù)發(fā)及預(yù)后明顯相關(guān);經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，下調(diào)LncRNA HOTTIP的表達(dá)能夠明顯抑制細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低胃癌細(xì)胞的耐藥性，提高對(duì)化療藥物的敏感性。

[關(guān)鍵詞] LncRNA HOTTIP;胃癌D2根治術(shù);腫瘤復(fù)發(fā);耐藥;預(yù)后

[中圖分類(lèi)號(hào)] R735.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2022）13-0042-05

[Abstract] Objective To analyze the role of LncRNA HOTTIP in tumor relapse， drug resistance and prognosis after D2 radical surgery for gastric cancer. Methods A total of 126 patients with gastric cancer who underwent D2 radical surgery for gastric cancer in Huzhou Central Hospital from January 2018 to June 2020 were randomly selected as study subjects. Results The expression level of LncRNA HOTTIP was significantly increased in gastric cancer tissues，which was significantly correlated with tumor node metastasis （TNM） stage，lymph node metastasis，invasion depth and postoperative relapse.The higher the TNM stage and the deeper the invasion depth， the higher the LncRNA HOTTIP expression level in patients with lymph node metastasis and postoperative relapse.The Kaplan-Meier survival analysis showed that the survival period was shorter in patients with high-expression level of LncRNA HOTTIP than that in patients with low-expression level of LncRNA HOTTIP.The expression level of LncRNA HOTTIP in the SGC7901/DDP group was significantly higher than that in the SGC7901 group（P<0.01）.The cell proliferation ability and apoptosis ability in the group with low-expression level of LncRNA HOTTIP were significantly higher than those in the control group， and the survival rate was significantly lower than that in the control group（P<0.05）. Conclusion The expression level of LncRNA HOTTIP is significantly increased in gastric cancer tissues， and its expression level is significantly correlated with the tumor relapse and prognosis of patients. Meanwhile， it is found that the down-regulation of LncRNA HOTTIP expression can significantly inhibit cell proliferation，suppress cell activity，promote apoptosis， reduce drug resistance of gastric cancer cells，and improve the sensitivity to chemotherapeutic drugs.

[Key words] LncRNA HOTTIP; D2 radical surgery for gastric cancer; Tumor relapse; Drug resistance; Prognosis

目前，臨床上治療胃癌主要采用手術(shù)聯(lián)合放化療的綜合治療方法，其中，順鉑是臨床上常用的化療藥物[1]。但化療藥物耐藥性的產(chǎn)生仍是造成術(shù)后患者復(fù)發(fā)的重要原因[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)[4-5]，腫瘤細(xì)胞耐藥性的發(fā)生與機(jī)體內(nèi)異常表達(dá)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non coding RNA，LncRNA）關(guān)系密切。Wu等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌中高表達(dá)的HOXA末端轉(zhuǎn)錄本反義RNA（HOXA transcript at the distal tip，HOTTIP）被認(rèn)為是促進(jìn)卵巢癌發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)的重要因素。本研究旨在探討LncRNA HOTTIP對(duì)胃癌D2根治術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)、耐藥及預(yù)后的作用，為臨床治療提供相關(guān)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選取2018年1月至2020年6月在湖州市中心醫(yī)院行胃癌D2根治術(shù)的126例胃癌患者作為研究對(duì)象。收集手術(shù)切除的胃癌組織及癌旁正常組織（各126例樣本）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均符合胃癌的診斷及治療標(biāo)準(zhǔn)[7]，且經(jīng)病理學(xué)檢查確診;②無(wú)精神疾病史，能夠配合;③參與研究前未經(jīng)放化療治療;④經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn);⑤患者及家屬均知情并簽訂知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①病歷資料不全或中途退出者;②伴有乙肝等感染性疾病患者;③合并其他惡性腫瘤者。

人胃癌細(xì)胞系SGC7901（武漢普諾賽生命科技有限公司）。根據(jù)LncRNA HOTTIP對(duì)胃癌復(fù)發(fā)診斷的最佳截?cái)嘀捣譃長(zhǎng)ncRNA HOTTIP高表達(dá)組（n=67）與LncRNA HOTTIP低表達(dá)組（n=59）。

1.2 主要儀器及試劑

WB-1-15電熱恒溫水浴箱（上海實(shí)貝儀器設(shè)備廠）;WMJ-9590光學(xué)顯微鏡（上海豫光儀器有限公司）;TL-988-IV實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀（濟(jì)南光耀醫(yī)療設(shè)備有限公司）;SIGMA 3-18K低溫高速離心機(jī)（華威科創(chuàng)（武漢）科技有限公司）;DW-86W300超低溫冰箱（浙江捷盛低溫設(shè)備有限公司）;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（廣州東盛生物科技有限公司）;CytoFLEX流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司）;胎牛血清（上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司）;PBS緩沖液（重慶賽諾生物藥業(yè)股份有限公司）;兔抗人LC3單克隆抗體（上海易匯生物科技有限公司）;兔抗人Beclin1多克隆抗體（上?，庬嵣锟萍加邢薰荆?順鉑（齊魯制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H37191358，規(guī)格：10 mg/瓶）。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)胃癌組織及癌旁正常組織中LncRNA HOTTIP表達(dá)情況? 取胃癌組織及癌旁正常組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用核酸蛋白微量測(cè)定儀測(cè)定提取物RNA水平;使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，多次實(shí)驗(yàn)以減小誤差。待反應(yīng)完成后確認(rèn)實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增曲線與融解曲線，進(jìn)行PCR定量時(shí)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用2-△△Ct的方法[其中ΔΔCt=（Ct，目的基因-Ct，管家基因）實(shí)驗(yàn)組-（Ct，目的基因-Ct，管家基因）對(duì)照組]計(jì)算LncRNA HOTTIP的表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)? 構(gòu)建SGC7901（SGC7901組）順鉑耐藥細(xì)胞株SGC7901/DDP（SGC7901/DDP組），培養(yǎng)出能夠耐受60 Um/L順鉑的胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/DDP，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SGC7901/DDP細(xì)胞，加入胰蛋白酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染? 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以10 000個(gè)/孔接種至96孔板，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)75%左右。將LncRNA HOTTIP干擾質(zhì)粒及空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)SGC7901/DDP細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以適當(dāng)密度接種至6孔板，置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，獲得LncRNA HOTTIP低表達(dá)組及對(duì)照組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。見(jiàn)圖1。

1.3.4 采用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖能力? 取細(xì)胞懸液以10 000個(gè)/孔接種至96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，使用酶標(biāo)儀測(cè)定470 nm處的吸光度值。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。

1.3.5 采用CCK-8法觀察LncRNA HOTTIP對(duì)胃癌細(xì)胞存活的影響? 觀察各組的細(xì)胞存活率，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。

1.3.6 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)LncRNA HOTTIP對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響? 計(jì)算細(xì)胞凋亡率。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 臨床病理資料收集? 收集胃癌患者的性別、年齡、分化程度（根據(jù)WHO病理組織學(xué)分類(lèi)）[8]、TNM分期（Ⅱ、Ⅲ）（國(guó)際抗癌聯(lián)盟/美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)制定的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)）[9]、腫瘤位置（胃體、胃竇、近端、多發(fā)）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（是、否）、腫瘤大?。ā? cm、>5 cm）、侵襲深度（T1+T2+T3、T4）（以浸潤(rùn)至黏膜或黏膜下層為T(mén)1，浸潤(rùn)至肌層或漿膜下層為T(mén)2，腫瘤穿透漿膜層為T(mén)3，腫瘤直接侵及臨近組織或器官為T(mén)4）[10]、術(shù)后復(fù)發(fā)（是、否）等基本資料。

1.4.2 LncRNA HOTTIP表達(dá)水平檢測(cè)? 取患者胃癌組織及癌旁正常組織，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)患者胃癌組織LncRNA HOTTIP表達(dá)水平。

1.4.3 LncRNA HOTTIP表達(dá)水平與患者臨床病理資料的相關(guān)性? 比較胃癌組織中LncRNA HOTTIP表達(dá)水平與患者臨床病理資料的相關(guān)性。

1.4.4 LncRNA HOTTIP表達(dá)水平與患者預(yù)后的相關(guān)性? 采用電話(huà)、復(fù)診等方法隨訪共10個(gè)月，建立Kaplan-Meier生存曲線，根據(jù)LncRNA HOTTIP對(duì)胃癌復(fù)發(fā)診斷的最佳截?cái)嘀捣譃長(zhǎng)ncRNA HOTTIP高表達(dá)組（n=67）與LncRNA HOTTIP低表達(dá)組（n=59），分析LncRNA HOTTIP表達(dá)水平與患者預(yù)后的相關(guān)性。

1.4.5 SGC7901細(xì)胞與SGC7901/DDP細(xì)胞中LncRNA HOTTIP表達(dá)水平檢測(cè)? 以SGC7901/DDP細(xì)胞作為SGC7901/DDP組，以胃癌細(xì)胞SGC7901作為SGC7901組，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)胃癌細(xì)胞SGC7901與耐藥胃癌細(xì)胞SGC7901/DDP中Lnc RNA HOTTIP表達(dá)水平。

1.4.6 細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞存活率檢測(cè)? 采用CCK-8法觀察LncRNA HOTTIP低表達(dá)組及對(duì)照組細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞存活率變化，分析LncRNA HOTTIP表達(dá)水平對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力及存活的影響。

1.4.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè)? 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)LncRNA HOTTIP低表達(dá)組及對(duì)照組細(xì)胞凋亡變化，分析LncRNA HOTTIP表達(dá)水平對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn);LncRNA HOTTIP表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系采用Kaplan-Meier生存曲線分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 126例胃癌臨床病理資料分析

126 例胃癌患者中，70.63%的患者分化程度較低，69.84%的患者TNM分期處于Ⅲ期，以胃竇處多發(fā)，大多數(shù)患者伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，超過(guò)50%的患者侵襲深度為T(mén)4，且術(shù)后復(fù)發(fā)。見(jiàn)表2。

2.2 胃癌組織與癌旁正常組織中LncRNA HOTTIP表達(dá)水平

胃癌組織中LncRNA HOTTIP表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)表3。

2.3 不同臨床病理的胃癌組織中LncRNA HOTTIP表達(dá)水平

胃癌組織中LncRNA HOTTIP表達(dá)水平與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵襲深度及術(shù)后復(fù)發(fā)明顯相關(guān)（P<0.05），與性別、年齡、分化程度、腫瘤位置、腫瘤大小無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05）。見(jiàn)表4。

2.4 胃癌組織的LncRNA HOTTIP表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系

建立ROC曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LncRNA HOTTIP對(duì)胃癌復(fù)發(fā)診斷的最佳截?cái)嘀禐?.52，以2.52為界分為L(zhǎng)ncRNA HOTTIP高表達(dá)組（n=67）與LncRNA HOTTIP低表達(dá)組（n=59）。建立Kaplan-Meier生存曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LncRNA HOTTIP高表達(dá)組患者的生存期均明顯低于LncRNA HOTTIP低表達(dá)組患者。見(jiàn)圖2。

2.5 胃癌細(xì)胞與耐藥胃癌細(xì)胞的LncRNA HOTTIP表達(dá)水平

SGC7901/DDP組細(xì)胞的LncRNA HOTTIP表達(dá)水平明顯高于SGC7901組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)表5。

2.6 LncRNA HOTTIP表達(dá)水平對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的影響

LncRNA HOTTIP低表達(dá)組的細(xì)胞增殖能力明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表6。

2.7 LncRNA HOTTIP表達(dá)水平對(duì)胃癌細(xì)胞存活的影響

隨著順鉑濃度的增加，細(xì)胞存活率明顯降低。LncRNA HOTTIP低表達(dá)組的細(xì)胞存活率明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表7。

2.8 LncRNA HOTTIP表達(dá)水平對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

LncRNA HOTTIP低表達(dá)組的細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見(jiàn)表8。

3 討論

手術(shù)是治療胃癌的首選方法，但術(shù)后復(fù)發(fā)率高，易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[11]。順鉑是胃癌化療的常用藥物，具有抗癌譜廣、療效確切的特點(diǎn)[12]。但腫瘤細(xì)胞耐藥性的出現(xiàn)增加患者的治療難度[13]。化療耐藥性的出現(xiàn)是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，可能是多種機(jī)制共同作用的結(jié)果[14]。LncRNA是一種多功能非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄起始、終止及核內(nèi)運(yùn)輸?shù)戎匾M(jìn)程中扮演重要角色[15]。有研究發(fā)現(xiàn)[16]，LncRNA在多種病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。HOTTIP為HOXA基因與遠(yuǎn)端識(shí)別關(guān)鍵位點(diǎn)的控制元件，據(jù)報(bào)道[17]，其能夠通過(guò)激活其近端基因HOXA13從而參與多種腫瘤的增殖、凋亡甚至耐藥。本研究旨在探討LncRNA HOTTIP在胃癌D2根治術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)、耐藥及預(yù)后中的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中LncRNA HOTTIP表達(dá)水平明顯升高，胃癌組織LncRNA HOTTIP表達(dá)水平與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵襲深度及術(shù)后復(fù)發(fā)明顯相關(guān)。TNM分期、侵襲深度越高并伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)的患者LncRNA HOTTIP越高。最后，本研究采用Kaplan-Meier生存曲線分析發(fā)現(xiàn)，LncRNA HOTTIP與患者生存預(yù)后明顯相關(guān)，LncRNA HOTTIP高表達(dá)組患者的生存期明顯低于LncRNA HOTTIP低表達(dá)組患者。LncRNA HOTTIP可以作為反映胃癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)[18]。

本研究采用SGC7901細(xì)胞建立順鉑耐藥細(xì)胞模型SGC7901/DDP，發(fā)現(xiàn)SGC7901/DDP組細(xì)胞LncRNA HOTTIP表達(dá)水平明顯高于SGC7901組（P<0.001）。LncRNA HOTTIP低表達(dá)組細(xì)胞的增殖能力及凋亡能力明顯強(qiáng)于對(duì)照組，存活率明顯低于對(duì)照組（P<0.05）。表明下調(diào)LncRNA HOTTIP的表達(dá)能夠明顯提高胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。這可能是因?yàn)檎{(diào)控LncRNA的表達(dá)能夠提高藥物在細(xì)胞內(nèi)的聚集，從而增強(qiáng)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[19-20]。

綜上所述，LncRNA HOTTIP在胃癌組織中表達(dá)水平明顯升高，且其表達(dá)水平與患者的復(fù)發(fā)及預(yù)后明顯相關(guān);經(jīng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，下調(diào)LncRNA HOTTIP的表達(dá)能夠明顯抑制細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低胃癌細(xì)胞的耐藥性，提高對(duì)化療藥物的敏感性。

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（收稿日期：2021-07-21）