子宮內(nèi)膜非典型增生中TRF1、TRF2和H3K27me3的表達(dá)及意義

郭慧 譚麗珊 梁春燕 吳立琦 陳玉英

[摘要] 目的 探討端粒重復(fù)序列結(jié)合因子1（TRF1）、端粒重復(fù)序列結(jié)合因子2（TRF2）和組蛋白H3K27三甲基化（H3K27me3）免疫組化在子宮內(nèi)膜非典型增生組織中的診斷作用。方法? 收集2016年3月至2018年11月廣東省韶關(guān)市第一人民醫(yī)院診斷的不伴子宮內(nèi)膜非典型增生標(biāo)本30例和子宮內(nèi)膜非典型增生標(biāo)本60例及子宮內(nèi)膜樣癌30例。利用免疫組化SP法檢測(cè)TRF1、TRF2及H3K27me3在這些標(biāo)本中的表達(dá)情況。結(jié)果? TRF1、H3K27me3、TRF2在子宮內(nèi)膜非典型增生組中的表達(dá)率分別為35.00%（21/60）、43.33%（26/60）、71.67%（43/60），在不伴非典型子宮內(nèi)膜增生組的表達(dá)率83.33%（25/30）、73.33%（22/30）、30.00%（9/30），在子宮內(nèi)膜樣癌組中的表達(dá)率為30.00%（9/30）、36.67%（11/30）、76.67%（23/30）。子宮內(nèi)膜非典型增生與不伴非典型子宮內(nèi)膜增生表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;子宮內(nèi)膜非典型增生與子宮內(nèi)膜樣腺癌表達(dá)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論? 子宮內(nèi)膜非典型增生TRF1及H3K27me3低表達(dá)，TRF2高表達(dá)，聯(lián)合TRF1、TRF2和H3K27me3有助于鑒別不典型子宮內(nèi)膜增生與不伴有非典型子宮內(nèi)膜增生，有助于子宮內(nèi)膜非典型增生的早期診斷，推薦在常規(guī)病理工作中使用。

[關(guān)鍵詞] 子宮內(nèi)膜非典型增生;TRF1;TRF2;H3K27me3;診斷

[中圖分類號(hào)] R364.3+1;R711? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2022）13-0001-03

[Abstract] Objective To investigate the effects of telomere repeat binding factor 1 （TRF1）， telomere repeat binding factor 2 （TRF2） and histone H3K27 trimethylation （H3K27me3） immunohistochemistry in the diagnosis of endometrial atypical hyperplasia tissues. Methods A total of 30 specimens without endometrial atypical hyperplasia， 60 specimens with endometrial atypical hyperplasia， and 30 specimens with endometrioid carcinoma were collected in Shaoguan First People′s Hospital in Guangdong Province from March 2016 to November 2018. The immunohistochemical SP method was used to detect the expressions of TRF1， TRF2 and H3K27me3 in these specimens. Results The expression rates of TRF1， H3K27me3， and TRF2 in the group with atypical endometrial dysplasia were 35.00% （21/60）， 43.33% （26/60）， and 71.67% （43/60）， respectively. The expression rates in the group without atypical endometrial hyperplasia were 83.33% （25/30）， 73.33% （22/30）， and 30.00% （9/30）， respectively. The expression rates in the group with endometrioid carcinoma were 30.00% （9/30）， 36.67% （11/30）， and 76.67% （23/30）， respectively. There were statistically significant differences in the expression rates between the group with atypical endometrial hyperplasia and the group without atypical endometrial hyperplasia （P<0.05）. There were no statistically significant differences in the expression rates between the group with atypical endometrial hyperplasia and the group with endometrioid carcinoma （P>0.05）. Conclusion TRF1 and H3K27me3 are low-expressed in endometrial atypical hyperplasia， and TRF2 is high-expressed. The combination of TRF1， TRF2 and H3K27me3 can help distinguish the group with endometrial atypical hyperplasia from the group without endometrial atypical hyperplasia， which is helpful in early diagnosis of endometrial atypical hyperplasia. It is recommended in routine pathological practice.4AB23247-607D-40CA-BF76-62F0E29BF349

[Key words] Endometrial atypical hyperplasia; TRF1; TRF2; H3K27me3; Diagnosis

子宮內(nèi)膜非典型增生（endometrial atypical hyperplasia，EAH）是子宮內(nèi)膜在無(wú)抵抗的雌激素刺激下過(guò)度增生，且被覆的腺上皮細(xì)胞失去極性出現(xiàn)非典型性。Kurman等[1]發(fā)現(xiàn)，在不伴子宮內(nèi)膜非典型增生中，1.6%的病例進(jìn)展為癌;而子宮內(nèi)膜非典型增生進(jìn)展為癌的風(fēng)險(xiǎn)為15%～28%[1-2]。其中年輕患者約占1%～15%，大多是早期子宮內(nèi)膜樣腺癌，而高達(dá)70%的育齡期患者確診時(shí)仍未生育[3];其他子宮內(nèi)膜增生患者無(wú)一例發(fā)生癌變。近年來(lái)越來(lái)越多的有生育要求的EAH患者，希望在病變緩解后實(shí)現(xiàn)生育。因此，判斷子宮內(nèi)膜是否具有非典型性以及EAH的早診斷、早治療的意義就很重要。本研究運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)探討TRF1，TRF2和H3K27me3在不伴子宮內(nèi)膜非典型增生、子宮內(nèi)膜非典型增生、子宮內(nèi)膜樣癌中的表達(dá)情況，旨在尋找子宮內(nèi)膜非典型增生的早期篩查方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2016年3月至2018年11月廣東省韶關(guān)市第一人民醫(yī)院診斷性刮宮或子宮切除標(biāo)本120例，其中不伴子宮內(nèi)膜非典型增生30例，年齡40～65歲，子宮內(nèi)膜非典型增生60例，年齡25～55歲，子宮內(nèi)膜樣癌30例，年齡53～67歲。所有標(biāo)本術(shù)前3個(gè)月均未接受放化療及激素治療，診斷結(jié)果均由2名高級(jí)職稱的病理醫(yī)師雙盲確診一致。所有納入本課題的對(duì)象均知情同意，且通過(guò)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑

TRF1，TRF2購(gòu)于美國(guó)Abcam公司，TRF1的批號(hào)為20114010G，TRF2的批號(hào)為20114020G，鼠抗人Histone H3K27me3單克隆抗體購(gòu)于廈門(mén)通靈生物醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)為：20715391G，三種抗體均為稀釋液（即用型）。

1.3 免疫組化及判定結(jié)果

所有組織均經(jīng)常規(guī)石蠟包埋、組織切片，采用免疫組織化學(xué)Sp法檢測(cè)組織中的TRF1，TRF2，H3K27me3表達(dá)。判定結(jié)果：TRF1蛋白在子宮內(nèi)膜細(xì)胞漿中表達(dá)，TRF2蛋白在子宮內(nèi)膜細(xì)胞漿及細(xì)胞核中均不同程度表達(dá)，H3K27me5在子宮內(nèi)膜細(xì)胞核中表達(dá)。再根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比及染色強(qiáng)度分別計(jì)分判定TRF1、TRF2、H3K27me3的染色結(jié)果：①陽(yáng)性染色強(qiáng)度：0分無(wú)染色，1分淡黃色，2分棕黃色，3分棕褐色;②陽(yáng)性細(xì)胞比例：0分≤10%;1分 11%～50%;2分51%～75%，3分>75%。兩者相乘后積分：0分（-）、1～2分（+）、3～4分（++），5～9分（+++）。免疫組化結(jié)果見(jiàn)封三圖1～9。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析應(yīng)用Spearman秩相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TRF1、TRF2、H3K27me3在不同子宮內(nèi)膜中的表達(dá)

不伴子宮內(nèi)膜非典型增生的TRF-1、H3K27me3陽(yáng)性表達(dá)率分別為83.33%、73.33%，明顯高于在子宮內(nèi)膜非典型增生（35.00%、43.33%）與子宮內(nèi)膜樣癌（30.00%、36.67%）中的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。不伴子宮內(nèi)膜非典型增生的TRF2陽(yáng)性表達(dá)率為30.00%，明顯低于在子宮內(nèi)膜非典型增生（71.67%）與子宮內(nèi)膜樣癌（76.67%）中的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。子宮內(nèi)膜非典型增生的TRF1、TRF2、H3K27 me3陽(yáng)性表達(dá)率分別為35.00%、71.67%、43.33%，與子宮內(nèi)膜樣癌的陽(yáng)性表達(dá)率（30.00%、76.67%、36.67%）比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.635，P=0.613，P=0.545）。見(jiàn)表1。

2.2 不伴子宮內(nèi)膜非典型增生與子宮內(nèi)膜非典型增生中TRF1、TRF2蛋白表達(dá)的相關(guān)性

Spearman相關(guān)分析顯示：在30例不伴子宮內(nèi)膜非典型增生中，TRF1、TRF2蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性（rs=-0.462，P<0.05）。而在60例子宮內(nèi)膜非典型增生中，TRF1、TRF2蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性（rs=-0.509，P<0.05）。見(jiàn)表2～3。

2.3 在子宮內(nèi)膜非典型增生組中H3K27me3表達(dá)與TRF1、TRF2蛋白表達(dá)的關(guān)聯(lián)分析

Peasrson卡方檢驗(yàn)顯示，60例子宮內(nèi)膜非典型增生組中，H3K27me3表達(dá)陽(yáng)性與TRF1蛋白陽(yáng)性存在正性關(guān)聯(lián)（χ2=34.32，r=0.763，P<0.001），H3K27me3表達(dá)陽(yáng)性與TRF2蛋白陽(yáng)性表達(dá)存在負(fù)性關(guān)聯(lián)（χ2=11.37，r=-0.439，P<0.01）。

3 討論

子宮內(nèi)膜非典型增生（EAH）作為子宮內(nèi)膜樣癌（endometrioid carcinoma，EC）的前驅(qū)病變，兩者在分子遺傳學(xué)水平上表現(xiàn)為一個(gè)疾病的連續(xù)性不同階段[4]。據(jù)報(bào)道，子宮內(nèi)膜樣癌的發(fā)生，遵循從不伴子宮內(nèi)膜非典型增生（endometrial hyperplasia，EH）→子宮內(nèi)膜非典型增生/子宮內(nèi)膜上皮內(nèi)瘤變（endometrial intrepithelial neoplasia，EIN）→子宮內(nèi)膜樣癌的過(guò)程[5]?，F(xiàn)在子宮內(nèi)膜非典型增生患者越來(lái)越多，年齡越來(lái)越年輕，有統(tǒng)計(jì)顯示約3%～5%的患者年齡在40歲以下[6]。因此早期發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜非典型增生非常必要。本研究通過(guò)H3K27me3、TRF1、TRF2蛋白在子宮內(nèi)膜非典型增生中的不同表達(dá)，可早期診斷EAH，從而為臨床醫(yī)生對(duì)子宮內(nèi)膜非典型增生的早期預(yù)防和治療提供依據(jù)，具有重要的臨床實(shí)用價(jià)值。4AB23247-607D-40CA-BF76-62F0E29BF349

分子生物學(xué)研究表明端粒是由重復(fù)的TTAGGG序列及端粒結(jié)合蛋白所組成，其功能是確保阻止內(nèi)源性或外源性因子對(duì)染色體結(jié)構(gòu)的破壞，阻止細(xì)胞凋亡引起的染色體損傷，從而維持染色體的完整性[7]。細(xì)胞端粒功能異常是導(dǎo)致細(xì)胞異變，繼而引發(fā)癌癥發(fā)生的重要原因[8-9]。

TRF1和TRF2是兩種不同的端粒結(jié)合因子。TRF1通過(guò)與端粒DNA末端的特異性結(jié)合來(lái)改變端粒的結(jié)構(gòu)，從而以順式作用方式抑制端粒酶與端粒的結(jié)合，達(dá)到阻止端粒延長(zhǎng)的目的，影響細(xì)胞的癌變[10]。TRF2能夠保持端粒長(zhǎng)度動(dòng)態(tài)平衡，保持端粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，正性影響細(xì)胞癌變進(jìn)程。國(guó)外研究表明，惡性腫瘤組織TRF1的表達(dá)明顯降低，而TRF2較正常組織明顯增高[11]。趙鵬等[12]發(fā)現(xiàn)胃癌組織中TRF2蛋白表達(dá)較正常胃黏膜組織增高，TRF1蛋白表達(dá)較正常胃黏膜組織降低。陳向等[13]的研究表明，TRF2在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，TRF1在肝癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織。國(guó)內(nèi)在肝癌、宮頸癌及胃癌等腫瘤與TRF1、TRF2的相關(guān)性研究中大多也得出類似結(jié)果：TRF1蛋白在癌前病變和癌組織中的表達(dá)低于正常組織及癌旁組織; TRF2蛋白在癌前病變和癌組織中的表達(dá)高于正常組織及癌旁組織。研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜非典型增生中的TRF2表達(dá)明顯增高，TRF1表達(dá)降低。TRF1蛋白表達(dá)的降低可能與端粒酶的激活有關(guān)，較少的TRF1蛋白允許更多的端粒酶接近端粒DNA以延長(zhǎng)縮短的端粒，而TRF2蛋白表達(dá)的上調(diào)則參與了端粒長(zhǎng)度的負(fù)性調(diào)節(jié)和結(jié)構(gòu)的維持;TRF1、TRF2表達(dá)的改變共同作用于端粒的動(dòng)態(tài)平衡，從而導(dǎo)致子宮內(nèi)膜不典型增生。

表觀遺傳是在基因的DNA序列不發(fā)生變化的條件下，基因功能發(fā)生可遺傳的變化，其主要發(fā)生機(jī)制包括DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA調(diào)控、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重構(gòu)等[14]。組蛋白H3K27me3的修飾是表觀遺傳中重要的基因沉默標(biāo)志，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化與增殖之間的平衡，其表達(dá)失衡可導(dǎo)致細(xì)胞增殖分化失控，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[15-16]。H3K27me3由多梳抑制復(fù)合物2（polycomb repressive complex 2，PRC2）產(chǎn)生，PRC2由EZH2、胚胎外胚層發(fā)育蛋白（embryonic ectoderm development，EED）和胚胎肝細(xì)胞抑制蛋白（suppressor of zeste，SUZ12）三部分核心亞基組成。PRC2的改變會(huì)導(dǎo)致H3K27me3表達(dá)失衡。WEI等[17]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌患者中H3K27me3的表達(dá)缺失。本研究發(fā)現(xiàn)，H3K27me3在不伴子宮內(nèi)膜非典型增生組織中高表達(dá)，而在子宮內(nèi)膜非典型增生組織中低表達(dá)，表達(dá)缺失。H3K27me3的表達(dá)缺失，可能是EZH2通過(guò)抑制E-鈣黏蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步喪失催化H3K27三甲基化的能力，引起H3K27me3表達(dá)水平下調(diào)，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

綜上所述，TRF1、H3K27me3在子宮內(nèi)膜非典型增生中低表達(dá)，明顯低于不伴子宮內(nèi)膜非典型增生，而TRF2在子宮內(nèi)膜非典型增生中高表達(dá)，明顯高于不伴子宮內(nèi)膜非典型增生。TRF1與TRF2在子宮內(nèi)膜非典型增生中呈負(fù)相關(guān)，二者通過(guò)負(fù)向調(diào)控促進(jìn)子宮內(nèi)膜非典型增生病變的發(fā)生發(fā)展。H3K27me3在非典型子宮內(nèi)膜增生中低表達(dá)。通過(guò)三者的聯(lián)合檢測(cè)，可以早期發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜非典型增生的患者，從而指導(dǎo)臨床早期治療，降低患者的癌變率。因本研究選取樣本量較少，三者在腫瘤的發(fā)生中的相互作用有待進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? ?Kuman RJ，Kaminski PF，Norris HJ. The behavior of endometrial hyperplasia. A long-term study of “unteated” hyperplasia in 170 patients[J].Cancer，1985，56（2）：403-412.

[2]? ?范源，田莉，王建六.早期子宮內(nèi)膜癌和子宮內(nèi)膜非典型增生患者保留生育功能治療后的助孕策略研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2021，30（8）：633-636.

[3]? ?Soliman PT，Oh JC，Schmeler KM et al. Risk factors for young premenopausal women with endometrial cancer[J].Obster Gynecol，2005，105（3）：575-580.

[4]? ?Matias-Guiu X，Prat J.Molecular pathology of endometrial carcinoma[J].Histopathology，2013，62（1）：111-123.

[5]? ?Kurman RJ，Carcangiu ML，Herrington CS，et al. WHO clas-silcation of tumours of female reproductive organs [M].4th ed.Lyon：IARC，2014：125-130.

[6]? ?Silva-Filho A，Carmo G，Athayde G，et al. Safe fertility-preserving management in gynecological malignancies [J].Arch Gynecol Obstet，2007，275：321-330.

[7]? ?Xu Y，Goldkorn A. Telomere and telomerase therapeutics in cancer[J].Genes，2016，7（6）：22.4AB23247-607D-40CA-BF76-62F0E29BF349

[8]? ?Yoshikawa M，Morine Y，Ikemoto T，et al. Elevated preoperative serum CEA level is associated with poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma through the epithelialmesenchymal transition[J].Anticancer Res，2017， 37（3）：1169-1175.

[9]? ?Hou L，Joyce BT，Tao G，et al. Blood telomere length attrition and cancer development in the normative aging study cohort[J].Ebiomed，2015，2（6）：591-596.

[10]? 王家歡，李震.125I放射粒子植入聯(lián)合肝動(dòng)脈栓塞術(shù)對(duì)原發(fā)性肝癌的療效及對(duì)肝臟TRF1和TRF2表達(dá)影響[J].肝臟，2020，25（4）：402-406.

[11]? Shay JW，Wright WE.Role of telomeres and telomerase in cancer[J].Eur J Cancer，2011，21（6）：349-353.

[12]? 趙鵬，趙上，王艷，等.Fas及TRF1、TRF2在亞硒酸鈉誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡過(guò)程中的表達(dá)[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2014，36（2）：149-153.

[13]? 陳向，汪寶林，吳琛，等.動(dòng)脈灌注化療栓塞聯(lián)合放射粒子植入治療原發(fā)性肝癌患者療效及其對(duì)肝組織TRF1和TRF2表達(dá)的影響[J].實(shí)用肝臟病雜志，2019，22（1）：121-124.

[14]? 王攀，趙洪林，任凡，等.表觀遺傳學(xué)在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展和治療中的新進(jìn)展[J].中國(guó)肺癌雜志，2020，23（2）：91-100.

[15]? 楊帆，張劍寧.兒童彌漫內(nèi)生型橋腦膠質(zhì)瘤H3K27M突變的研究進(jìn)展[J].中國(guó)臨床神經(jīng)外科雜志，2021，26（2）：131-132，136.

[16]? 張培海，孫振興，劉慧婷，等.伴H3K27M突變的脊髓彌漫性中線膠質(zhì)瘤患者的臨床特點(diǎn)和預(yù)后[J].中華神經(jīng)外科雜志，2020，36（11）：1116-1120.

[17]? Wei YK，Xia WY，Zhang ZH，et al. Loss of trimethylation atlysine 27 of histone H3 is a predictor of poor outcome in breast，ovarian，and pancreatic cancers[J].Mol Carcinog，2008，47（9）：701-706.

（收稿日期：2021-08-23）4AB23247-607D-40CA-BF76-62F0E29BF349