永康地區(qū)耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌耐藥表型及分子分型分析

呂美艷 王麗之 胡蘇球 應(yīng)雄江 陳櫟江

肺炎克雷伯菌被認(rèn)為是引起醫(yī)院獲得性感染和社區(qū)獲得性感染的主要腸桿菌科細(xì)菌之一，可引起呼吸道、尿道、手術(shù)部位軟組織及血流感染等，嚴(yán)重者可危及生命[1]。國內(nèi)于2007年首次在浙江發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒介導(dǎo)的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumonia,CRKP）[2]。隨后，全國各地報道了CRKP檢出情況[3-4]。近年來，隨著碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，CRKP檢出率逐年上升，臨床抗感染治療形勢越來越嚴(yán)峻[5]。近年來，永康市第一人民醫(yī)院CRKP分離率明顯升高；因此本研究對該院臨床分離的CRKP臨床分布特征、耐藥表型、耐藥基因型及分子分型進行分析，旨在為本地區(qū)臨床CRKP抗感染治療和院內(nèi)感染防控提供依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 對象 選取永康市第一人民醫(yī)院2017年1月至2019年12月332例住院患者中分離到的332株非重復(fù)CRKP菌株為研究對象。質(zhì)控菌株銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸埃希菌ATCC25922、產(chǎn)酸克雷伯菌ATCC700324均購自國家衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

1.2 方法 隨機選取30株CRKP菌株，采用改良Hodge試驗、頭孢他啶/阿維巴坦紙片擴散法、PCR法檢測CRKP菌株耐藥表型及基因型，采用多位點序列分型（multi-locus sequence typing,MLST）檢測 CRKP菌株等位基因號及分子分型。

1.2.1 改良Hodge試驗 將0.5 MCF的大腸埃希菌ATCC25922菌液均勻涂布于MH平板（批號：20200826B，鄭州安圖生物有限公司），中間貼上厄他培南藥敏紙片（10 μg/片，批號：2953610，英國 Oxoid 公司），接種CRKP菌株；無菌接種環(huán)自紙片外緣向平板邊緣劃線，35℃孵育16～18 h后觀察結(jié)果。結(jié)果判斷：厄他培南抑菌圈內(nèi)出現(xiàn)待檢菌矢狀生長為產(chǎn)碳青霉烯酶[6]。以經(jīng)測序證實產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌為陽性對照株，以產(chǎn)酸克雷伯菌ATCC700324為陰性對照株。

1.2.2 頭孢他啶/阿維巴坦紙片擴散法 將0.5 MCF的CRKP菌液均勻涂布于MH平板，中間貼上頭孢他啶/阿維巴坦藥敏紙片（30 μg/片，批號：SK20，溫州市康泰生物科技有限公司），35℃孵育16～18 h，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，參照CLSI M100-S29頭孢他啶標(biāo)準(zhǔn)判讀CRKP菌株對頭孢他啶/阿維巴坦的體外敏感性。

1.2.3 PCR檢測 制備細(xì)菌DNA模板，參照文獻[7]合成 blaKPC-2、blaIMP-1、blaVIM-1、blaOXA-48、blaNDM-1基因，引物序列見表 1。PCR 總反應(yīng)體系 25 μl，包括 5 U/μl Taq DNA 聚合酶 0.3 μl、10×PCR buffer 2.5 μl、5 mmol/L dNTP mixture 1μl、待測菌 DNA 模板 2 μl、25 μmol/L下游引物 2 μl、25 μmol/L 下游引物 2 μl、ddH2O 15.2 μl。反應(yīng)條件：94℃ 變性1 min；退火1 min，退火溫度見表1；72℃延伸90 s。取10 μl PCR產(chǎn)物經(jīng)含Goldview的20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠成像儀（Chemi－DocXRS，美國Bio-Rad公司）觀察并分析PCR產(chǎn)物的電泳條帶；將陽性結(jié)果送上海桑尼公司進行測序，并與美國國家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站進行生物大分子序列比對，確定耐藥基因型。

表1 目的基因引物序列及產(chǎn)物長度

1.2.4 MLST檢測 根據(jù)選定的肺炎克雷伯菌7個管家基因（gapA、rpoB、mdh、pgi、phoE、infB、tonB，由上海桑尼生物公司合成）設(shè)計PCR擴增引物，使用PCR梯度擴增儀進行擴增，擴增條件：94℃變性30 s，50℃退火1 min，72℃延伸30 s。擴增產(chǎn)物純化后測定各位點片段的DNA序列，將拼接后的測序結(jié)果提交至Genbank，將7個管家基因序列與肺炎克雷伯菌MLST數(shù)據(jù)庫（http://pubmlst.org/）相應(yīng)等位基因進行比較，獲得每個菌株的等位基因號，確定分子分型。

2 結(jié)果

2.1 CRKP菌株的患者性別、年齡、標(biāo)本及科室來源分布 332株CRKP菌株來自男性患者239株（72.0%），女性患者93株（28.0%）；來自＞60歲患者246株（74.1%），21～60歲患者 74株（22.3%），＜20歲12株（3.6%）；標(biāo)本來源主要為痰液233株（70.2%）、尿液63株（19.0%）、血液14株（4.2%）、排泄物9株（2.7%）；科室來源主要為 ICU 168株（50.6%）、呼吸內(nèi)科病房 31株（9.3%）、神經(jīng)外科病房27株（8.1%）。

2.2 CRKP菌株對抗菌藥物的敏感性試驗結(jié)果 CRKP菌株對復(fù)方新諾明、阿米卡星、慶大霉素、左氧氟沙星、四環(huán)素的敏感性較高，分別為71.9%、48.0%、38.6%、32.2%、31.7%；對亞胺培南、哌拉西林、美洛培南、氨芐西林/舒巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦的敏感性較低，分別為1.2%、4.5%、6.1%、7.9%、8.0%。

2.3 30株CRKP菌株耐藥表型及基因型檢測結(jié)果30株CRKP菌株的改良Hodge試驗陽性率為90.0%（27/30）；對頭孢他啶/阿維巴坦的體外敏感性為96.7%（29/30）；耐藥基因型為 blaNDM-1僅 1株（3.3%），blaKPC-229株（96.7%），見表 2。

表2 30株CRKP菌株耐藥表型及基因型檢測結(jié)果

2.4 30株CRKP菌株等位基因號及分子分型 30株CRKP菌株中，分子分型為ST11型28株，占93.3%，見表3。

表3 30株CRKP菌株等位基因號及分子分型

3 討論

近年來，全國CRKP檢出率逐年升高，提示CRKP醫(yī)院感染防控工作刻不容緩。因此，本研究對2017—2019年永康市第一人民醫(yī)院臨床分離的CRKP菌株進行分析，探討其臨床分布特征、耐藥表型、耐藥基因及同源性。本研究結(jié)果顯示，332株CRKP菌株主要來源于ICU（占50.6%），感染患者的年齡普遍＞60歲（占74.1%），這與ICU患者高齡者較多有關(guān)，因為高齡患者往往合并較多基礎(chǔ)疾病且免疫力低下[8]。此外，永康市第一人民醫(yī)院患者中分離獲得的CRKP菌株主要來源于痰液標(biāo)本（占70.2%），提示CRKP主要通過呼吸道傳播，與周開礦等[9]報道一致。本研究還發(fā)現(xiàn)永康市第一人民醫(yī)院分離獲得的CRKP主要來源于男性患者（占72.0%），與萬玉香等[10]報道一致。

研究表明，CRKP對抗菌藥物的耐藥機制主要是產(chǎn)生碳青霉烯酶[11]。本研究結(jié)果顯示，30株CRKP菌株的改良Hodge試驗陽性率為90.0%；對頭孢他啶/阿維巴坦的體外敏感性為96.7%，與耐藥基因型檢測結(jié)果（1株CRKP菌株攜帶blaNDM-1，29株CRKP菌株攜帶blaKPC-2）一致。這提示頭孢他啶/阿維巴坦對產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌具有較好的抗菌作用。INFORM全球抗生素監(jiān)測數(shù)據(jù)報告顯示，在2014—2016年我國住院患者中，肺炎克雷伯菌對頭孢他啶/阿維巴坦的體外敏感性達96.7%，與本研究結(jié)果基本一致。可見，頭孢他啶/阿維巴坦紙片擴散法用于篩查CRKP具有較高的靈敏度和特異度。但由于本研究僅對30株CRKP菌株進行試驗，具有一定的局限性，仍有待后續(xù)擴大檢測數(shù)來進一步證實。此外，本研究還對30株CRKP菌株進行同源性分析，以確定院內(nèi)感染可能的流行株。MLST是用于細(xì)菌同源性分析的常用方法[12-13]。本研究采用MLST技術(shù)檢測細(xì)菌同源性發(fā)現(xiàn)，28株CRKP菌株為 ST11 型，占 93.3%，與 Liu 等[14]、Qi等[15]報道一致。

綜上所述，CRKP是永康地區(qū)感染性疾病的重要病原菌，對多數(shù)抗菌藥物具有高度耐藥性，流行株為ST11型。建議本地區(qū)醫(yī)療機構(gòu)根據(jù)這一流行特點，進一步加強醫(yī)院感染預(yù)防與控制工作，比如嚴(yán)格加強感染患者隔離、醫(yī)護人員衛(wèi)生防護、醫(yī)療物品及環(huán)境空氣消毒等措施，以預(yù)防CRKP傳播。