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    脂肪干細(xì)胞抑制炎癥對緩解兔耳增生性瘢痕形成效果研究

    2022-06-06 10:02:14楊玲玲王洪一白澤明韓子陽劉芮嫡
    臨床軍醫(yī)雜志 2022年5期
    關(guān)鍵詞:瘢痕干細(xì)胞創(chuàng)面

    楊玲玲, 黃 悅, 王洪一, 白澤明, 韓子陽, 劉芮嫡, 陶 凱

    北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 燒傷整形科,遼寧 沈陽 110016

    創(chuàng)面愈合的過程需要多種細(xì)胞、因子和介質(zhì)的參與,愈合過程中任何一個階段發(fā)生異常都可能導(dǎo)致瘢痕的形成。愈合過程中的炎癥期會有大量炎癥因子的釋放,炎性細(xì)胞通過細(xì)胞介質(zhì)參與炎癥反應(yīng),誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞活化,成纖維細(xì)胞也會反過來調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá),進(jìn)一步參與炎癥反應(yīng)[1]。白細(xì)胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)在炎癥期均發(fā)揮重要的作用,因此,在增生性瘢痕有關(guān)的炎癥因子表達(dá)的相關(guān)研究中,這些因子是研究的重點(diǎn)[2-5]。適度的炎癥反應(yīng)對于創(chuàng)面修復(fù)是有利的,但是,炎癥反應(yīng)過度可能誘發(fā)增生性瘢痕的產(chǎn)生。目前,有學(xué)者提出,抑制炎癥反應(yīng)可能會對增生性瘢痕的治療發(fā)揮一定作用[4]。Xie等[6]研究表明,間充質(zhì)干細(xì)胞具有促進(jìn)傷口愈合并且減少瘢痕增生的作用,脂肪源性干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)也已經(jīng)被證明可以參與組織和器官的損傷和修復(fù),具有促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用。但是,ADSCs對于病理性瘢痕的作用機(jī)制目前仍在研究中。本研究通過建立兔耳增生性瘢痕模型,探討ADSCs是否可以通過抑制增生性瘢痕炎癥的發(fā)生,發(fā)揮抑制增生性瘢痕的作用?,F(xiàn)報道如下。

    1 材料與方法

    1.1 兔脂肪源性干細(xì)胞提取 選取20只清潔級新西蘭大白兔,體質(zhì)量為2.5~3.5 kg,購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司,飼養(yǎng)于北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院的實(shí)驗(yàn)動物中心。購入后調(diào)整性飼養(yǎng)1周,環(huán)境條件為(25℃±1℃)、濕度為55%~65%,飲食、進(jìn)水均自由。將購買的大白兔分開飼養(yǎng)1周,讓其適應(yīng)環(huán)境,然后開始實(shí)驗(yàn)。取2只清潔級新西蘭大白兔,麻醉后獲取兔左側(cè)腹股溝的皮下脂肪組織,用PBS反復(fù)沖洗脂肪組織,至無血色為止。將組織裝至50 ml離心管中,1 200 r/min離心5 min。棄去油脂層,將脂肪層重新收集至離心管中。使用0.125%濃度的Ⅰ型膠原酶按1∶1比例加入脂肪組織,放入5% CO2培養(yǎng)箱中消化2 h,期間每15 min取出搖勻1次。脂肪消化成黏糊狀,1 200 r/min離心15 min。離心后使用生理鹽水重懸脂肪細(xì)胞,將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿內(nèi)。置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育培養(yǎng),取3~7代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.2 流式細(xì)胞技術(shù)檢測 取第3代的ADSCs,用1% PBS沖洗2~3次,加入適量0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞3~5 min,然后加培養(yǎng)基終止消化。離心(100 g,1 500 r/min,10 min)。棄去上清,加入生理鹽水重懸細(xì)胞。將細(xì)胞(1.0×106個/ml)轉(zhuǎn)入EP管中,每管100 μl,然后加入異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,F(xiàn)ITC)標(biāo)記的CD45和CD73及PE標(biāo)記的抗體CD34和CD90,每管5 μl。對照組加入5 μl相對應(yīng)的同型對照IgG1-FITC、IgG1-PE,4℃避光孵育30 min。4℃離心(100 g,1 000 r/min,5 min)。棄去上清,生理鹽水重懸細(xì)胞。利用流式細(xì)胞儀檢測CD34、CD45、CD73、CD90表面標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果取均值。

    1.3 兔耳增生性瘢痕模型建立及治療 分別在18只大白兔雙耳腹側(cè)設(shè)計4個大小為1.5 cm×1.5 cm的方形切口線,切口間距1.0 cm。常規(guī)手術(shù)消毒兔耳腹側(cè),然后行腫脹麻醉液的配置,術(shù)區(qū)局部麻醉滿意后,使用尖刀片沿著已經(jīng)設(shè)計好的切口線將兔耳全層皮膚至軟骨膜切開,至軟骨表面后進(jìn)行剝離,然后將全部皮膚和軟骨膜逐一去除,切除過程中保持耳軟骨的完整。

    建模成功后,將大白兔分為對照組(n=9)和治療組(n=9)。對照組:用 2 ml 注射器,從瘢痕四周正常皮膚約0.4 cm處刺入至瘢痕中央,每點(diǎn)注射0.3 ml生理鹽水。治療組:用2 ml 注射器,從瘢痕四周正常皮膚約0.4 cm處刺入至瘢痕中央,每點(diǎn)注射0.3 ml(1×105個)ADSCs。分別在術(shù)后即刻,術(shù)后1、3、5周注射4次。分別于術(shù)后1、3、5周將每組3只動物處死取材,取材時將瘢痕組織、瘢痕周圍部分正常皮膚軟組織及其下方的軟骨一起切除。每個標(biāo)本由中軸縱切均分為兩等份,一份組織放入10%中性甲醛溶液中固定,一份組織保存于液氮中。

    1.4 HE染色 4%甲醇固定標(biāo)本24 h,沖洗干凈后分別用70%~100%濃度乙醇逐一脫去標(biāo)本中的水;浸蠟,包埋;標(biāo)本切片,切片厚度5 μm。切片在60℃條件下烘干,二甲苯脫蠟;70%~100%不同濃度乙醇干燥切片;蘇木精染色5 min;水清洗后使用伊紅進(jìn)行染色2 min;水漂洗后通過中性樹膠封片,顯微鏡下觀察,200倍下拍照。

    1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 將組織勻漿,使用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒按照說明書測定標(biāo)準(zhǔn)曲線后,在450 nm波長下用酶標(biāo)儀測定光密度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算IL-6和TNF-α的含量。

    1.6 實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗(yàn) 將組織裂解,氯仿抽提去除蛋白和DNA,異丙醇沉淀RNA,乙醇清洗沉淀,DEPC水溶解RNA。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒,將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,使用SYBR試劑盒,在95℃ 30 s、變性95℃ 30s、退火55℃ 30 s、延伸72℃ 30 s的條件下進(jìn)行實(shí)時熒光定量 PCR實(shí)驗(yàn)。所用引物包括Ⅰ型膠原(collagen Ⅰ,COLⅠ),正向引物:GAGGGCAACAGCAGGTTCACTTA,反向引物:TCAGCACCACCGATGTCCA;α-平滑肌肌動蛋白(alpha--smooth muscle actin,α-SMA),正向引物:GACAATGGCTCTGGGCTCTGTAA,反向引物:TGTGCTTCGTCACCCACGTA;GAPDH,正向引物:GCACCGTCAAGCTGAGAAC,反向引物:TGGTGAAGACGCCAGTGGA。

    2 結(jié)果

    2.1 脂肪源性干細(xì)胞鑒定 與相應(yīng)的同型對照比較,ADSCs表面抗原CD73(99.9%)和CD90(99.9%)呈陽性表達(dá),而CD34(2.09%)和CD45(1.36%)呈陰性表達(dá),證明脂肪源性干細(xì)胞提取成功。見圖1。

    圖1 ADSCs表面抗原標(biāo)志物的表達(dá)

    2.2 ELISA測定ADSCs對炎癥因子的影響 與對照組相應(yīng)時間點(diǎn)比較,ADSCs作用1、3、5周時,組織中IL-6的表達(dá)均顯著下調(diào),TNF-α的表達(dá)均被抑制,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、3。

    圖2 ADSCs對IL-6表達(dá)的影響(與對照組比較,①P<0.05) 圖3 ADSCs對TNF-α表達(dá)的影響(與對照組比較,①P<0.05)

    2.3 ADSCs對組織中COLⅠ及α-SMA表達(dá)的影響 與對照組相應(yīng)時間點(diǎn)比較,ADSCs作用1、3、5周時,組織中COLⅠ和α-SMA的表達(dá)均顯著下調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

    圖4 ADSCs對組織中COLⅠ和α-SMA表達(dá)的影響(與對照組比較,①P<0.05)

    2.4 HE染色觀察 ADSCs的添加可顯著降低組織中炎性細(xì)胞聚集的現(xiàn)象,對照組膠原錯亂排列的現(xiàn)象比較嚴(yán)重。見圖5。

    圖5 HE染色觀察瘢痕組織情況(200倍;a.對照組1周時;b.治療組1周時;c.對照組3周時;d.治療組3周時;e.對照組5周時;f.治療組5周時)

    3 討論

    目前,對于病理性瘢痕的形成機(jī)制有很多猜想,例如免疫炎癥性因素,細(xì)胞因子調(diào)節(jié)異常,細(xì)胞基質(zhì)異常等。有研究報道,抑制細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞外基質(zhì)的沉積、抑制炎癥的進(jìn)展,可能是預(yù)防和治療病理性瘢痕的方法[7]。本研究通過進(jìn)行兔耳瘢痕實(shí)驗(yàn),探討ADSCs對兔耳瘢痕中炎癥因子的影響,從而探討ADSCs對增生性瘢痕的可能防治機(jī)制。為了鑒定原代培養(yǎng)的ADSCs是否培養(yǎng)成功,本研究采用了流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),該細(xì)胞表面CD73和CD9陽性表達(dá),而CD34和CD45陰性表達(dá),提示ADSCs提取成功。

    有研究報道,適當(dāng)?shù)难装Y反應(yīng)可以促進(jìn)創(chuàng)面的愈合,但是,如果炎癥持續(xù)存在或者過度表達(dá),可能會導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積,進(jìn)而造成增生性瘢痕的形成[8-9]。Xie等[8]指出,IL-6可吸引中性粒細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì),TNF-α可促進(jìn)中性粒細(xì)胞黏附于內(nèi)皮細(xì)胞上,刺激局部炎癥反應(yīng)。因此,大量IL-6和TNF-α等炎癥因子的存在,使得炎癥反應(yīng)加重,最終誘導(dǎo)增生性瘢痕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),ADSCs可以顯著下調(diào)兔耳瘢痕組織中IL-6和TNF-α的表達(dá),由此可見,ADSCs可能通過下調(diào)炎癥因子的表達(dá)發(fā)揮抑制增生性瘢痕的作用。

    與正常組織相比,增生性瘢痕中COLⅠ表達(dá)增多[10-13]。本研究通過實(shí)時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn),ADSCs能夠顯著下調(diào)組織中COLⅠ的表達(dá),進(jìn)而發(fā)揮抑制增生性瘢痕形成的作用。α-SMA可以促進(jìn)細(xì)胞移動和收縮,在創(chuàng)面收縮、瘢痕攣縮等增生性瘢痕病理性形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。既往研究發(fā)現(xiàn),ADSCs可能通過增加肝細(xì)胞生長因子的分泌來介導(dǎo)下調(diào)成纖維細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)[11-12]。本研究結(jié)果也證明,ADSCs可有效抑制增生性瘢痕中α-SMA的積累。由此可見,ADSCs可以通過下調(diào)COLⅠ和α-SMA的表達(dá),改善創(chuàng)面收縮與瘢痕攣縮,從而進(jìn)一步緩解增生性瘢痕的發(fā)生與發(fā)展。

    綜上所述,ADSCs能夠通過下調(diào)增生性瘢痕中炎癥因子的表達(dá),抑制COLⅠ和α-SMA的含量,發(fā)揮抑制增生性瘢痕的作用。

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