香辛料中去甲烏藥堿含量分析

鄭小敏 尤曉惠 王瑋 王美鋒 向鵬宇

摘 要：為了解我國(guó)56種香辛料中去甲烏藥堿的含量范圍，通過(guò)對(duì)不同地區(qū)、不同產(chǎn)地、不同品種的香辛料的含量測(cè)定，掌握香辛料中去甲烏藥堿含量現(xiàn)狀。本文對(duì)重慶市各大香辛料批發(fā)市場(chǎng)及網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)進(jìn)行隨機(jī)采樣，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法經(jīng)Waters CSH C18柱（100 mm×2.0 mm，1.7 μm）分離，電噴霧正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)，同位素內(nèi)標(biāo)法對(duì)去甲烏藥堿進(jìn)行定性定量分析。結(jié)果表明，56個(gè)品種中有6種香辛料含有去甲烏藥堿，其中，木姜子、月桂葉中去甲烏藥堿含量較高;同一品種不同產(chǎn)地的花椒含量存在顯著差異;紅花椒中去甲烏藥堿含量普遍高于青花椒。

關(guān)鍵詞：去甲烏藥堿;香辛料;高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

Analysis of the Content of Higenamine in Spice

ZHENG Xiaomin， YOU Xiaohui， WANG Wei， WANG Meifeng， XIANG Pengyu

（Chongqing Fuling Institute for Food and Drug Control， Chongqing 408000， China）

Abstract： To understand the content range of higenamine in 56 kinds of spices in China， and to master the content status of higenamine in ?different spices from different regions and different producing areas. Random samples were collected from major spices wholesale markets and online platforms in Chongqing. The samples were separated by Waters CSH C18 column （100 mm×2.0 mm， 1.7 μm） by liquid chromatography-tandem mass spectrometry， electrospray ionization positive ion scanning， and multi-reaction monitoring mode detection. The qualitative and quantitative analysis of higenamine was carried out by isotope internal standard method. The results show that， 6 spices of 56 cultivars contained higenamine， among which， the content of higenamine was higher in the seeds of Zingiberaceae and the leaves of laurel; The content of zanthoxylum from the same variety and different producing areas was significantly different. The content of noraconite in red prickly ash is generally higher than that in green prickly ash.

Keywords： higenamine; spices; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

去甲烏藥堿（Higenamine，HG）屬于芐基異喹啉類生物堿，是一種β受體激動(dòng)劑類藥物，它能夠增加動(dòng)物心肌收縮力，改善收縮和舒張功能，并具有興奮心肌細(xì)胞、刺激β-腎上腺素受體、舒張血管的作用，因此在臨床上可被用作強(qiáng)心劑[1-4]。自2017年起，去甲烏藥堿就被國(guó)際反興奮劑組織（World Anti-Doping Agency，WADA）列為S3類（β-2激動(dòng)劑類）違禁物質(zhì)[5]。去甲烏藥堿主要存在于細(xì)辛、黃柏、地膚子[6]、花椒、胡椒、桂皮[7-8]等天然植物中，這些植物正是中藥材或日常食用香辛料中的組成部分。因此，運(yùn)動(dòng)員極有可能在日常飲食中攝入去甲烏藥堿而造成興奮劑檢測(cè)陽(yáng)性檢出。本文通過(guò)各大香辛料批發(fā)市場(chǎng)、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、中藥材市場(chǎng)、商超及網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)進(jìn)行采樣，采用液色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行不同品種的香辛料中去甲烏藥堿的含量分析[8]。

1 材料與方法

1.1 采樣

以《天然香辛料 分類》（GB/T 21725—2017）為依據(jù)制定采樣方案，對(duì)重慶市各大香辛料批發(fā)市場(chǎng)、中藥材批發(fā)市場(chǎng)及網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)進(jìn)行采樣，共采集花椒、辣椒、白胡椒、桂皮、八角、孜然、多香果、草果、高良姜、月桂葉、丁香、蓽撥、三奈、香茅草、茴香、芫荽、甘草、砂仁、姜黃、白豆蔻、肉豆蔻、香豆蔻、百里香、芝麻、大蒜、白歐芥、調(diào)料九里香、香椿、芒果、楊桃、細(xì)葉芹、葫蘆巴、留蘭香、迷迭香、香莢蘭、羅晃子、歐芹、菖蒲、甘牛至、石榴、薄荷、辣根、洋蔥、姜、木姜子、小蔥、大蔥、甜羅勒、蒔蘿籽、葛縷子、小豆蔻、芹菜籽、龍蒿、牛至、藏紅花及大清桂56種香辛料。進(jìn)行樣本分類，每個(gè)品種采樣量不少于200 g，每種樣品不少于3批次;并對(duì)含有去甲烏藥堿香辛料進(jìn)行大量采集，覆蓋主要產(chǎn)地。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1290-AB 4500 高效液相色譜聯(lián)用儀（美國(guó)AB 公司）;XPE204電子分析天平（梅特勒-托利多），VORTEX3渦旋儀（德國(guó)IKA公司），SR-2DS強(qiáng)力振蕩器（日本TAITEC公司），Multifuge XIR冷凍離心機(jī)（德國(guó)ThermoFisher公司），Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore 公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)液配制

準(zhǔn)確稱取去甲烏藥堿對(duì)照品10 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，配制成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液;用甲醇逐步稀釋成濃度為

1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液;于-18 ℃冷凍保存。

稱取去甲烏藥堿-D4對(duì)照品1 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，配制成濃度為

100 μg/mL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液;精密吸取甲烏藥堿-D4內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 mL于100 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，配制成1 μg/mL去甲烏藥堿-D4內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用液;于-18 ℃冷凍保存。

1.3.2 樣品前處理

本實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析。樣品粉碎均勻，過(guò)60目篩，稱取試樣1.0 g（精確到0.001 g）于50 mL離心管中，加入去甲烏藥堿-D4標(biāo)準(zhǔn)使用液100 μL（1 μg/mL），加入19 mL 0.5%甲酸乙醇/水（80+20）溶液，振蕩30 min，8 000 r/min離心5 min;提取液轉(zhuǎn)移至20 mL比色管中，用5%氨水調(diào)節(jié)pH值至8.5±0.5，加水定容至20 mL，混勻。

PBA固相萃取小柱依次用3 mL乙腈、3 mL0.5%甲酸水、3 mL 0.2 mol/L乙酸銨（pH為8.5）活化。取5 mL上述提取溶液，上柱，依次用3 mL 0.2mol/L乙酸銨（pH為8.5）淋洗、3 mL水淋洗;2 mL 0.5%甲酸甲醇洗脫，抽干小柱，收集洗脫液，40 ℃氮吹至近干，1 mL 0.5%甲酸水復(fù)溶，0.22 μm濾膜過(guò)濾，上機(jī)分析。采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法經(jīng)Waters CSH C18柱（100 mm×2.0 mm，1.7 μm）分離，電噴霧正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)，同位素內(nèi)標(biāo)法定量測(cè)定。

1.3.3 儀器條件

（1）液相條件。柱溫：40 ℃;進(jìn)樣量：2 μL;流動(dòng)相A：0.1%甲酸乙腈，流動(dòng)相B：0.1%甲酸水;

流速：0.3 mL/min。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

（2）質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧離子源;掃描方式：正離子掃描;檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式;電噴霧電壓（IS）：5 500 V;霧化氣壓力（GS1）：

55 psi;輔助氣壓力（GS2）：55 psi;氣簾氣壓力（CUR）：35 psi;碰撞氣體（CAD）：Medium;離子源溫度（TEM）：550 ℃。

去甲烏藥堿定量離子對(duì)：272.0/107.0，去簇電壓：40 V，碰撞能量：26 V;去甲烏藥堿定性離子對(duì)：272.0/255.0，去簇電壓：40 V，碰撞能量：20 V;去甲烏藥堿-D4離子對(duì)：276.0/259.0，去簇電壓：40 V，碰撞能量：21 V。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢出限和定量限的測(cè)定

將去甲烏藥堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇稀釋至一定濃度，再分別取適量于10 mL容量瓶中，分別加入適量去甲烏藥堿-D4內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用液，甲醇稀釋成一定梯度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液按照1.3.3儀器條件進(jìn)行測(cè)定，以去甲烏藥堿的濃度與去甲烏藥堿-D4濃度比值作為橫坐標(biāo)，以去甲烏藥堿定量離子峰面積與去甲烏藥堿-D4峰面積比值為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，去甲烏藥堿濃度在0.25～100.00 ng/mL關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r大于0.999。當(dāng)S/N≥3作為方法的檢出限;S/N≥10作為方法的定量限。各品種方法檢出限為

1 μg/kg，定量限為3 μg/kg。

2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

根據(jù)香辛料的使用部位不同，將香辛料分為葉類、果實(shí)類、根莖類及花類等，選取甘草、甘牛至、茴香、桂皮、芝麻、丁香及芹菜籽等7種有代表性的不同類型樣品進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，并分別添加3個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)加標(biāo)水平設(shè)置6個(gè)平行樣，以考察方法的精密度和回收率，以試劑溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，內(nèi)標(biāo)法定量。如表2所示，平均回收率范圍為92.8%～108.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為1.9%～5.6%。

2.3 檢測(cè)結(jié)果

由檢測(cè)結(jié)果可知，花椒、桂皮、蓽撥、月桂葉、白胡椒及木姜子等6種香辛料中檢出了去甲烏藥堿，其中，木姜子和月桂葉中去甲烏藥堿含量偏高，見(jiàn)表3。

2.4 花椒中去甲烏藥堿的含量分析

本研究中檢出去甲烏藥堿的其他5個(gè)品種產(chǎn)地比較集中，且產(chǎn)量少;而花椒是生活中最常見(jiàn)的食物，是我國(guó)主要香辛料之一，也是我國(guó)優(yōu)勢(shì)特色農(nóng)產(chǎn)品，產(chǎn)量大，使用范圍廣，在我國(guó)大部分地區(qū)都有種植，因此本研究對(duì)陜西、四川、重慶、云南和甘肅產(chǎn)地花椒進(jìn)行采樣，共采集樣品52批次，分析結(jié)果見(jiàn)表4。

各產(chǎn)區(qū)主產(chǎn)品種分別是四川（紅花椒）、陜西（紅花椒）、重慶（青花椒）、云南（青花椒）。通過(guò)Excel分別對(duì)去甲烏藥堿含量進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，結(jié)果表明，青花椒和紅花椒中去甲烏藥堿的含量具有顯著性差異，紅花椒中去甲烏藥堿的含量明顯高于青花椒。

3 討論

對(duì)56種香辛料中去甲烏藥堿進(jìn)行篩查，其花椒、桂皮、蓽撥、月桂葉、白胡椒及木姜子6種香辛料中檢出去甲烏藥堿，月桂葉和木姜子中含量較高。其中桂皮、蓽撥、月桂葉、白胡椒及木姜子在我國(guó)的產(chǎn)地相對(duì)比較集中。而花椒作為主要的香辛料之一，在我國(guó)被廣泛種植，各產(chǎn)區(qū)主產(chǎn)品種又各不相同，通過(guò)采樣分析，紅花椒的含量明顯高于青花椒。

香辛料中去甲烏藥堿的篩查和含量測(cè)定，對(duì)56種香辛料中去甲烏藥堿含量有了一個(gè)初步了解，本次分析主要針對(duì)重慶市各大香辛料批發(fā)市場(chǎng)、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、中藥材市場(chǎng)、商超及網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)進(jìn)行采樣，對(duì)香辛料進(jìn)行摸底，采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量分析測(cè)定。其中，6種常用香辛料中檢出去甲烏藥堿，其余均未檢出，提示運(yùn)動(dòng)員和心血管患者需特別慎用。

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