基于高通量測序技術(shù)分析菜心切口處微生物多樣性

家志文，陳學(xué)玲，范傳會(huì)，梅 新，施建斌，隋 勇，蔡 沙，熊 添，何建軍

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北 武漢 430064）

菜心，別名菜薹，因其味美清甜、營養(yǎng)豐富而廣受消費(fèi)者歡迎。在貯藏過程中，由于菜心切口處帶有明顯的機(jī)械損傷，因此水分揮發(fā)和呼吸作用的加快會(huì)導(dǎo)致其出現(xiàn)萎蔫、發(fā)黃等品質(zhì)變化。此外，切口處極易為微生物的滋長提供適宜條件，進(jìn)而產(chǎn)生腐敗變質(zhì)。

以往對微生物菌群組成的研究中，人們主要通過傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)分離、純化微生物，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且會(huì)因?yàn)槿斯げ僮鞯恼`差而產(chǎn)生帶有偏見性的結(jié)果。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，后續(xù)又產(chǎn)生了變性梯度凝膠電泳方法，這彌補(bǔ)了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的部分缺陷，但靈敏度有待提高。近些年，高通量測序技術(shù)得到快速發(fā)展，由于其對大批量的DNA測序具有顯著優(yōu)勢，且能夠提供高靈敏度和無偏性的測試結(jié)果，因此越來越受到研究者的青睞。目前，已有研究人員使用高通量測序技術(shù)對例如櫻桃、鯉魚、酸奶等食品中的微生物多樣性進(jìn)行了測試。現(xiàn)有菜心相關(guān)研究主要包括：品種選育、保鮮加工、品質(zhì)評(píng)價(jià)等，其中保鮮加工研究較為廣泛。已有研究使用低溫、氣調(diào)、輻射、薄膜包裝、臭氧、保鮮劑、褪黑素、殼聚糖和基因工程等手段來改善菜心貯藏品質(zhì)，但對于菜心中微生物多樣性的研究卻并不多。

本研究使用高通量測序技術(shù)對不同貯藏時(shí)期菜心切口處的微生物多樣性進(jìn)行比較分析，以期明確貯藏過程中菜心切口處的優(yōu)勢菌群。研究結(jié)果可為相關(guān)保鮮劑的后續(xù)功能測試，延長菜心的保鮮期和貨架期提供基礎(chǔ)條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菜心采收于湖北黃岡羅田縣恒然生態(tài)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司基地，挑選無病蟲害、無枯葉的菜心帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

磷酸鹽緩沖液 賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SQP稱量天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；DSX-24L手提式高壓蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；BCM-1000超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；SHA-B恒溫?fù)u床 國華（常州）儀器制造有限公司；3K15高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；YC-260L冷藏冰箱 中科美菱低溫科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菜心切口處微生物的取樣

稱取25 g菜心切口組織樣品，使用手術(shù)剪將其剪成3 mm×3 mm×3 mm的小塊。之后倒入裝有225 mL磷酸鹽緩沖液的錐形瓶中，放入25 ℃搖床中振蕩20 min，后續(xù)使用超聲波振蕩10 min。重復(fù)該過程一次。將混合緩沖液300 r/min離心5 min去除植物組織，取上清液8 000 r/min離心15 min，去掉上清液，所得沉淀即含有切口處的微生物樣本，將樣本置于－80 ℃冰箱凍存。每個(gè)貯藏時(shí)間點(diǎn)取3 組平行樣本。

1.3.2 微生物樣本高通量測序和數(shù)據(jù)分析

將所得微生物樣本送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，委托其基于Illumina MiSeq技術(shù)測序平臺(tái)進(jìn)行高通量測序，使用該公司的生信云平臺(tái)（https://cloud.majorbio.com/）及Excel軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜心貯藏期間切口處微生物群落的α多樣性分析

其中Chao指數(shù)、Sobs指數(shù)反映群落的豐度，覆蓋率反映群落的覆蓋度，Shannon指數(shù)則反映了群落的多樣性。本研究對不同貯藏時(shí)期的菜心共9 個(gè)樣品進(jìn)行了測序分析，按照最小樣本數(shù)進(jìn)行抽平，并以97%的相似度進(jìn)行分類，共得到1 016 個(gè)OTU（真菌：548 個(gè)；細(xì)菌：468 個(gè)）。如圖1、2所示，各樣本的稀釋度曲線隨著測序深度的增加逐漸趨于平緩，表明送測樣本量合理，可以較好反映樣品中的微生物多樣性情況。此外，如表1、2所示，不同貯藏時(shí)間的樣本中微生物的覆蓋率都大于99.9%，表明送測樣本的測序結(jié)果可以反映實(shí)際貯藏情況。

表1 不同樣本中真菌的α多樣性指數(shù)Table 1 Fungal diversity index in different samples

圖1 樣本中真菌稀釋性曲線Fig.1 Rarefaction curves of fungi in samples

圖2 樣本中細(xì)菌稀釋性曲線Fig.2 Rarefaction curves of bacteria in samples

表2 不同樣本中細(xì)菌的α多樣性指數(shù)Table 2 Bacterial diversity index in different samples

2.2 基于門水平的菜心切口處菌群組成分析

2.2.1 基于門水平的真菌組成分析

如圖3所示，在門分類水平上，真菌主要由擔(dān)子菌門（Basidiomycota）（早期43.46%、中期68.82%、后期55.27%）、子囊菌門（Ascomycota）（早期43.23%、中期26.59%、后期40.65%）和unclassified Fungi（早期13.29%、中期4.60%、后期4.07%）組成。擔(dān)子菌門和子囊菌門在貯藏早、后期相對豐度相似，在貯藏中期擔(dān)子菌門的相對豐度最高?；陂T水平的微生物多樣性并未因?yàn)橘A藏時(shí)間的延長而變化。

圖3 基于門水平的真菌組成Fig.3 Fungal community composition at the phylum level

2.2.2 基于門水平的細(xì)菌組成分析

如圖4所示，在門分類水平上，貯藏早期細(xì)菌主要由厚壁菌門（Firmicutes）（58.11%）和變形菌門（Proteobacteria）（29.52%）組成，貯藏中、后期，細(xì)菌主要由厚壁菌門（38.12%、19.73%）、變形菌門（8.25%、23.82%）、放線菌門（Actinobacteria）（14.95%、12.62%）和擬桿菌門（Bacteroidetes）（2.95%、7.27%）。藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）雖然在整個(gè)貯藏期間持續(xù)存在（早期10.89%、中期35.56%、后期36.48%），但其在本研究中的真實(shí)分類學(xué)地位需要謹(jǐn)慎確定。隨著貯藏時(shí)間的延長，細(xì)菌菌群多樣性稍有增加。

圖4 基于門水平的細(xì)菌組成Fig.4 Bacterial community composition at the phylum level

2.3 基于屬水平的菜心切口處菌群組成分析

2.3.1 基于屬水平的真菌組成分析

如圖5 所示，在整個(gè)貯藏期間，漢納酵母屬（）都占有主要優(yōu)勢（早期21.36%，中期22.81%，后期22.25%）。隨著貯藏時(shí)間的推移，孢子菌屬（）呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢（早期9.63%，中期9.14%，后期14.93%），unclassified Tremellales（早期4.22%，中期9.75%，后期8.01%）、unclassified Sordariomycetes（早期4.06%，中期1.21%，后期1.63%）和unclassified Nectriaceae（早期5.57%，中期0.32%，后期0.57%）同樣表現(xiàn)出類似的趨勢，相對豐度較低的傘形菌屬（）、青霉菌屬（）、頂頭孢霉屬（）、曲霉屬（）和鐮刀菌屬（）也是如此。維什尼亞科齊馬菌屬（）在貯藏期間表現(xiàn)出“過山車”式的急劇變化（早期0.39%，中期20.75%，后期3.47%），說明其在貯藏中后期可能受到其他菌群的競爭，相對豐度較低的囊擔(dān)菌屬（）表現(xiàn)出先升高后降低的平緩趨勢變化。枝孢菌屬（）隨著貯藏時(shí)間的延長一直升高（早期1.61%，中期10.65%，后期11.96%），相對豐度較低的大皰菌屬（）和鏈格孢菌屬（）同樣表現(xiàn)出逐漸升高的趨勢，表明這些菌群有著穩(wěn)健的生存方式。與枝孢菌屬相反的是，unclassified Fungi、絲狀桿菌（）和紅酵母菌屬（）呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢。中葉菌屬（）雖然在貯藏早、中期比例相對很低（0.01%、0.02%），但到貯藏后期占比（5.88%）突然升高，似乎表明貯藏后期的條件更有利于其生長。

圖5 基于屬水平的真菌組成Fig.5 Fungal community composition at the genus level

2.3.2 基于屬水平的細(xì)菌組成分析

如圖6 所示，在貯藏早期，微小桿菌屬（）為絕對的優(yōu)勢菌群（57.12%），隨著貯藏時(shí)間的延長，其菌群相對豐度逐漸下降（中期36.15%，后期15.46%）。豐度持續(xù)升高的是葉綠體，其從早期的10.89%一路升高至后期的36.48%，后續(xù)的討論中將會(huì)說明這種現(xiàn)象。假單胞菌屬（）在貯藏早期相對豐度為20.96%，但在中期急劇下降至0.55%，后期升高至3.66%，表示其生長環(huán)境曾發(fā)生了劇烈變化。節(jié)桿菌屬（）表現(xiàn)出先升后降的趨勢（早期0.13%，中期8.96%，后期4.30%），嗜單胞菌（）也是如此（早期0.54%，中期0.12%，后期3.81%）。不動(dòng)桿菌屬（）則表現(xiàn)出先降后升的趨勢（早期3.93%，中期1.73%，后期4.94%）。微桿菌屬（）、金黃桿菌屬（）、根瘤菌屬（）、鞘脂單胞菌屬（）、糖化桿菌屬（）、動(dòng)性桿菌屬（）和足桿菌屬（）均表現(xiàn)出逐漸升高的相對豐度，其中微桿菌屬和金黃桿菌屬在貯藏后期的相對豐度分別達(dá)到了5.14%和5.25%。鞘脂桿菌屬（）和芽孢桿菌屬（）的相對豐度僅在貯藏中期分別達(dá)到了1.27%和1.02%，其余時(shí)間均小于1%。

圖6 基于屬水平的細(xì)菌組成Fig.6 Bacterial community composition at the genus level

如圖7所示，細(xì)菌多樣性分布中，以微小桿菌屬、葉綠體和假單胞菌屬為A組，其他菌群為B組，相對豐度累加統(tǒng)計(jì)分析顯示，A組在3 個(gè)貯藏時(shí)間分別為88.97%、72.27%和55.59%，B組的值分別為11.03%、27.73%和44.41%。若排除葉綠體的干擾，將微小桿菌屬和假單胞菌屬歸為C組，則在3 個(gè)貯藏節(jié)點(diǎn)它們的值分別為78.08%、36.71%和19.11%。B、C兩組數(shù)據(jù)顯示出了明顯的此消彼長的趨勢。

圖7 不同菌群累加占比分析Fig.7 Changes in relative abundance of different bacterial groups

3 討論

菜心是我國特產(chǎn)蔬菜，在南方地區(qū)廣泛種植并常年出口國外。近年來，菜心消費(fèi)市場逐漸擴(kuò)大，延長其保鮮期也成為研究熱點(diǎn)。冷藏是人們經(jīng)常使用的保鮮手段，有研究發(fā)現(xiàn)冷藏條件能夠抑制菜心中微生物的活動(dòng)，延緩菜心腐爛過程，但隨著貯藏時(shí)間的延長，腐爛現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。不同抑菌劑對于微生物的抑制作用是特異且有限的，明確菜心貯藏期間優(yōu)勢菌或致腐菌的種類，有助于相關(guān)抑菌劑的開發(fā)。

真菌菌群多樣性研究中，漢納酵母屬多為酵母形態(tài)，有時(shí)會(huì)呈現(xiàn)出菌絲或假菌絲狀態(tài)，表示其可能存在侵入性生長。韓雨茜等發(fā)現(xiàn)漢納酵母與環(huán)境pH值變化呈正相關(guān)，較低的pH值可能會(huì)抑制其生長。菜心含有豐富的水分、維生素、可溶性糖等營養(yǎng)物質(zhì)，這為漢納酵母屬的生長提供了有利的生存條件。維什尼亞科齊馬酵母屬在貯藏中期相對豐度急劇增大，表明貯藏早、中期的營養(yǎng)物質(zhì)非常有利于其生長。而在貯藏后期，其相對豐度又急劇降低，一方面可能是由于貯藏后期菜心莖部切口處的營養(yǎng)物質(zhì)變得缺乏，另一方面可能是其他菌群的存在抑制了該菌群的生長。枝孢菌屬呈現(xiàn)出了一直升高的趨勢，表明其有持續(xù)擴(kuò)大生長的能力。在許多研究中，枝孢菌屬都是主要的致腐菌群，例如柚果面斑點(diǎn)病、水煮類罐頭變質(zhì)、卷煙霉變等均有枝孢菌屬的身影，推測該菌群可能也會(huì)導(dǎo)致菜心腐敗，不過這需要更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

細(xì)菌菌群多樣性研究中，微小桿菌屬曾多次被從不同的環(huán)境樣本中分離得到，它們的生存溫度可以覆蓋－12～55 ℃。本研究中，微小桿菌屬的相對豐度隨著貯藏時(shí)間的延長持續(xù)降低，表明其面臨著較為嚴(yán)峻的競爭壓力。將貯藏期間波動(dòng)較大的微小桿菌屬、葉綠體及假單胞菌屬排除后，貯藏早期其他菌群的相對豐度為11.03%，而到貯藏后期，這些菌群的相對豐度陡然升高到了44.41%，推測這可能是導(dǎo)致微小桿菌屬持續(xù)降低的原因。此外，大量真菌對營養(yǎng)物質(zhì)的消耗可能也導(dǎo)致了這種現(xiàn)象的產(chǎn)生，但考慮到多數(shù)細(xì)菌相對豐度在貯藏后期不降反升，前一種推測可能更能反映真實(shí)情況。假單胞菌屬具有較強(qiáng)的致腐能力，但在貯藏后期其相對豐度僅為3.66%。相反地，節(jié)桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、微桿菌屬和金黃桿菌屬在貯藏后期的相對豐度均高于假單胞菌屬的值，而且它們的擴(kuò)大趨勢還在升高。根瘤菌屬可能是采摘過程中從菜田攜帶而來，但其相對豐度一直保持在較低水平。

藍(lán)細(xì)菌門雖然在本研究的細(xì)菌菌群中一直存在，但通過數(shù)據(jù)庫比對，結(jié)果顯示它們在屬分類學(xué)水平上均為葉綠體。已有研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)細(xì)菌能夠進(jìn)入更高級(jí)的物種體內(nèi)共生，進(jìn)而產(chǎn)生基因轉(zhuǎn)移，此外還有研究者認(rèn)為葉綠體其實(shí)就是內(nèi)共生的藍(lán)細(xì)菌。因此筆者認(rèn)為此次測序結(jié)果中存在較高比例的葉綠體可能是植物組織中的葉綠體干擾，而非真正的藍(lán)細(xì)菌門。葉綠體的“污染”一直是研究者所要面臨的挑戰(zhàn)，很多通用的16S rDNA擴(kuò)增引物都與葉綠體的16S rDNA具有同源性，這往往導(dǎo)致了非特異結(jié)果的產(chǎn)生。隨著貯藏時(shí)間的延長，菜心切口處會(huì)有越來越多的腐爛植物組織，這些組織在取樣過程中無法被較好去除而最終被帶到高通量測序環(huán)節(jié)，可能是導(dǎo)致葉綠體相對豐度越來越高的原因。

4 結(jié)論

通過對不同貯藏時(shí)間的菜心進(jìn)行高通量測序分析，明確了其中的微生物菌群組成及相對豐度變化趨勢，共鑒定出真菌3 個(gè)門、22 個(gè)屬，細(xì)菌5 個(gè)門、16 個(gè)屬。在門水平上，真菌優(yōu)勢菌群均為擔(dān)子菌門、子囊菌門和unclassified Fungi。細(xì)菌優(yōu)勢菌群從早期的厚壁菌門和變形菌門轉(zhuǎn)變成了中、后期的厚壁菌門、變形菌門、放線菌門和擬桿菌門。在屬水平上，真菌的優(yōu)勢菌群為漢納酵母屬和孢子菌屬，細(xì)菌的優(yōu)勢菌群為微小桿菌屬。枝孢菌屬和假單胞菌屬是最可能導(dǎo)致菜心腐敗的菌群，且二者的相對豐度趨勢也在隨著貯藏期的延長而升高。有研究表明多種酵母菌具有抑制致腐病原菌生長的能力，因此漢納酵母屬和維什尼亞科齊馬菌屬的存在，可能抑制了枝孢菌屬和假單胞菌屬的生長，進(jìn)而有利于菜心貯藏期的延長，這需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持。回顧整個(gè)貯藏期，真菌的多樣性一直高于細(xì)菌，似乎說明菜心切口處的生長環(huán)境更有利于真菌生長，而真菌菌群的競爭優(yōu)勢大于細(xì)菌菌群也是另一種可能。但考慮到菜心生長過程中的地域環(huán)境區(qū)別及采后轉(zhuǎn)運(yùn)過程的物流環(huán)境差異，菜心采后貯藏期的微生物多樣性還需要更多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)佐證。而部分與土壤有密切聯(lián)系的微生物菌群的確定，還需要土壤微生物學(xué)的相關(guān)數(shù)據(jù)支持。因此后續(xù)對不同地域菜心生長及轉(zhuǎn)運(yùn)過程微生物多樣性的分析，將有助于人們更好理解菜心冷藏過程中的微生物多樣性的變化規(guī)律，促進(jìn)廣譜性更強(qiáng)的抑菌試劑的研發(fā)及應(yīng)用。