超高效液相色譜-高分辨質譜快速篩查和確證涼茶中56 種非法添加藥物

劉桂聯，陳 茹，羅小寶，陳均正，朱嘉儀

（1.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司，廣東 廣州 511442；2.廣東省食品工業(yè)公共實驗室，廣東 廣州 511442；3.廣東省質量監(jiān)督食品檢驗站，廣東 廣州 511442）

涼茶是嶺南人民根據本地的水土和氣象等特性，用獨特的研制方法將天然中草藥熬制成具有清熱解毒、生津祛火等功能的植物性飲料[1]，在嶺南人民日常生活中發(fā)揮重要作用。但在涼茶銷售過程中，有不法商家為增加功效，在涼茶中非法添加西藥，若大量或長期飲用，可能會出現重復用藥或過量用藥現象，甚至產生藥物相互作用，導致藥品不良反應發(fā)生。最近有不少媒體報道在涼茶中檢出西藥成分[2-3]，部分市區(qū)開展的食品安全專項行動中也有發(fā)現多家涼茶商鋪存在非法添加西藥的情況[4]，可見涼茶中含有非法添加藥物的現象時有發(fā)生。因此，有必要對涼茶市場進行有效監(jiān)管。近年來應用于涼茶等保健食品中非法添加藥物的檢測方法不斷提高，從常用的液相色譜[5-7]，到液相-質譜聯用技術[8-10]，再到超高效液相色譜-高分辨質譜聯用技術[11-15]等。四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜是高分辨質譜中的一種，具有可同時獲得高分辨率和高靈敏度的特點，單次采樣可獲得高通量的數據，并可提供精確一級母離子和精確二級碎片離子，在進行快速篩查、定性確證的同時，可完成定量分析，具有傳統(tǒng)三重四極桿質譜無法比擬的優(yōu)勢[16-18]。目前，超高效液相色譜-高分辨質譜聯用儀已經廣泛應用于食品[19-20]、藥品[21-23]、安全[24-25]、環(huán)境監(jiān)測[26]、司法毒物[27-29]等眾多領域當中。但由于超高效液相色譜-高分辨質譜聯用儀存在設備昂貴，需具備較高的專業(yè)技術水平等特點，在大部分領域的應用仍處于發(fā)展階段，其分析的對象由單一組分逐步向多物質多組分轉化，分析時長和效率也逐步提高[11,13,16]。目前，針對多種功能功效的涼茶同時進行多種非法添加藥物篩查的報道仍然少見。

本實驗采用超高效液相色譜-高分辨質譜聯用技術，利用抗炎、止咳、降脂、降壓類共56 種藥物，通過采集保留時間、精確一級母離子、精確二級碎片離子等質譜信息建立高分辨質譜快速篩查數據庫，針對宣稱具有下火、防感冒、止咳、減肥、降壓等功效的涼茶，進行非法添加藥物篩查。該方法具有快速、高通量、準確度高等特點，可同時進行篩查、確證和定量分析等優(yōu)點，可用于涼茶非法添加藥物的快速篩查和確證，是打擊涼茶中添加非法物質的有效手段，可為食品安全監(jiān)管相關部門提供方法依據和技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

涼茶購于廣東省各市、各地區(qū)涼茶店。

56 種標準物質對照品（純度均大于95%） 中國食品藥品檢定研究院；甲醇（LC/MS級） 德國默克公司；甲酸（LC/MS級） 賽默飛世爾科技有限公司；甲酸胺（色譜級，純度≥99.0%） 阿拉丁試劑有限公司；超純水制備裝置（電阻率18.2 MΩ·cm，25 ℃）美國Millipore公司。

1.2 儀器與設備

Q-Exactive四極桿-靜電場軌道肼高分辨質譜儀（配有加熱電噴霧電離源）、Vanquish超高效液相色譜儀賽默飛世爾科技有限公司；KQ-500E超聲波清洗儀昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

取涼茶樣品適量，搖勻，準確吸取1 mL置于50 mL容量瓶中，加甲醇35 mL，超聲提取15 min，放冷至室溫后，用甲醇定容，搖勻，經0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液。或根據實際濃度用甲醇適當稀釋至線性范圍內，作為供試品溶液。

1.3.2 色譜條件

Accucore RP-MS色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）；流動相：A為0.2%甲酸（含2 mmol/L乙酸銨）溶液；B為0.2%甲酸（含2 mmol/L乙酸銨）甲醇溶液；流速0.4 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量：1.0 μL；梯度洗脫程序：0～0.5 min，95% A、5% B；0.5～6.0 min，95%～2% A、5%～98% B；6.0～7.0 min，2% A、98% B；7.0～8.0 min，2%～95% A、98%～5% B；8.0～10.0 min，95% A、5% B。

1.3.3 質譜條件

電噴霧離子源（正離子模式）；掃描模式為全掃描-數據依賴二級掃描模式（Full MS/dd MS2）；鞘氣流量40 arb，輔助氣流量10 arb；噴霧電壓5 kV；離子傳輸管溫度325 ℃，輔助氣加熱器溫度375 ℃；一級掃描范圍m/z100～1 500；一級掃描分辨率70 000；一級自動增益控制值為2×105；二級掃描分辨率17 500；二級自動增益控制值為1×105；歸一化碰撞能為40、50、60。

1.4 數據統(tǒng)計及圖表繪制

數據統(tǒng)計和處理采用超高效液相色譜-高分辨質譜聯用儀配備的TraceFinder 4.0數據處理系統(tǒng)，圖表繪制采用SciDAVis軟件。

2 結果與分析

2.1 提取溶劑的選擇與色譜條件優(yōu)化

選取常用提取溶劑水、50%甲醇、甲醇、乙腈，以各個化合物的色譜峰分離情況、峰響應強度、基線等考察不同溶劑的提取效果。經過對比發(fā)現，使用甲醇作為提取溶劑時，56 種化合物都能夠獲得良好峰形，并且色譜峰響應值較高，基線相對平穩(wěn)，最終選擇使用甲醇作為提取溶劑。在流動相種類方面對比使用水-甲醇、水-乙腈、0.1%甲酸-甲醇、0.2%甲酸（含2 mmol/L乙酸銨）-含0.2%甲酸（含2 mmol/L乙酸銨）甲醇作為梯度洗脫溶劑，考察不同流動相組成對56 種化合物的洗脫能力。甲酸和乙酸銨的加入有利于目標物的離子化，當采用0.2%甲酸（含2 mmol/L乙酸銨）-含0.2%甲酸（含2 mmol/L乙酸銨）甲醇作為洗脫溶劑時，離子化效果更佳，各組分能夠獲得較好的分離效果，出峰時間分布合理，且色譜峰峰形良好。在色譜柱選擇方面分別采用Hypersil GOLD C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，3.0 μm）、Cortecs C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）、Accucore RP-MS色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）進行考察，結果發(fā)現使用Accucore RP-MS色譜柱時，各目標組分具有較好分離效果，特別是對3 組同分異構體（麻黃堿和偽麻黃堿、那莫西地那非和偽伐地那非、豪莫西地那非和伐地那非）具有較好分離效果、且能獲得較好的峰形和較低的柱壓，結果見圖1，最終選擇采用Accucore RP-MS色譜柱作為分析柱。

圖1 不同色譜柱分離效果Fig.1 Separation efficiencies of different chromatographic columns

2.2 快速篩查數據庫的建立

將質量濃度為100 μg/L的56 種化合物標準溶液注入高分辨質譜儀，利用全掃描-數據依賴二級掃描模式采集數據，收集56 種化合物的保留時間、一級精確分子質量、二級碎片精確分子質量等信息，結合化學式、二級離子強度，利用TraceFinder軟件構建高分辨快速篩查數據庫。56 種化合物的質譜信息見表1，56 種化合物的提取離子圖見圖2。

圖2 56 種化合物的提取離子圖Fig.2 Exacted ion chromatograms of 56 analytes

表1 56 種化合物的質譜信息Table 1 Mass spectral information of 56 analytes

續(xù)表1

2.3 方法的線性范圍、檢出限（limits of detection，LOD）和定量限（limits of quantification，LOQ）結果

采用空白樣品溶液配制系列標曲，利用待測組分峰面積和質量濃度繪制標準曲線，在2～100 μg/L范圍內線性關系良好，線性相關系數（R2）均大于0.99。以3 倍信噪比確定方法的LOD，56 種化合物LOD范圍為0.5～2.5 μg/L；以10 倍信噪比確定方法的LOQ，56 種化合物LOQ范圍為1.5～8.0 μg/L，結果見表2。

表2 方法的線性回歸方程、LOD和LOQTable 2 Regression equations with correlation coefficients,LODs and LOQs of the developed method

續(xù)表2

2.4 方法的準確度和精密度結果

在空白涼茶樣品中分別添加0.5、1.0、2.5 mg/L，采用3 個水平，每個水平進行3 次重復加標回收實驗，考察該方法的準確性和精密度，結果如表3所示，平均回收率在90.4%～105.0%之間，相對標準偏差（relative standard deviations，RSD）不大于6.0%，說明該方法具有較好的準確度和精密度。

表3 方法的準確度和精密度（n=3）Table 3 Recoveries and RSDs of 56 analytes spiked into blank matrix sample (n =3)

2.5 實際樣品的測定結果

應用建立的檢測方法和數據庫，對購買于廣東省各市、各地區(qū)共195 個批次涼茶樣品進行非法添加藥物篩查，其中篩查結果陽性樣品共6 個批次，均篩查出麻黃堿和偽麻黃堿，其非法添加量在2 127～103 68 μg/L之間，非法添加篩查陽性率為3.1%，其余非法添加組分暫未檢出。麻黃堿和偽麻黃堿均具有解熱發(fā)汗、止咳平喘等藥理功效，能夠有效緩解感冒、咳嗽的癥狀[30]，本次篩查陽性涼茶樣品均為感冒茶、化痰止咳茶，非法添加藥物的藥理功效與本次篩查陽性的涼茶樣品所宣稱的功效具有一致性。陽性樣品中麻黃堿和偽麻黃堿的提取離子色譜及質譜圖見圖3。

圖3 陽性樣品中麻黃堿和偽麻黃堿的提取離子色譜圖（A）及麻黃堿（B）、偽麻黃堿（C）二級質譜圖Fig.3 Exacted ion chromatograms (A) and MS2 spectrum of ephedrine (B) and pseudoephedrine (C) in positive samp

3 結論

應用超高效液相色譜-高分辨質譜聯用技術，通過建立抗炎、止咳、降脂、降壓類共56 種藥物的高分辨快速篩查數據庫，在10 min內可同時進行56 種物質的快速篩查分析和定量分析，可有效縮短分析時間，提高工作效率。以涼茶為研究對象，優(yōu)化了樣品前處理方法和色譜條件，對該方法的LOD、LOQ、回收率等進行方法學考察。對多批次涼茶樣品中56 種非法添加藥物進行定性篩查分析和含量測定，發(fā)現部分樣品篩查出麻黃堿和偽麻黃堿，結果提示，市場中涼茶類商品含有非法添加物質的現象仍然存在，以常見的感冒茶、止咳茶為主。為了給消費者提供健康有利的消費環(huán)境，打擊非法添加的市場亂象，有必要利用先進的分析檢測手段，對涼茶市場進行長期有效的監(jiān)管。