基于乳清蛋白的駱駝乳中摻假牛乳的檢測及熱處理對(duì)方法的影響

李玲玉，王 俊，李敏婧，楊迎春，苗 靜，趙仲凱，楊 潔

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046）

新疆作為我國畜牧大?。▍^(qū)），在雙峰駝數(shù)量以及駝乳產(chǎn)量上占據(jù)優(yōu)勢地位[1]。近年來，隨著乳制品工業(yè)的快速發(fā)展、乳品科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)駝乳營養(yǎng)價(jià)值、生理功能等的研究日益深入，使得駝乳在疾病輔助治療、營養(yǎng)保健、食品加工應(yīng)用中擁有巨大的潛力[2-5]，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值遠(yuǎn)高于牛乳（牛乳：7 元/kg；雙峰駝乳：50～80 元/kg）。但由于雙峰駝乳產(chǎn)量遠(yuǎn)低于牛乳，乳供應(yīng)量明顯受季節(jié)性波動(dòng)的影響[6]，且奶源質(zhì)量難以控制[7]，這使得駝乳及其制品成為蓄意摻假的目標(biāo)，受經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動(dòng)的摻假現(xiàn)象時(shí)常發(fā)生[8]；向高價(jià)值的駝乳中摻入低值的牛乳是最常見且最容易實(shí)現(xiàn)的摻假行為，這種摻假行為除了造成消費(fèi)者的經(jīng)濟(jì)損失外，還可能對(duì)個(gè)人健康造成不良后果，特別是對(duì)牛乳過敏的人群[9]。

而目前國內(nèi)對(duì)于雙峰駝乳及乳制品的摻假檢測并沒有明確標(biāo)準(zhǔn)[7]，市場監(jiān)管缺乏可依靠的標(biāo)準(zhǔn)及檢測方法。此外，國內(nèi)外關(guān)于雙峰駝乳的摻假檢測相關(guān)報(bào)道較少，而對(duì)水牛乳、羊乳及乳制品摻假辨別技術(shù)的研究比較深入[10-11]。因此，迫切需要針對(duì)新疆雙峰駝乳及乳制品摻假問題，建立篩查、分析檢測方法以及相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)，維護(hù)廣大消費(fèi)者的利益。

常用的乳源畜種的辨別技術(shù)可以根據(jù)DNA序列和乳蛋白分為兩類。物種特異性DNA序列已廣泛應(yīng)用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測，它可以識(shí)別不同畜種的動(dòng)物乳來源，從而辨別乳的摻假[12-14]，但PCR方法的DNA分離程序較為繁瑣，且通常不產(chǎn)生定量信息。與基于DNA序列分析的方法相比，基于蛋白質(zhì)的方法主要關(guān)注乳的蛋白質(zhì)差異，相比之下更為實(shí)用，常見的技術(shù)方法有毛細(xì)管電泳法[15]、雙向電泳法[10,16]、酶聯(lián)免疫吸附法[17-18]和液相色譜法[19]。

基于蛋白質(zhì)的檢測方法中，液相色譜法因具有簡單的樣本制備、有效的分離和定量以及高的靈敏度和選擇性的特點(diǎn)，被廣泛地應(yīng)用于乳及乳制品的摻假檢測當(dāng)中。近年來，高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法和超高液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）法已經(jīng)成功應(yīng)用到摻假的水牛乳、山羊乳或綿羊乳及其制品的檢測，蛋白標(biāo)識(shí)物主要分為乳清蛋白和酪蛋白[19-20]。乳清蛋白標(biāo)識(shí)物以β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg）和α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-La）為主，酪蛋白標(biāo)識(shí)物主要有κ-酪蛋白和αs1-酪蛋白。如Ke Xing等[21]建立了一種UPLC-串聯(lián)質(zhì)譜方法，通過檢測特征蛋白肽同時(shí)定量4 種酪蛋白和兩種主要的乳清蛋白，這些肽能夠作為標(biāo)識(shí)物用于定量分析山羊乳或綿羊乳制品中摻假的牛乳。然而目前報(bào)道中鮮見使用UPLC法，以牛乳清蛋白為摻假標(biāo)識(shí)物，檢測新疆雙峰駝乳及其制品中摻假的牛乳。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究工作中發(fā)現(xiàn)，駝乳乳清蛋白的組成與牛乳相比有較明顯的差異[22]；此外，有大量研究表明：駝乳乳清蛋白中含有極少量或不含有β-Lg[16,23-24]，因此牛β-Lg可作為一種潛在的標(biāo)識(shí)物用于駝乳中牛乳摻假的檢測。

本研究基于UPLC技術(shù)手段，以牛β-Lg為摻假標(biāo)識(shí)物，通過評(píng)估牛β-Lg的水平定性、定量檢測駝乳中摻假的牛乳。此外，通過已建立的UPLC方法對(duì)10種隨機(jī)購買的市售純駝乳粉進(jìn)行檢測，以評(píng)估目前國內(nèi)市場上純駝乳粉的摻假情況。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮駝乳采集自烏魯木齊市紅雁池，鮮牛乳采集自昌吉吉木薩爾，10 種市售全脂純駝乳粉購買自當(dāng)?shù)厥袌黾半娚唐脚_(tái)，純牛乳粉和純駝乳粉樣品由廠家提供。

牛β-Lg標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥90%）、牛α-La標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥85%）、牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）、牛乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥85%）和乙腈（HPLC級(jí)） Sigma上海儀器公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA，分析純） 成都市科隆化學(xué)品有限公司；冰乙酸（分析純） 天津市鑫鉑特化工有限公司；實(shí)驗(yàn)過程中均使用超純水。由于缺乏駱駝乳蛋白的商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品，本研究所用駝α-La是由本實(shí)驗(yàn)室制備，通過質(zhì)譜鑒定為alpha-lactalbumin（Camelus bactrianus），登錄號(hào)為XP_010962515.1。

1.2 儀器與設(shè)備

AcquityTMUPLC儀（配有光電二極管陣列檢測器和Waters Empower 3色譜工作站） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：BEH300 C4柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：A為0.1% TFA溶液，B為0.1% TFA的乙腈溶液；洗脫梯度：0～2.08 min，75%～68% A、25%～32% B；2.08～8.34 min，68%～48% A、32%～52% B；8.34～10.42 min，42%～75% A、52%～25% B；10.42～11 min，75% A、25% B。流速0.2 mL/min，檢測波長214 nm，進(jìn)樣體積5 μL，柱溫30 ℃，樣品溫度25 ℃。

1.3.2 樣本制備及處理

取鮮牛乳按體積分?jǐn)?shù)100%、80%、60%、50%、35%、25%、20%、10%、5%、3%、2%、1%、0.5%、0.2%、0.1%比例摻入到鮮駝乳中制備摻假樣本（3 個(gè)重復(fù)）；取牛乳粉按質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%、80%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%、2%、1%、0.5%、0.2%比例摻入到純駝乳粉中，制備摻假樣本（3 個(gè)重復(fù)），然后按1∶10的比例，將10 g粉樣溶于100 mL超純水中；熱加工處理鮮乳樣條件如表1所示。

表1 乳樣本的熱處理?xiàng)l件Table 1 Heat treatment conditions for milk samples

參考Manzo等[19]的乳樣前處理方法并稍作改動(dòng)，去除乳樣中的乳脂和酪蛋白。取25 mL乳樣經(jīng)4 ℃、8 000 r/min離心15 min去除乳脂；將清液收集到燒杯中，向脂肪層和沉淀酪蛋白層加入5 mL水，渦旋3 次，使殘留在脂肪層和酪蛋白層的乳清蛋白洗出，將洗液一并倒入燒杯；用冰乙酸調(diào)pH 4.6，40 ℃水浴20 min，經(jīng)4 ℃、8 000 r/min離心15 min，除去酪蛋白；將清液收集到燒杯中，向沉淀酪蛋白層加入10 mL水，渦旋3 次，使殘留在酪蛋白層的乳清蛋白洗出，將洗液一并倒入燒杯中；最后將乳清蛋白清液用水洗入50 mL容量瓶并定容，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，用于液相色譜分析。

1.3.3 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取牛β-Lg標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水將標(biāo)準(zhǔn)品配成1 000 mg/L的母液，后依次稀釋成質(zhì)量濃度為500、200、100、50、25 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，進(jìn)行液相色譜分析。以牛β-Lg標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制牛β-Lg的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 摻假乳樣本摻假標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

通過測量一系列摻假樣本中牛β-Lg的峰面積，與添加的牛乳或牛乳粉的比例構(gòu)建摻假標(biāo)準(zhǔn)曲線，摻假樣本的標(biāo)準(zhǔn)曲線以摻入牛乳或牛乳粉的百分比為橫坐標(biāo)，以摻假標(biāo)識(shí)物牛β-Lg的峰面積（3 個(gè)平行測量的平均值）為縱坐標(biāo)繪制。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖表繪制

使用Microsoft Excel 2013（Microsoft Corporation，Redmond，WA，USA）進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和表格繪制，使用Origin 8.5軟件（OriginLab，Northampton，MA，USA）進(jìn)行數(shù)據(jù)回歸分析和繪制蛋白色譜瀑布圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳清蛋白的分離鑒定

采用外標(biāo)法，所建立的摻假檢測分析方法可以有效的分離和鑒定駝乳和牛乳中的乳清蛋白。含有駝α-La、牛α-La和牛β-Lg的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液在色譜柱梯度洗脫程序中運(yùn)行11 min，3 種乳清蛋白組分在9 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了有效分離（圖1A）；由圖1A可知，駝α-La的保留時(shí)間為6.6 min，牛α-La的保留時(shí)間為7.2 min，牛β-Lg的保留時(shí)間為8.4 min；圖1B為3 種蛋白混合標(biāo)準(zhǔn)品的三維色譜圖。

駝α-La由123 個(gè)氨基酸組成，其中第39個(gè)氨基酸與牛α-La的對(duì)應(yīng)氨基酸不同[25]，根據(jù)氨基酸序列比對(duì)，這兩個(gè)蛋白之間的相似性和同一性分別為82.9%和69.1%[26]；此外，駝α-La的分子質(zhì)量為14.43 kDa，而牛α-La的分子質(zhì)量為14.18 kDa[27]，因此，這兩種蛋白質(zhì)具有不同的保留時(shí)間。

由鮮駝乳乳清蛋白的色譜圖（圖1C藍(lán)色線）可以看出，在該摻假檢測分析方法下，鮮駝乳乳清蛋白譜圖只有一個(gè)主峰（b1），該峰保留時(shí)間在6.649 min，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖比對(duì)，可以確定該蛋白為駝α-La。與鮮駝乳乳清蛋白不同，鮮牛乳乳清蛋白（圖1C紅色線）在保留時(shí)間7.280 min和8.417 min（a1）處出現(xiàn)了兩個(gè)主峰，根據(jù)峰保留時(shí)間和牛β-Lg標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰鋒形，可以確定蛋白a1為牛β-Lg。鮮牛乳和鮮駝乳乳清蛋白譜圖重疊時(shí)，可以清晰地識(shí)別出牛β-Lg（圖1C），駝乳中不含有β-Lg；同時(shí)，在分析鮮駝乳和鮮牛乳各占50%（體積分?jǐn)?shù)）的摻假乳樣本時(shí)，可以確定牛β-Lg很容易被識(shí)別出（圖1D）。因此，所建立的以牛β-Lg為摻假標(biāo)識(shí)物的UPLC方法，可用于駝乳中摻假牛乳的檢測。顯示峰純度的三維色譜圖：鮮駝乳和鮮牛乳各50%摻假乳樣本的三維色譜圖如圖2所示。

圖1 單獨(dú)標(biāo)準(zhǔn)品、混合標(biāo)準(zhǔn)品及摻假樣品色譜圖Fig.1 Chromatograms of individual and mixed standards of camel α-La,bovine α-La and bovine β-La and adulterated samples

圖2 鮮駝乳和鮮牛乳各50%摻假乳樣本的三維色譜圖Fig.2 3D chromatograms of raw camel milk and milk powder adulterated with 50% cow milk

2.2 摻假標(biāo)識(shí)物牛β-Lg受熱處理的影響

根據(jù)表1，將同一批采集的新鮮牛乳分成5 組，其中3 組按不同熱處理?xiàng)l件處理：巴氏殺菌乳、高溫滅菌乳和超高溫滅菌乳，1 組新鮮乳樣不經(jīng)任何熱處理作為對(duì)照，另外1 組新鮮乳樣不經(jīng)任何處理直接凍干作為奶粉的對(duì)照（涉及復(fù)溶使蛋白溶度不一致的問題）。

由圖3可知，巴氏殺菌條件下，摻假標(biāo)識(shí)物牛β-Lg受熱處理的影響較小，而高溫滅菌條件以及超高溫滅菌條件影響均較大。與鮮乳相比，不經(jīng)任何處理直接凍干的乳粉按1∶10比例復(fù)溶后，乳液中的β-Lg含量有所下降；而噴霧干燥乳粉與凍干乳粉相比，β-Lg的損失較大，這可能是乳粉制作過程中蛋白質(zhì)的降解所致[28]。結(jié)果表明：巴氏殺菌乳受熱處理影響較小，不影響β-Lg作為摻假標(biāo)識(shí)物進(jìn)行檢測；乳粉樣本雖受熱處理的影響較大，但不影響β-Lg作為摻假標(biāo)識(shí)物進(jìn)行檢測；因此，該摻假檢測方法，以牛β-Lg為摻假標(biāo)識(shí)物，可以應(yīng)用于鮮駝乳、巴氏殺菌駝乳以及駝乳粉的摻假定性檢測。

圖3 不同熱處理方式下牛乳乳清蛋白譜圖Fig.3 Chromatograms of cow milk whey protein under different heat treatments

2.3 摻假標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將同一批采集的新鮮乳樣，按照1.3.2節(jié)樣本的制備配成一系列駝乳摻假樣本后，分為2 組：鮮乳組和巴氏殺菌乳組3 個(gè)重復(fù)；純駝乳粉和純牛乳粉樣本同樣按照1.3.2節(jié)樣本的制備配成一系列駝乳粉摻假樣本3 個(gè)重復(fù)；按照1.3.1節(jié)的色譜條件進(jìn)行3 種類型摻假乳樣標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

3 種類型一系列摻假乳樣本的色譜圖如圖4所示，牛β-Lg的峰強(qiáng)度均隨著牛乳或牛乳粉添加比例的增加而增加，同時(shí)牛β-Lg峰面積的增加與牛乳或牛乳粉添加比例的增加呈正相關(guān)，說明該方法能較好地檢測駝乳中摻假牛乳的百分比。駝鮮乳摻入牛乳的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為y=277 219.32x－128 496.92，R2=0.997 9；巴氏殺菌駝乳摻入牛乳的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為y=267 597.11x－647 839.84，R2=0.996 9；駝乳粉摻入牛乳粉的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為y=101 795.61x－363 117.54，R2=0.997 8；結(jié)果表明：3 種類型摻假乳樣本標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性良好，線性相關(guān)系數(shù)（R2）分別為0.997 9、0.996 9和0.997 8，均在0.99左右，可用于駝乳中摻假牛乳的定量檢測。

圖4 鮮駝乳摻牛乳（A）、巴氏殺菌駝乳摻牛乳（B）、駝乳粉摻牛乳粉（C）的蛋白色譜瀑布圖Fig.4 Waterfall chromatograms of proteins in raw camel milk adulterated with cow milk (A),pasteurized camel milk adulterated with cow milk (B) and camel milk powder adulterated with cow milk powder (C)

通過檢測牛β-Lg的峰面積，定量評(píng)價(jià)駝乳中摻假牛乳的百分比，該分析方法最低可檢測至鮮駝乳摻假牛乳2%（V牛乳/V駝乳）、巴氏殺菌駝乳摻假牛乳3%（V牛乳/V駝乳）、駝乳粉摻假牛乳粉5%（m牛乳粉/m駝乳粉），檢出限依據(jù)信噪比RSN=3確定，從成本和風(fēng)險(xiǎn)的角度來看，摻假比例低于5%屬于無意污染[29]，因此該方法可滿足實(shí)際應(yīng)用的要求。以β-Lg標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得，鮮駝乳摻假檢出限為β-Lg 107.448 mg/L、巴氏殺菌駝乳摻假檢出限為β-Lg 103.648 mg/L、駝乳粉摻假檢出限為β-Lg 77.947 mg/100 g。摻假檢測定量限為鮮駝乳摻假牛乳5%（V牛乳/V駝乳）β-Lg 181.324 mg/L、巴氏殺菌駝乳摻假牛乳5%（V牛乳/V駝乳）β-Lg 149.628 mg/L、駝乳粉 摻假牛乳粉1 0 %（m牛乳粉/m駝乳粉），β-Lg 105.246 mg/100 g，定量限依據(jù)信噪比RSN=10確定。

此外，建立良好的摻假定量方程時(shí)，存在乳中蛋白質(zhì)濃度的不確定性問題[11]，如摻假標(biāo)識(shí)物牛β-Lg在牛乳中的濃度受多種因素（品種、季節(jié)、地區(qū)、泌乳期等）的影響[24]，具有不可控和不確定性；此外，乳粉的加工工藝條件不盡相同，會(huì)導(dǎo)致不同程度的蛋白質(zhì)損失，也使得乳中蛋白質(zhì)濃度存在不確定性[28,30]。但是，蛋白質(zhì)濃度的不確定性現(xiàn)實(shí)存在并且不可避免，對(duì)于任何摻假標(biāo)識(shí)物和任何摻假定量檢測方法均是如此，因此，定量方程必須假設(shè)相同的牛β-Lg濃度，計(jì)算出的摻假水平只能視為近似估計(jì)。

2.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果

2.4.1 分離選擇性

由于樣本前處理準(zhǔn)備過程中沒有選擇性的只提純牛β-Lg（除脂后僅酸沉淀去除酪蛋白），所以獲得的乳清清液里包含其他乳清蛋白，并且可能在214 nm處對(duì)目標(biāo)蛋白（β-Lg）檢測的存在干擾。因此，根據(jù)Boitz等[31]的方法，為驗(yàn)證該方法的分離選擇性，使用所建立的UPLC方法對(duì)另外的主要牛乳清蛋白（牛血清白蛋白、乳鐵蛋白和乳白蛋白）進(jìn)行分析。混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的色譜圖見圖5，4 種牛乳請(qǐng)蛋白在9 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)有效分離，且駝α-La與牛α-La和牛β-Lg也實(shí)現(xiàn)了很好地分離（圖1a），結(jié)果表明牛乳和駝乳乳清中主要其他乳清蛋白對(duì)牛β-Lg標(biāo)識(shí)物的檢測不會(huì)造成干擾。

圖5 牛乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖Fig.5 Liquid chromatograms of bovine whey protein standards

2.4.2 線性范圍

通過制備一系列質(zhì)量濃度的牛β-Lg標(biāo)準(zhǔn)溶液，評(píng)估該方法下牛β-Lg線性質(zhì)量濃度范圍。以6 個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)（3 次進(jìn)樣的平均值）建立牛β-Lg標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明β-Lg在25～1 000 mg/L范圍內(nèi)線性良好，線性回歸方程為y=18 996.40x－386 292.29，R2=0.999 9。

2.4.3 精密度

以低、中、高3 個(gè)水平摻假駝奶粉（30%、50%、80%）為樣本，通過比較牛β-Lg峰面積的值，評(píng)價(jià)該方法的日內(nèi)（同一樣本1 d內(nèi)進(jìn)樣6 次）和日間（同一樣本連續(xù)進(jìn)樣3 d）的精密度[32]。3 個(gè)摻假駝奶粉樣本日內(nèi)精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）分別為0.45%、0.23%和0.10%，日間精密度RSD分別為7.18%、1.64%和1.26%。結(jié)果表明，所建立的摻假檢測方法具有良好的精密度，包含儀器的精密度和供試樣本的穩(wěn)定性。

2.4.4 重復(fù)性和回收率

通過對(duì)純牛奶粉和純駝奶粉各進(jìn)行5 次獨(dú)立前處理樣品檢驗(yàn)，通過比較牛β-Lg、駝α-La峰面積值，驗(yàn)證樣品制備過程以及取樣的重復(fù)性，純牛奶粉和純駝奶粉RSD分別為2.77%和1.44%。以上結(jié)果表明，該方法的重復(fù)性好（RSD≤5%）。

為測試檢測方法的回收率，向經(jīng)過重復(fù)性檢驗(yàn)的純牛奶粉樣品（β-Lg質(zhì)量濃度均值為126.95 mg/L）中加入牛β-Lg標(biāo)準(zhǔn)品，加入標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度分別為61.80、122.40 mg/L和204.00 mg/L，各3 個(gè)重復(fù)；向經(jīng)過重復(fù)性檢驗(yàn)的駝奶粉樣本（β-Lg含量為0.00 mg/L）中加入牛β-Lg標(biāo)準(zhǔn)品，加入標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為61.92、103.20 mg/L和165.12 mg/L，各3 個(gè)重復(fù)；按照與樣本相同的前處理方法以及色譜條件進(jìn)行測試，用牛β-Lg標(biāo)準(zhǔn)品的線性標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算牛β-Lg的質(zhì)量濃度。該方法的加標(biāo)回收率為94.76%～105.18%，RSD為0.48%～4.20%，結(jié)果表明方法回收率較好（表2）。

表2 方法的回收率Table 2 Spiked recovery of the developed method

2.5 市售駝乳粉樣本檢測

從當(dāng)?shù)厥袌龊碗娚唐脚_(tái)隨機(jī)購買了10 種市售純駝乳粉樣本，將這些樣本按照1.3.2節(jié)前處理方法以及1.3.1節(jié)色譜條件進(jìn)行檢測，各3 個(gè)重復(fù)。根據(jù)牛β-Lg標(biāo)準(zhǔn)曲線y=18 996.40x－386 292.29，可以計(jì)算得出市售純駝乳粉樣本中牛β-Lg含量；此外，根據(jù)建立的“理想化”駝乳粉摻假牛乳粉標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算得到駝乳粉摻假牛乳的大致估計(jì)比例，純駝乳粉摻假情況如表3所示。在10 種全脂純駝乳粉樣本中，未檢測到牛β-Lg的有6 種，表明這6 種駝乳粉沒有摻入牛乳；有4 種檢測到了牛β-Lg，表明這4 種駝乳粉中摻入了牛乳，該檢測結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)室以前建立的PCR方法檢測結(jié)果一致[12]，這排除了檢測結(jié)果的假陽性和假陰性。結(jié)果表明，該方法可成功應(yīng)用于市售駝乳粉中摻假牛乳的篩查、檢測。市售純駝乳粉樣本CMP1-2和CMP1-3的色譜圖見圖6。

表3 10 種市售純駝乳粉樣本摻假檢測結(jié)果Table 3 Results obtained for detection of adulteration in 10 different camel milk powder products

圖6 市售駝乳粉樣本色譜圖Fig.6 Chromatograms of commercial camel milk powder samples

3 結(jié)論

基于乳清蛋白以牛β-Lg為摻假標(biāo)識(shí)物，建立了定性定量檢測駝乳中摻假牛乳的UPLC方法，并且探究熱加工處理對(duì)摻假標(biāo)識(shí)物的影響，結(jié)果表明該檢測方法可應(yīng)用于鮮駝乳、巴氏殺菌駝乳以及駝乳粉中摻假牛乳的檢測。此外，利用該方法對(duì)10 種市售駝乳粉樣本進(jìn)行了檢測，其中4 個(gè)樣本檢出了摻假牛乳，由檢測結(jié)果可知，目前國內(nèi)市場上存在駝乳粉摻假現(xiàn)象，建立摻假檢測方法及相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)勢在必行。

無論使用哪種標(biāo)識(shí)物（蛋白或DNA），進(jìn)行乳的摻假水平定量時(shí)，都必須在不考慮標(biāo)識(shí)物含量變化的前提下進(jìn)行定量，這表示計(jì)算得出的摻假水平只能視為一種近似度量，但實(shí)際上對(duì)摻假水平進(jìn)行精確定量的問題可以忽略不計(jì)，因?yàn)槿绻l(fā)生受經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動(dòng)的摻假行為，必將以大量的水平存在（5%以及更多），較低的摻假百分比不會(huì)產(chǎn)生期望的經(jīng)濟(jì)意義[11,29]，因此，考慮到實(shí)際情況，定量過程中的不精確性可以容忍。

此外，乳清蛋白的穩(wěn)定性受到熱處理強(qiáng)度的影響，使得該方法存在一定的局限性，因此需要繼續(xù)探究熱穩(wěn)定性標(biāo)識(shí)物，為今后駝乳摻假檢測標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)規(guī)程的建立提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)室目前正在尋找熱穩(wěn)定性標(biāo)識(shí)物，發(fā)現(xiàn)乳中的酪蛋白熱穩(wěn)定性非常好[33]，并且牛乳的酪蛋白與駝乳相比存在差異，基于UPLC技術(shù)手段，有望實(shí)現(xiàn)全面檢測駝乳及其乳制品中摻假的牛乳。