不同泌乳期羊乳和牛乳的高通量定量乳清蛋白質(zhì)組學(xué)

張 榮，吳欣雨，賈 瑋

（陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021）

隨著乳制品市場(chǎng)多樣化和家庭膳食結(jié)構(gòu)的改善，全球羊乳消費(fèi)保持穩(wěn)定增長(zhǎng)，促進(jìn)了人們對(duì)羊乳營(yíng)養(yǎng)特性的探索。羊乳及其制品富含維生素、礦物質(zhì)、高質(zhì)量蛋白質(zhì)、低膽固醇和較小的脂肪分子等營(yíng)養(yǎng)素，被認(rèn)為是一種易于消化的低致敏性天然營(yíng)養(yǎng)源，是牛乳基嬰幼兒配方乳粉和母乳的潛在乳源替代物。

羊乳乳清因含有高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值蛋白質(zhì)、大量低聚糖、乳糖和礦物質(zhì)被認(rèn)為是功能性成分，具有免疫調(diào)節(jié)功能和抗菌活性，并可延緩心血管疾病、骨質(zhì)疏松癥、癌癥和肥胖癥的發(fā)病或改善其狀況。目前，基于乳清蛋白的配方乳粉可替代普通嬰幼兒配方乳粉，避免嬰幼兒對(duì)全脂牛乳或大豆蛋白的胃腸道不耐受。Sousa等發(fā)現(xiàn)，與其他反芻動(dòng)物乳相比，羊乳中的低聚糖與母乳更相似，可作為一種重要營(yíng)養(yǎng)素添加至牛乳配方中，以達(dá)到抗致病性、抗黏附性和益生元作用。De Souza Araújo等研究表明，羊乳乳清能抑制促炎細(xì)胞因子的合成，具有顯著抗炎作用。同時(shí)，母乳為嬰幼兒時(shí)期的最佳營(yíng)養(yǎng)來源，但目前由于女性健康和工作等原因?qū)е履溉槲桂B(yǎng)率較低。羊乳和牛乳中蛋白質(zhì)作為嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育的必要物質(zhì)基礎(chǔ)和母乳替代品中的重要營(yíng)養(yǎng)素，目前對(duì)其初乳階段蛋白質(zhì)分析較少，缺少不同階段羊乳和牛乳基乳粉的蛋白質(zhì)精確配比信息。

蛋白質(zhì)組學(xué)分析因其具有鑒別和量化數(shù)千種蛋白質(zhì)的能力，已廣泛應(yīng)用于食品營(yíng)養(yǎng)特性的深入研究。有研究利用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)牛初乳和牛常乳的乳清蛋白進(jìn)行差異分析，發(fā)現(xiàn)與信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的9 種差異蛋白。曹雪妍等在牛初乳和牛常乳乳清中鑒定出129 種糖蛋白和190 個(gè)差異表達(dá)糖基化位點(diǎn)，參與了補(bǔ)體與凝血級(jí)聯(lián)、金黃色葡萄球菌感染和溶酶體等通路。在關(guān)中山羊和荷斯坦奶牛的乳清蛋白中鑒定出114 種顯著差異表達(dá)蛋白，主要參與補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)。這些結(jié)果豐富了牛乳和羊乳的乳清蛋白生物學(xué)特性信息，但鮮有用于區(qū)分羊乳和牛乳之間差異的分析流程，在小樣本快速、可重復(fù)和高靈敏分析的情況下基于蛋白質(zhì)組學(xué)分析乳清蛋白差異的方法更少。

為更好地了解羊乳與牛乳的乳清蛋白組成并評(píng)價(jià)其差異，本研究對(duì)羊乳和牛乳在不同泌乳期的乳清蛋白組成進(jìn)行比較分析。采用非標(biāo)記定量（lable free quantitative method，LFQ）蛋白質(zhì)組學(xué)方法，基于成本效益和時(shí)間最大值算法，系統(tǒng)研究不同泌乳期羊乳和牛乳乳清蛋白質(zhì)組的組成和變化。利用生物信息學(xué)分析進(jìn)行基因功能注釋和參與通路分析，用于評(píng)估乳清蛋白質(zhì)潛在的生物活性功能差異，以期更好地了解牛乳和羊乳的蛋白質(zhì)組成差異，為羊乳基乳制品的研發(fā)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊乳和牛乳樣品取自陜西省西安市關(guān)中奶山羊和荷斯坦奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)。采集產(chǎn)后0～5 d羊初乳和牛初乳和產(chǎn)后1～6 個(gè)月的羊常乳和牛常乳樣品各10 份，在4 ℃貯藏，并在2～4 h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。分析前混合以消除喂養(yǎng)、胎次及個(gè)體差異對(duì)初乳和成熟乳乳清蛋白的影響，分為3 份進(jìn)行重復(fù)分析。

蛋白酶抑制劑（生化試劑） 瑞士Roche公司；胰蛋白酶（生化試劑） 美國(guó)Promega公司；BCA快速蛋白定量試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；所有分離用有機(jī)溶劑均購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

EASY-nLC 1000納升級(jí)液相色譜系統(tǒng)串聯(lián)四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱（Q-Exactive）高分辨質(zhì)譜（配有加熱電噴霧離子源及Xcalibur 4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；FD-5真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)GOLD-SIM公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

將1 mmol/L蛋白酶抑制劑分別添加到50 mL生牛乳和50 mL生羊乳中，并于4 ℃、12 000 r/min離心40 min，獲得乳脂肪層、乳清層和固體顆粒。在乳清層加入10%乙酸溶液調(diào)節(jié)pH值至4.6，在4 ℃、12 000 r/min離心30 min去除酪蛋白，收集上層清液即為乳清蛋白。使用BCA快速蛋白定量試劑盒分別測(cè)定羊乳和牛乳的乳清蛋白含量。

1.3.2 超濾輔助樣品制備消化

將10 μL 100 mmol/L二硫蘇糖醇溶液加入至100 μL蛋白樣品溶液中，56 ℃孵育1 h，以保持蛋白質(zhì)巰基處于還原狀態(tài)，避免蛋白質(zhì)中半胱氨酸之間形成二硫鍵。冷卻至室溫后，加入終濃度50 mmol/L碘乙酰胺，室溫下避光孵育40 min使巰基烷基化。然后用100 μL UA緩沖液洗滌乳清樣品兩次，50 mmol/L NHHCO溶液洗滌一次。將加有胰蛋白酶的NHHCO溶液加入10 kDa超濾離心管，酶與底物質(zhì)量比為1∶20，37 ℃過夜酶解。用體積分?jǐn)?shù)1%甲酸溶液終止消化后使用C柱進(jìn)行脫鹽，凍干，最終復(fù)溶在40 μL體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液中進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

1.3.3 液相色譜-質(zhì)譜鑒定及數(shù)據(jù)分析

色譜條件：將5 μL待測(cè)樣品溶液注入C反相色譜柱（100 mm×75 μm，3 μm）中，以IntelliFlow控制流速為250 nL/min，用流動(dòng)相A（水＋體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸＋4 mmol/L甲酸銨）和流動(dòng)相B（80%乙腈＋體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸＋4 mmol/L甲酸銨）進(jìn)行樣品洗脫。洗脫梯度：0～50 min，95%～65% A、5%～35% B；50～95 min，65%～0% A、35%～100% B；95～100 min，0% A、100% B；100～110.1 min，0%～95% A、100%～5% B；110.1～120 min，95% A、5% B。

質(zhì)譜條件：加熱電噴霧電離離子源，噴霧電壓3.8 kV，RF透鏡電壓55 V，毛細(xì)管溫度275 ℃，數(shù)據(jù)依賴采集模式dd/MS，范圍/300～1 700，正離子模式下一級(jí)掃描分辨率70 000（半峰寬/200），二級(jí)掃描分辨率17 500，最大離子注入時(shí)間120 ms，在線性離子阱中對(duì)前20 個(gè)響應(yīng)最高的前體離子進(jìn)行碎裂，隔離窗口/2，碰撞能量27 eV。前體離子動(dòng)態(tài)排除時(shí)間40 s。

1.4 數(shù)據(jù)分析

質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)由MaxQuant軟件處理，在選定胰蛋白酶作為消化酶，設(shè)置N-端蛋白質(zhì)乙?；脱趸癁榭勺冃揎棥㈦寮谆揎棡楣潭ㄐ揎?、LFQ定量算法、匹配時(shí)間窗口0.7 min和對(duì)齊時(shí)間窗口20 min等參數(shù)，生成蛋白質(zhì)的定量數(shù)據(jù)矩陣。SIMCA 14.1軟件建立偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）模型增強(qiáng)聚類效果并識(shí)別潛在的生物標(biāo)志物。利用DAVID生物信息學(xué)資源6.8進(jìn)行基因功能富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)譜鑒定及表達(dá)差異分析

由于質(zhì)譜儀鑒定肽段具有一定的長(zhǎng)度限制，胰蛋白酶產(chǎn)生酶切肽段的C-末端與具有高度特異性的精氨酸和賴氨酸結(jié)合，產(chǎn)生長(zhǎng)度適當(dāng)?shù)膲A性肽。圖1為鑒定肽段的長(zhǎng)度分布圖，顯示鑒定的肽段包含氨基酸數(shù)目大部分為7～20，均在肽段長(zhǎng)度合理范圍內(nèi)，且與質(zhì)譜鑒定的分子質(zhì)量范圍（/300～1 700）一致。肽段的精確鑒定可顯著降低假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)概率。本實(shí)驗(yàn)使用的Q-Orbitrap質(zhì)譜儀一級(jí)和二級(jí)掃描的質(zhì)量精確度都小于5×10，但為提高鑒定結(jié)果的精確性，在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)搜索肽段匹配誤差閾值設(shè)置為0.05 Da。所有已鑒定肽的質(zhì)量誤差在±5×10范圍內(nèi)，證明所建立方法的高可靠性和準(zhǔn)確性。本研究中，通過肽段在牛乳和羊乳乳清中共鑒定出489 種乳清蛋白，乳清樣品中已鑒定蛋白質(zhì)的LFQ強(qiáng)度跨越近5 個(gè)數(shù)量級(jí)。

圖1 已鑒定肽段的長(zhǎng)度分布Fig.1 Length distribution of identified peptides

對(duì)所有已鑒定蛋白質(zhì)進(jìn)行Venn分析，分別在牛初乳、牛常乳、羊初乳和羊常乳中鑒定到170、161、240 種和291 種乳清蛋白，其中特征蛋白分別為34、45、85 種和97 種。4 種乳清蛋白質(zhì)組中47 種乳清蛋白共同表達(dá)，包括血凝蛋白、補(bǔ)體成分3和血清白蛋白等。牛常乳為目前應(yīng)用最廣泛的乳源，與羊初乳和牛初乳相比，牛常乳中鑒定出57 種特征乳清蛋白；與羊常乳相比，牛常乳中鑒定出85 種特征乳清蛋白，包括血清淀粉樣蛋白、-HS-糖蛋白和不溶性彈性結(jié)構(gòu)蛋白等。同時(shí)，羊常乳為目前替代牛乳最合適且營(yíng)養(yǎng)豐富的乳源，與羊初乳和牛初乳相比，羊常乳乳清蛋白中鑒定出109 種特征乳清蛋白。與牛常乳相比，羊常乳中鑒定出110 種特征乳清蛋白，包括-2-糖蛋白1、MAP34-A蛋白和骨橋蛋白等。

2.2 不同泌乳期羊乳和牛乳乳清蛋白化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

圖2 4種乳清樣品的PLS-DA模型Fig.2 PLS-DA model for four whey samples

圖3 PLS-DA模型置換檢驗(yàn)圖Fig.3 Permutation test plot for validation of PLS-DA model

為確定4 組乳清蛋白質(zhì)組間的生物標(biāo)志物進(jìn)行變量投影重要性（variable important in projection，VIP）分析。由圖4可知，組織蛋白酶2、白細(xì)胞介素20受體亞單位、PKS-ER結(jié)構(gòu)域蛋白、纖維蛋白原鏈、膜聯(lián)蛋白、核結(jié)合蛋白2、黑素轉(zhuǎn)鐵蛋白、乳脂肪球表皮生長(zhǎng)因子8蛋白和血小板反應(yīng)蛋白1這9 種蛋白VIP值大于1，且在羊乳中含量較高，可用于區(qū)分牛初乳、牛常乳、羊初乳和羊常乳。膜聯(lián)蛋白是一種鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白，參與細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架的形成，具有穩(wěn)定脂質(zhì)雙層膜骨架作用。同時(shí)，膜聯(lián)蛋白可通過與甲酰肽受體結(jié)合，抑制中性粒細(xì)胞滾動(dòng)，減少中性粒細(xì)胞黏附和滲出，從而減少炎癥部位中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和炎性細(xì)胞因子釋放。纖維蛋白原是肝臟合成凝血系統(tǒng)的核心蛋白質(zhì)，在凝血酶作用下形成凝固性纖維蛋白凝塊發(fā)揮凝血作用，而纖維蛋白原鏈的翻譯和轉(zhuǎn)錄是合成整個(gè)纖維蛋白原分子的限速步驟。CD5分子樣蛋白、絲氨酸蛋白酶抑制劑A3-5、線粒體ATP合成酶亞單位、橋粒蛋白、含F(xiàn)ABP結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白在其他3 組乳中含量較高。其中橋粒蛋白在牛初乳中含量最高，為細(xì)胞內(nèi)橋粒結(jié)構(gòu)的基本組成部分，可通過影響鈉離子通道功能屬性或Cx43蛋白表達(dá)分布導(dǎo)致心律失常。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與羊乳相比，橋粒蛋白在牛乳清中表達(dá)更為廣泛。

圖4 4 組乳清蛋白質(zhì)組間生物標(biāo)志物VIP得分Fig.4 VIP scores of biomarkers among whey proteomes from bovine and goat colostrum and mature milk

2.3 不同泌乳期羊乳和牛乳乳清蛋白生物信息學(xué)分析

利用DAVID生物信息學(xué)資源6.8，根據(jù)分子功能、細(xì)胞成分和生物過程對(duì)牛乳和羊乳中的乳清蛋白進(jìn)行分類。胞外區(qū)、胞外間隙、血液微粒和胞外體是乳清蛋白定位的主要細(xì)胞成分，說明這些低豐度蛋白組分是血清中蛋白質(zhì)在乳腺細(xì)胞的緊密連接處通過細(xì)胞間或跨細(xì)胞傳遞到乳清中。其他蛋白與角蛋白絲、局灶性黏連、血小板顆粒等功能有關(guān)。乳清蛋白的主要分子功能有結(jié)構(gòu)分子活性、絲氨酸型內(nèi)肽酶抑制劑活性以及糖蛋白結(jié)合。絲氨酸型肽鏈內(nèi)切酶抑制劑活性、絲氨酸型肽鏈內(nèi)切酶活性和結(jié)構(gòu)分子活性在羊常乳中最為豐富，其次是半胱氨酸型肽鏈內(nèi)切酶抑制劑活性、糖蛋白結(jié)合和過氧化還原酶活性。因此，根據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)的基因功能富集分析，乳清蛋白可能參與了人類健康相關(guān)途徑，而其生物活性在羊乳和牛乳的初乳和常乳中有所不同。

乳清蛋白參與的生物學(xué)過程以視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)和內(nèi)肽酶活性負(fù)調(diào)控最為顯著，急性期反應(yīng)、纖溶和糖酵解過程也占很大比例。羊常乳中，與視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)、纖溶、先天免疫應(yīng)答有關(guān)的蛋白質(zhì)數(shù)量明顯較多；牛常乳中，與抗菌體液反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)數(shù)量顯著增加。參與糖酵解過程、肽激素分泌的陽(yáng)性調(diào)節(jié)和血管收縮陽(yáng)性調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)在羊初乳中表達(dá)較高；參與內(nèi)肽酶活性負(fù)調(diào)控、急性期反應(yīng)、抗原處理和通過MHC I類表達(dá)肽抗原以及免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)在牛初乳中表達(dá)較高。進(jìn)一步研究羊初乳和牛初乳的乳清蛋白差異發(fā)現(xiàn)，有170 種蛋白豐度存在顯著差異。牛初乳中有136 種乳清蛋白未被鑒定或含量極低，包括-烯醇化酶、血管緊張素原和補(bǔ)體成分3等。羊初乳中的高表達(dá)蛋白與補(bǔ)體激活、內(nèi)肽酶活性負(fù)調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞遷移、脂質(zhì)儲(chǔ)存和生物素代謝過程有關(guān)；這些特征蛋白的分子功能包括磷脂?；富钚?、磷脂結(jié)合、糖蛋白結(jié)合和絲氨酸型肽鏈內(nèi)切酶抑制劑活性。此外，肌抑制素、凝溶膠蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶BiP、橋粒膠蛋白、黏著素亞單位SA-1等34 種常見蛋白在羊初乳中的豐度明顯高于牛初乳，這些常見蛋白主要與免疫應(yīng)答、內(nèi)肽酶活性負(fù)調(diào)控、視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞黏附、骨化和急性期反應(yīng)相關(guān)。這些蛋白在羊初乳中的分子功能包括絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、肝素結(jié)合、鈣離子結(jié)合、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合和蛋白結(jié)合。說明初乳中高水平的抗菌蛋白和免疫活性蛋白可能有助于消除腸道中的致病菌，減少腸道炎癥和敗血癥。羊初乳中急性期反應(yīng)蛋白的豐度高于牛初乳，可能是由于哺乳初期初生羔羊面臨從無菌環(huán)境到微生物環(huán)境的脅迫所致。初乳是幫助新生兒建立自身免疫系統(tǒng)的主要營(yíng)養(yǎng)來源，羊初乳中較高豐度的急性期反應(yīng)蛋白有助于新生兒建立抗微生物感染的免疫系統(tǒng)。

與其他乳清相比，羊常乳中乳清蛋白共有107 個(gè)蛋白豐度存在顯著差異，其中54 種蛋白在羊常乳中特異性表達(dá)，包括肌抑制素、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂蛋白、凝溶膠蛋白、血凝蛋白、尿苷磷酸化酶2、蛋白S100-A8、黃嘌呤脫氫酶等。羊常乳中，13 種蛋白質(zhì)豐度顯著高于其他乳，包括肌抑制素、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶BiP、肌球蛋白7和前纖維蛋白1等；11 種蛋白質(zhì)豐度極低或未在羊常乳中鑒定，包括CD5分子樣蛋白、角苔蘚素、纖維連接蛋白、乳膠蛋白和核結(jié)合蛋白-1等。值得注意的是，羊常乳中的96 種高表達(dá)蛋白中有17 種與免疫應(yīng)答有關(guān)，包括血凝蛋白、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂蛋白、骨橋蛋白、補(bǔ)體成分3和S100-A9蛋白等。骨橋蛋白是一種由破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、腎細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞以及活化免疫細(xì)胞（如T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）分泌的磷酸化糖蛋白，參與骨形態(tài)發(fā)生和調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞動(dòng)員，在炎癥和組織重塑部位顯著上調(diào)，可作為促炎和抗炎細(xì)胞因子。中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂蛋白是一種分子質(zhì)量25 kDa的分泌糖蛋白，在細(xì)菌感染時(shí)由先天免疫細(xì)胞分泌產(chǎn)生，可通過螯合載鐵分子限制細(xì)菌的生長(zhǎng)速率。這些結(jié)果都表明羊常乳可以有效提高機(jī)體免疫力。

黃嘌呤脫氫酶、肌球蛋白7、U6-snRNA相關(guān)的Sm樣蛋白LSm4、-乳清蛋白和載脂蛋白A1等17 種羊常乳中高表達(dá)的蛋白質(zhì)與一系列代謝過程有關(guān)。在哺乳動(dòng)物中黃嘌呤脫氫酶和黃嘌呤氧化酶是黃嘌呤氧化還原酶的兩種互換形式。黃嘌呤脫氫酶為其天然形式，主要存在于細(xì)胞內(nèi)部，可通過巰基氧化或有限的蛋白水解作用轉(zhuǎn)化為黃嘌呤氧化酶。在黃嘌呤脫氫酶到黃嘌呤氧化酶的轉(zhuǎn)化過程中，具有NAD依賴性脫氫酶和O依賴性氧化酶活性的中間產(chǎn)物可能產(chǎn)生HO和超氧陰離子自由基等活性氧，在過渡金屬存在下通過Haber-Weiss和Fenton反應(yīng)生成高細(xì)胞毒性的羥自由基。黃嘌呤脫氫酶通過產(chǎn)生影響氧化還原平衡的氧化劑參與代謝過程。載脂蛋白A1是高密度脂蛋白的載體蛋白，將膽固醇從周圍組織運(yùn)輸?shù)礁闻K代謝，從而清潔血管壁。血清高密度脂蛋白膽固醇水平越高，人體將血清膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟代謝的能力越好，從而有效降低動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的可能性。而載脂蛋白A1水平的升高會(huì)增加高密度脂蛋白的合成，因此載脂蛋白A1可通過參與代謝過程降低罹患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。

5 種蛋白（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶BiP、凝溶膠蛋白、轉(zhuǎn)錄因子AP-2、雙特異性蛋白磷酸酶和rho-GDP解離抑制劑2）參與了細(xì)胞凋亡過程。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶BiP是多功能蛋白質(zhì)，其能與靠近內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的免疫球蛋白結(jié)合蛋白、凝集素鈣蛋白和鈣網(wǎng)蛋白的多肽產(chǎn)生相互作用。對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體Ca串?dāng)_的調(diào)節(jié)是其附加功能之一，這種功能依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶BiP與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca處理機(jī)制的相互作用，這種新的附加功能允許內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶BiP直接控制線粒體凋亡，無需通過未折疊蛋白反應(yīng)上調(diào)促凋亡轉(zhuǎn)錄因子。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)折疊機(jī)制通過控制線粒體氧化磷酸化速率微調(diào)ATP的輸入。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶BiP在調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)線粒體Ca流量中的作用表明，在分泌大量蛋白質(zhì)的細(xì)胞類型中，分泌蛋白折疊的過程是細(xì)胞存活和死亡的中心調(diào)節(jié)器；而在其他類型細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊可能是一種前哨機(jī)制，監(jiān)測(cè)細(xì)胞的健康狀況，以控制細(xì)胞代謝和凋亡。凝溶膠蛋白是一種內(nèi)源性細(xì)胞質(zhì)蛋白和分泌性血漿蛋白，可以調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白組裝和分解，其裂解產(chǎn)物在多種細(xì)胞類型中的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞分離、聚集和核碎裂。已有報(bào)道通過HEK293T細(xì)胞的高轉(zhuǎn)染效率研究電壓依賴性陰離子通道（voltage-dependent anion-selective channel，VDAC）蛋白與凝溶膠蛋白之間的相互作用，并證明VDAC與凝溶膠蛋白的G5結(jié)構(gòu)域結(jié)合，而不與其他結(jié)構(gòu)域結(jié)合。凝溶膠蛋白的G5段顯示VDAC與HIV-Vpr重疊、競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，G5結(jié)構(gòu)域通過阻斷Vpr與VDAC的結(jié)合抑制HIV-Vpr誘導(dǎo)的T細(xì)胞凋亡。雙特異性蛋白磷酸酶通過差異表達(dá)和對(duì)MAPK信號(hào)通路的調(diào)節(jié)在多種類型人類癌癥中發(fā)揮作用，其特異性抑制腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的p38/MAPK活化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低核因子（nuclear factor，NF-）活性。同時(shí)雙特異性蛋白磷酸酶在DU145細(xì)胞中的過度表達(dá)也會(huì)通過阻斷p65/NF-核移位促進(jìn)細(xì)胞凋亡和降低NF-活性，從而抑制癌癥發(fā)生或延緩發(fā)病。

羊乳和牛乳的初乳和常乳中蛋白質(zhì)顯著表達(dá)的前10 條通路如圖5所示。補(bǔ)體與凝血級(jí)聯(lián)、抗生素生物合成和碳代謝是最顯著的途徑。-抗蛋白酶、補(bǔ)體成分3和補(bǔ)體因子H參與補(bǔ)體與凝血級(jí)聯(lián)途徑。丙酮酸激酶、-烯醇化酶、核苷二磷酸激酶和補(bǔ)體因子H與抗生素的生物合成有關(guān)。PALP結(jié)構(gòu)域蛋白、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶和異檸檬酸脫氫酶參與碳代謝。其他主要途徑有Rap1信號(hào)途徑、氨基酸生物合成和溶酶體。根據(jù)通路分析，實(shí)驗(yàn)鑒定的乳清蛋白與多種代謝途徑有關(guān)。在乳清蛋白中，補(bǔ)體與凝血級(jí)聯(lián)途徑是天然免疫的介質(zhì)，可產(chǎn)生具有促炎癥特性的補(bǔ)體裂變產(chǎn)物。在病理生理學(xué)中，凝血級(jí)聯(lián)激活后損傷部位凝血酶的形成可以提供抵御微生物入侵的物理屏障，并觸發(fā)補(bǔ)體系統(tǒng)。此外，通過局部刺激產(chǎn)生的過敏毒素可激活細(xì)胞免疫應(yīng)答。Amara等分析體內(nèi)和體外凝血系統(tǒng)中多種因素與中樞補(bǔ)體成分之間的多重聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)中，羊乳清中補(bǔ)體裂變產(chǎn)物的含量高于牛乳，而其中補(bǔ)體因子H有助于胎兒免疫保護(hù)，補(bǔ)體成分3和補(bǔ)體成分7可作為防御因子。羊乳和牛乳中乳清蛋白對(duì)糖代謝的影響可能與其活性乳清蛋白有關(guān)。葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶是一種胞漿型非限速酶，能支持特定胚胎脊髓神經(jīng)元的存活和培養(yǎng)，并介導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化為終末單核細(xì)胞。異檸檬酸脫氫酶作為一種新的角膜晶體蛋白，在促進(jìn)角膜透明性方面發(fā)揮結(jié)構(gòu)和催化作用。Nam等報(bào)道隨異檸檬酸脫氫酶表達(dá)的減少，3T3-L1前脂肪細(xì)胞的脂肪生成減少，葡萄糖攝取和脂肪合成減少。此外，異檸檬酸脫氫酶表達(dá)的抑制導(dǎo)致NOX4活性抑制，從而降低分化脂肪細(xì)胞的水平。羊乳清中PALP結(jié)構(gòu)域蛋白、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶和異檸檬酸脫氫酶的含量越高，羊乳的降血糖作用越強(qiáng)。

圖5 不同泌乳期羊乳和牛乳蛋白質(zhì)富集的通路分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis of proteins in goat and bovine colostrum and mature milk from

3 結(jié)論

在牛初乳、牛常乳、羊初乳和羊常乳中分別鑒定到170、161、240 種和291 種乳清蛋白，47 種蛋白質(zhì)在4 組乳樣中共同表達(dá)，說明雖然羊乳和牛乳之間存在顯著差異，但羊乳在一定程度上可用于替代牛乳。對(duì)所鑒定乳清蛋白的LFQ強(qiáng)度建立PLS-DA模型，發(fā)現(xiàn)牛初乳和牛常乳在蛋白質(zhì)組成上比羊初乳和羊常乳更相似，篩選了羊乳中豐度較高的9 種蛋白質(zhì)用作標(biāo)志物區(qū)分這4 組乳樣。經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，鑒定的乳清蛋白主要參與的生物過程為視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)和內(nèi)肽酶活性負(fù)調(diào)控，定位的主要細(xì)胞成分是胞外區(qū)、胞外間隙、血液微粒和胞外體，主要分子功能為結(jié)構(gòu)分子活性、絲氨酸型內(nèi)肽酶抑制劑活性和糖蛋白結(jié)合。通路分析發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)體與凝血級(jí)聯(lián)、抗生素生物合成和碳代謝是最顯著的途徑。在羊常乳中篩選出96 種高豐度蛋白質(zhì)，大部分與免疫應(yīng)答、代謝過程及細(xì)胞凋亡有關(guān)。羊初乳中34 種常見蛋白的豐度明顯高于牛初乳，主要與免疫應(yīng)答、內(nèi)肽酶活性負(fù)調(diào)控和急性期反應(yīng)相關(guān)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)羊乳的特征蛋白組成及差異蛋白可能參與的生物過程，加深對(duì)羊乳蛋白的認(rèn)識(shí)，對(duì)牛乳及其制品的營(yíng)養(yǎng)改良和母乳替代品的生產(chǎn)具有重要意義。