乳酸菌發(fā)酵對山楂汁理化性質(zhì)、酚類化合物、抗氧化性及風(fēng)味的影響

黃 豪，周 義，陳佳慧，雷宏杰

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

山楂（Bunge）是薔薇科山楂屬植物的果實，也稱“仙果”、“山里紅”，已被衛(wèi)生部列入第一批藥食兩用名單。山楂富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，如黃酮、有機(jī)酸（包括檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、草酸等）、三萜類、維生素和礦物質(zhì)等，具有促進(jìn)消化、預(yù)防和治療心腦血管疾病等藥理作用。雖然山楂營養(yǎng)豐富，但其口感酸澀，少有鮮食。而山楂產(chǎn)品在加工過程中往往添加大量的糖或蒸煮過度，存在口感較差、營養(yǎng)和功能成分損失嚴(yán)重的問題，限制了消費人群。因此，需要一種新型山楂加工技術(shù)來解決這一問題。

乳酸菌是可以代謝糖類產(chǎn)生乳酸的一類微生物，也是可以為人們提供健康益處的益生菌。乳酸菌發(fā)酵食品歷史悠久，主要以乳制品為主，但存在一定的局限性，如乳糖不耐受、素食主義等。近年來，越來越多的關(guān)注集中于以果蔬汁為基質(zhì)的乳酸菌發(fā)酵。乳酸菌發(fā)酵既能改善果蔬汁的風(fēng)味，提高營養(yǎng)價值，也能延長貨架期，增強(qiáng)保健作用。高辰哲等選用4 種乳酸菌分別發(fā)酵黑枸杞汁，確定了保加利亞乳桿菌的抗氧化能力和發(fā)酵性能最強(qiáng)。經(jīng)過不同來源10 株乳酸菌在梨汁中的耐受性篩選和進(jìn)一步的發(fā)酵性能比較，焦媛媛等確定了干酪乳桿菌GG8是梨汁發(fā)酵的最適宜菌株。類似地，通過比較不同發(fā)酵液的理化性質(zhì)和感官評價，白琳等確定戊糖片球菌是研究的5 種乳酸菌中最適宜庫車小白杏汁發(fā)酵的菌株。目前山楂酒、山楂醋等山楂發(fā)酵產(chǎn)品和相關(guān)研究比較多，而市場上很少有乳酸菌發(fā)酵山楂飲料，適宜山楂汁發(fā)酵的乳酸菌菌種及發(fā)酵對其理化性質(zhì)、功能成分等的影響鮮有研究。

因此，本研究以山楂汁為基質(zhì)選用6 種乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵。通過比較活菌數(shù)、有機(jī)酸、酚類化合物、抗氧化性、風(fēng)味物質(zhì)組成等指標(biāo)并結(jié)合感官評價篩選出最適宜山楂汁發(fā)酵的乳酸菌，旨在為工業(yè)生產(chǎn)益生菌發(fā)酵山楂汁飲品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂品種為大五棱，選用自然干燥的山楂片，購自中國山東省棗莊；植物乳桿菌（90，）、嗜酸乳桿菌（85，）、干酪乳桿菌（37，）、副干酪乳桿菌（01，）、瑞士乳桿菌（76，）、雙歧乳桿菌（80，）購自江蘇微康生物科技有限公司。

沒食子酸、蘆丁、綠原酸、兒茶素、Trolox等標(biāo)準(zhǔn)品美國Sigma-Aldrich公司；甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜級）、福林-酚、2,2’-聯(lián)氨-雙3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、2,4,6-三吡啶基三嗪（1,3,5-tri(2-pyridyl)-2,4,6-triazine，TPTZ） 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-2030 Plus高效液相色譜儀、GCMS-QP2010 Ultra氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、UV1780紫外-可見分光光度計日本島津公司；JYL-C022E榨汁攪拌機(jī) 濟(jì)南九陽股份有限公司；CM-5色差計 美國HunterLab公司；數(shù)字pH計 瑞士Mettler-Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化

分別取6 種甘油管乳酸菌菌液1 mL，與10 mL MRS肉湯培養(yǎng)基混合在37 ℃培養(yǎng)24 h，然后將各乳酸菌菌懸液添加到100 mL MRS肉湯并在37 ℃培養(yǎng)12 h，5 000×、4 ℃離心10 min收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌3 次后制備菌懸液，用于接種發(fā)酵。

1.3.2 發(fā)酵基質(zhì)的制備與接種發(fā)酵

挑選無蟲害無暗色的山楂干，去籽，拭去灰塵，稱質(zhì)量，然后與蒸餾水混合打漿10 min（16.7 g/100 mL），混合物于50 ℃水浴浸提4 h，之后6 000×、4 ℃離心10 min，收集上清液，可溶性固形物為10.2 °Brix，pH值為2.93，用食品級NaCO調(diào)節(jié)其pH值至4.70，制汁和調(diào)酸均符合國家標(biāo)準(zhǔn)，調(diào)節(jié)酸度后并未失去山楂的色、香、味，符合GB/T 31121—2014《果蔬汁類及其飲料》的定義，可稱為山楂汁。然后進(jìn)行巴氏殺菌（80 ℃，10 min），作為發(fā)酵基質(zhì)，冷卻至室溫后以體積分?jǐn)?shù)0.5%接種量接種，于37 ℃培養(yǎng)48 h。以相同條件下未接種發(fā)酵的山楂汁為對照。

1.3.3 活菌數(shù)的測定

使用稀釋涂布平板法測定各菌株發(fā)酵過程中活菌數(shù)變化。

1.3.4 理化特性的測定

使用pH計測定樣品的pH值；使用折光儀在25 ℃測得可溶性固形物，以白利糖度（°Brix）表示；使用0.1 mol/L NaOH溶液滴定確定可滴定酸含量，并以乳酸計。

通過高效液相色譜系統(tǒng)測定有機(jī)酸，根據(jù)高世陽的方法，稍作修改。色譜柱為Waters C，流動相為KHPO（0.01 mol/L，pH 2.7）-3%甲醇。樣品通過0.45 μm聚醚砜親水膜過濾器后裝入樣品瓶中。使用外標(biāo)方法通過峰保留時間定量分析高效液相色譜結(jié)果。

1.3.5 總酚、總黃酮含量的測定

采用福林-酚法測定總酚含量，將0.5 mL稀釋樣品加入到2.5 mL 10%福林-酚試劑中，反應(yīng)3 min后，加入2 mL 75 g/L NaCO溶液。避光反應(yīng)60 min后測定765 nm波長處吸光度。以沒食子酸當(dāng)量（mg/L）表示，標(biāo)準(zhǔn)曲線為=0.010 4＋0.101 4，=0.997 2。

使用AlCl比色法測定總黃酮含量，將0.5 mL 50 g/L NaNO溶液與4 mL稀釋樣品（1∶50）混合反應(yīng)5 min，然后向混合物中添加1 mL 100 g/L AlCl溶液并反應(yīng)5 min，再向混合物中添加2 mL 2 mol/L NaOH溶液，10 min后測定510 nm波長處吸光度，總黃酮含量表示為蘆丁當(dāng)量（mg/L），標(biāo)準(zhǔn)曲線為=0.005 9－0.002，=0.999 7。

酚類組成測定根據(jù)Li Zhongxi等的方法，略有修改。流動相為1%甲酸溶液（A相）和乙腈（B相）。洗脫程序為：0～5 min，95% A、5% B；5～25 min，88% A、12% B；25～40 min，70% A、30% B；40～50 min，55% A、45% B；50～60 min，95% A、5% B。流速1 mL/min，柱溫箱溫度30 ℃，檢測波長280 nm。

1.3.6 抗氧化能力測定

1.3.6.1 ABTS陽離子自由基清除活性

通過Raffaella等方法，稍加修改。取等體積的ABTS溶液（7 mmol/L）和KSO溶液（2.45 mmol/L）混合，室溫下避光反應(yīng)16 h以產(chǎn)生ABTS陽離子自由基，然后用80%乙醇溶液稀釋至其在734 nm波長處獲得0.70±0.02的吸光度。取300 μL稀釋樣品（1∶200）添加到5 mL的混合物中，避光反應(yīng)6 min，然后在734 nm波長處測定吸光度，結(jié)果表示為ABTS陽離子自由基抑制率，按式（1）計算：

1.3.6.2 Fe還原能力（Ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）

根據(jù)Suárez-Jacobo等的方法，稍有修改。將1 L pH 3.6醋酸鹽緩沖溶液、100 mL TPTZ和100 mL 0.02 mol/L FeCl溶液混合并使其在37 ℃靜置30 min以獲得反應(yīng)試劑。然后將0.2 mL稀釋樣品（1∶500）和6 mL試劑混合以在37 ℃反應(yīng)30 min后測定593 nm波長處的吸光度。用Trolox制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線=6.190 5＋0.192 7，=0.998 4。

1.3.7 色值

使用色差儀對CIE顏色參數(shù)（、和）進(jìn)行測定。表示明亮度，正值表示偏亮，負(fù)值表示偏暗；為紅綠，正值表示偏紅，負(fù)值表示偏綠；代表黃藍(lán)，正值表示偏黃，負(fù)值表示偏藍(lán)，總色差（Δ）為與對照（未發(fā)酵樣品）相比的顏色總差別，按式（2）計算：

1.3.8 揮發(fā)性成分分析

使用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析揮發(fā)性化合物。根據(jù)束秀文等報道的方法，進(jìn)行修改。將5 mL樣品加入含有2 g NaCl的15 mL玻璃小瓶中，然后加入10 μL 2-辛醇作為內(nèi)標(biāo)（0.2 mg/mL）。使用75 μm CAR-PDMS萃取頭進(jìn)行頂空微萃取。樣品在40 ℃進(jìn)行30 min的平衡，然后吸附45 min后通過氣相色譜-質(zhì)譜進(jìn)行分析。氣相色譜條件：TR-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm，J&W Scientific，USA）；He流量1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；升溫程序：起始柱溫50 ℃，保持3 min，以5 ℃/min的速率升到200 ℃，保持12 min。

按式（3）計算發(fā)酵山楂汁中各揮發(fā)性物質(zhì)含量，按式（4）計算各物質(zhì)的香氣活性值（odor activity value，OAV）：

1.3.9 感官評價

采用9 點快感標(biāo)度法評價發(fā)酵與未發(fā)酵山楂汁的感官性質(zhì)，評定小組由20 名經(jīng)過感官訓(xùn)練的同學(xué)組成，對顏色、酸甜度、香氣、味道、體態(tài)、風(fēng)味和整體接受性7 個性質(zhì)進(jìn)行評價，評分分為9 個等級對應(yīng)評價人員的喜好程度，9：極度喜歡；8：很喜歡；7：中等喜歡；6：輕度喜歡；5：無所謂；4：輕度不喜歡；3：中等不喜歡；2：很不喜歡；1：極度不喜歡。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 18進(jìn)行統(tǒng)計分析。使用單因素方差分析和Student-Newman-Keuls法進(jìn)行顯著性分析和多重比較，＜0.05，差異顯著。所有實驗重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中活菌數(shù)的變化

如表1所示，不同菌株發(fā)酵液的活菌數(shù)具有相同的變化趨勢，即在發(fā)酵前24 h均快速增長，并在24 h達(dá)到最大（10.7（lg（CFU/mL））左右），其中發(fā)酵液的活菌數(shù)最大，為10.86（lg（CFU/mL））。之后的12 h內(nèi)活菌數(shù)快速下降，然后基本保持不變。下降的原因可能是乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生大量有機(jī)酸造成發(fā)酵液pH值的下降，低pH值環(huán)境進(jìn)而影響了乳酸菌的生長。至發(fā)酵結(jié)束，各菌株發(fā)酵液的活菌數(shù)均在8.59～8.84（lg（CFU/mL））之間，顯著高于起始量。這說明不同乳酸菌菌株在山楂汁中的活力沒有顯著差異，且調(diào)酸的山楂汁可作為乳酸菌生長的合適基質(zhì)。

表1 發(fā)酵過程中6 種乳酸菌活菌數(shù)的變化Table 1 Changes in viable cell counts of six LAB strains during fermentation of hawthorn juice

2.2 不同益生菌發(fā)酵對山楂汁可溶性固形物、pH值和可滴定酸的影響

由圖1A可知，不同乳酸菌發(fā)酵山楂汁的可溶性固形物在發(fā)酵過程中有輕微下降，由10.27 °Brix下降至9.67～10.03 °Brix，達(dá)到了顯著水平（＜0.05）。其下降是因為乳酸菌利用山楂汁中的糖類進(jìn)行生長和發(fā)酵。從圖1B可以看出，所選6 種乳酸菌發(fā)酵的山楂汁的pH值在發(fā)酵過程中顯著下降，這是由于發(fā)酵過程中產(chǎn)生有機(jī)酸，例如乳酸、乙酸和蘋果酸，導(dǎo)致pH值下降。由圖1C可以看出，6 種乳酸菌發(fā)酵山楂汁的可滴定酸含量與pH值呈相反的趨勢，即發(fā)酵過程中可滴定酸含量持續(xù)增加（＜0.05），由0.74 g/100 mL增加至1.20 g/100 mL左右，其中含量最高的是發(fā)酵液，達(dá)到1.26 g/100 mL?？傻味ㄋ崤cpH值的變化呈負(fù)相關(guān)，這與Chen Chen等的研究一致。反常的是，在發(fā)酵前12 h發(fā)酵液的pH值有輕微的升高，這可能是由于發(fā)酵前期先以蘋果酸為碳源進(jìn)行發(fā)酵，將蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸，因而pH值呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，這與Markkinen等在研究乳酸菌發(fā)酵黑苦莓和沙棘汁時pH值的變化趨勢基本一致。

圖1 山楂汁發(fā)酵過程中總可溶性固形物（A）、pH值（B）和可滴定酸（C）的變化Fig.1 Changes in total soluble solids (A),pH (B) and titratable acidity (C) of hawthorn juice during fermentation by six LAB strains

有機(jī)酸可以促進(jìn)消化、軟化血管，原料本身和乳酸菌的代謝決定了發(fā)酵山楂汁中的有機(jī)酸組成，有機(jī)酸也會影響山楂汁的穩(wěn)定性、感官品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)等。進(jìn)一步有機(jī)酸測定結(jié)果表明（表2），山楂汁中主要的有機(jī)酸是蘋果酸（1.55 mg/mL）和檸檬酸（0.81 mg/mL）。相比于發(fā)酵前，6 種乳酸菌發(fā)酵山楂汁的乳酸、酒石酸、草酸和蘋果酸含量均顯著增加（＜0.05）。發(fā)酵產(chǎn)生了大量乳酸（2.67～3.95 mg/mL），還有蘋果酸含量增加了69.7%～151.0%。除發(fā)酵液外，檸檬酸含量也均有所增加（＜0.05）。相比于未發(fā)酵山楂汁，發(fā)酵使總有機(jī)酸質(zhì)量濃度增加了4.5 mg/mL以上。同樣地，在陳榮豪等對乳酸菌發(fā)酵番木瓜飲料的研究中也存在發(fā)酵后蘋果酸、檸檬酸和酒石酸含量顯著升高的現(xiàn)象。有機(jī)酸的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化主要與乳酸菌的糖酵解代謝和半乳糖代謝途徑有關(guān)。

表2 6 種乳酸菌發(fā)酵前后山楂汁有機(jī)酸的組成和含量Table 2 Contents of organic acids in hawthorn juice before and after LAB fermentation

2.3 不同乳酸菌發(fā)酵對山楂汁的總酚、總黃酮及體外抗氧化性的影響

總酚和總黃酮含量是水果的重要特征，因為它們能對人類健康產(chǎn)生積極影響，例如抗炎、抗氧化和預(yù)防癌癥等。不同乳酸菌發(fā)酵山楂汁的總酚、總黃酮變化如圖2A、B所示，相比于發(fā)酵前，和發(fā)酵使總酚質(zhì)量濃度分別增加131.25 mg/L和161.63 mg/L，達(dá)到了顯著水平（＜0.05），其他菌株發(fā)酵液的總酚含量沒有顯著變化。多酚含量增加的原因可能是乳酸菌可生物轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞內(nèi)生物活性物質(zhì)，轉(zhuǎn)化為其代謝產(chǎn)物并產(chǎn)生新的酚類化合物。值得注意的是在發(fā)酵前期（0～12 h），、和發(fā)酵液總酚含量顯著升高，之后（12～24 h）顯著下降，中后期（24～48 h）輕微上升或保持穩(wěn)定，可能的原因是發(fā)酵過程中酚類化合物與蛋白質(zhì)等組分作用，或吸附或沉淀或被氧化，導(dǎo)致這些化合物部分損失。與總酚含量變化不同的是，、、發(fā)酵使總黃酮質(zhì)量濃度顯著下降（由6 440 mg/L降至5 841～5 922 mg/L），而、和發(fā)酵液的總黃酮含量沒有顯著變化。黃酮類物質(zhì)的下降是因為多酚氧化酶將大分子酚類氧化降解。

對單體酚類進(jìn)行鑒定，確定出6 種酚酸和5 種類黃酮（表3）。沒食子酸和綠原酸是山楂汁中的主要酚酸，分別占42.7%和38.2%，山楂汁中的主要黃酮類物質(zhì)是蘆丁和表兒茶素，質(zhì)量濃度達(dá)353.50 mg/L。乳酸菌發(fā)酵顯著影響了酚類組成和含量。相比于未發(fā)酵山楂汁，6 種乳酸菌發(fā)酵均造成山楂汁中沒食子酸、香草酸、咖啡酸、綠原酸和表兒茶素含量的顯著下降（其中和發(fā)酵液的這幾種物質(zhì)含量下降幅度最大），而兒茶素質(zhì)量濃度從無增加到27.68～31.50 mg/L。本研究發(fā)酵引起咖啡酸的減少是因為乳酸菌將咖啡酸轉(zhuǎn)化為二氫咖啡酸，乳酸菌（尤其是植物乳桿菌）代謝咖啡酸的能力已被多次報道。發(fā)酵過程中乳酸菌代謝植物基質(zhì)中酚類的能力已被多次證明，葡萄渣中的沒食子酸可被、完全代謝，并于發(fā)酵后檢測不到。Zhao Danyue等也發(fā)現(xiàn)和可將綠茶和黑茶葉提取物中的沒食子酸轉(zhuǎn)化為鄰苯三酚。乳酸菌的代謝作用可能使部分表兒茶素轉(zhuǎn)化為兒茶素。本研究發(fā)現(xiàn)6 種乳酸菌對某些酚類的作用明顯不同：、發(fā)酵使原兒茶酸含量顯著上升，而其他4 種乳酸菌發(fā)酵使其顯著減少；對于對香豆酸，、發(fā)酵使之顯著增加，、和則使之顯著減少；對于根皮苷，僅發(fā)酵使之顯著增加，其他菌株無顯著作用。此外，乳酸菌對糖、有機(jī)酸和氨基酸的代謝及能量代謝都可能影響酚類的脫羧和還原。

表3 6 種乳酸菌發(fā)酵前后山楂汁的單體酚組成和含量Table 3 Phenolic profiles in hawthorn juice before and after 48 h LAB fermentation

如圖2C、D 所示，經(jīng)、和發(fā)酵后ABTS陽離子自由基清除率顯著升高（增加了10.2%～11.2%），其他3 種乳酸菌發(fā)酵未對ABTS陽離子自由基清除活性產(chǎn)生影響。、、和發(fā)酵使FRAP顯著升高（由23.38 mmol/L增加至25.20～25.94 mmol/L）。已有報道表明乳酸菌使抗氧化活性增強(qiáng)與酚類有相關(guān)關(guān)系。如表4所示，本研究ABTS陽離子自由基清除活性和FRAP與對香豆酸、綠原酸、槲皮素和表兒茶素含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01）。樣品稀釋200 倍的ABTS陽離子自由基清除率在45%左右，未發(fā)酵和發(fā)酵山楂原液均具有極高的抗氧化性。

表4 酚類和抗氧化活性之間的Pearson相關(guān)系數(shù)Table 4 Pearson’s correlation coefficients between phenolic compounds and antioxidant activity

圖2 發(fā)酵過程中山楂汁的植物化學(xué)成分和抗氧化能力Fig.2 Phytochemical composition and antioxidant activity of hawthorn juice during LAB fermentation

2.4 色值分析

食品的顏色是吸引消費者的重要屬性。由表5可知，發(fā)酵與未發(fā)酵山楂汁的值（65～74）和值（52～58）為較大的正值，值為較小的正值（13～16），說明它們均呈現(xiàn)澄清透亮的狀態(tài)，總體呈橙紅色。相較于發(fā)酵前，不同乳酸菌發(fā)酵后和均降低而均增加，與未發(fā)酵山楂汁相比總色差較大，肉眼可以辨別。益生菌發(fā)酵果蔬汁的色值可能會受到酚類組成和含量的影響。相關(guān)性分析表明（表6）總酚與呈正相關(guān)，總黃酮與和呈顯著正相關(guān)，與呈顯著負(fù)相關(guān)。

表5 發(fā)酵與未發(fā)酵山楂汁的顏色特性Table 5 Color parameters of unfermented and fermented hawthorn juice

表6 總酚、總黃酮和顏色參數(shù)之間的Pearson相關(guān)系數(shù)Table 6 Pearson’s correlation coefficients between total phenol contents,total flavonoid contents and color parameters

2.5 揮發(fā)性成分分析

香氣是食品獲得消費者青睞的重要參考指標(biāo)。由表7、8可知，本研究在未發(fā)酵和6 種乳酸菌發(fā)酵山楂汁中共檢測到88 種揮發(fā)性成分，其中醇類29 種、酮類16 種、酯類20 種、醛類10 種、酸類5 種、其他8 種。山楂汁經(jīng)不同乳酸菌發(fā)酵后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類增加了20 種以上，且總量增加了75%～325%，新生成的揮發(fā)性物質(zhì)以醇類為主。醇類和酮類是山楂汁中主要的揮發(fā)性成分，共占揮發(fā)性物質(zhì)總量的61.7%～74.5%。OAV大于1的化合物有助于增加山楂汁的香氣，被稱作特征香氣成分。在本研究中，檢出的主要醇類為2-乙基-1-己醇，高質(zhì)量濃度的2-乙基-1-己醇（1 854.99～2 234.88 μg/L）賦予山楂汁清新花香味，新增的醇類有17 種，主要有經(jīng)發(fā)酵生成的芳樟醇、-松油醇、香葉醇、1-壬醇，它們的OAV均大于1，是發(fā)酵山楂汁的醇類特征香氣成分，賦予發(fā)酵山楂汁丁香、玫瑰花香和木香。在乳酸菌進(jìn)行乳糖、氨基酸、甲基酮等的物質(zhì)代謝時，可由相應(yīng)的醛通過脫氫酶還原形成某些醇。酮類含量僅次于醇類，對照組質(zhì)量濃度最低（779.82 μg/L），經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后增加到對照組的3～11 倍，酮類是氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，而乳酸菌的加入促進(jìn)了氧化反應(yīng)的發(fā)生。其中相對含量較高的是2-庚酮（4.02%～14.54%）、甲基庚烯酮（6.15%～11.18%）和2-十一酮（4.85%～22.36%）。發(fā)酵與未發(fā)酵山楂汁均含較多的甲基庚烯酮（OAV：11～15），其具有類似檸檬草的香氣，是山楂特征香氣物質(zhì)。2-壬酮（OAV：2.1～16.7）、2-庚酮（OAV：550～2 030）和2,3-丁二酮（OAV：3.4～21.2）僅出現(xiàn)在各發(fā)酵山楂汁中，是發(fā)酵特征香氣物質(zhì)，這些酮類化合物可使山楂汁具有優(yōu)異持久的草木香和果香。

表7 發(fā)酵與未發(fā)酵山楂汁揮發(fā)性物質(zhì)組成和含量Table 7 Composition and content of volatile compounds in unfermented and fermented hawthorn juice

續(xù)表7

共檢出20 種酯類，其中17 種為發(fā)酵產(chǎn)生，雖然相對含量不高，但閾值較低，酯類仍對山楂汁的香氣有很大貢獻(xiàn)。乳酸菌發(fā)酵主要新生成了少量的丁酸甲酯（OAV：0.4～0.5）、甲酸己酯、己酸甲酯（OAV：3.6～8.5）、2-己烯酸甲酯，發(fā)酵液酯類含量最高，主要是發(fā)酵生成的大量乙酸辛酯（460.28 μg/L）和乙酸香葉酯（292.52 μg/L），OAV分別為1.53和2.93，它們具有玫瑰和薰衣草香，對整體香氣貢獻(xiàn)較大，酯香味明顯。不同乳酸菌發(fā)酵液中均發(fā)現(xiàn)了對照組沒有的酯類物質(zhì)，這可能是因為在乳酸菌復(fù)雜酶系的催化作用下由醇類和有機(jī)酸等生成了某些酯類。經(jīng)不同乳酸菌發(fā)酵后醛類物質(zhì)的相對含量均顯著下降，由15.96%降低至0.49%～7.07%，醛類可能被還原成醇或氧化為酸。其中己醛和庚醛閾值小于5 μg/L，OAV遠(yuǎn)大于1，為發(fā)酵和未發(fā)酵山楂汁貢獻(xiàn)青草、綠葉和油脂似的香氣。之前的研究也表明，山楂果泥香氣的主要貢獻(xiàn)者有己酸甲酯、2-甲基丁酸甲酯、己醛、庚醛、異丁酸己酯和()-3-己烯乙酸酯等。

相較于未發(fā)酵山楂汁，幾種乳酸菌發(fā)酵（除外）使酸類物質(zhì)總量增加了約12～50 倍，增加的主要為乙酸，由乳酸菌經(jīng)丙酮酸-甲酸裂解途徑產(chǎn)生，但其閾值很高（22 000 μg/L），對山楂汁整體香氣貢獻(xiàn)不大。值得注意的還有，除對照和外，其他發(fā)酵樣品含有低含量的二甲基硫醚（28.5～34.4 μg/L），但其OAV大于1，具有難聞的洋蔥和硫的氣味，對整體香氣有一定不利影響。另外經(jīng)乳酸菌發(fā)酵生成了大量的4-乙基苯酚（522.41～1 155.20 μg/L），OAV在1.2～21之間，該物質(zhì)是食品用香料，具有強(qiáng)烈的煙熏味。另外，、、和菌株發(fā)酵合成了較多的丁香酚（227.60～762.50 μg/L），其閾值為90 μg/L，OAV在2.5～8.5，賦予發(fā)酵山楂汁強(qiáng)烈的丁香和木香。

圖3為揮發(fā)性物質(zhì)的熱圖和聚類分析，結(jié)果顯示發(fā)酵液單獨為一類，香氣組成較為獨特，與其他發(fā)酵液具有明顯差別。和發(fā)酵液的香氣組成較為相似，歸為同一類。和發(fā)酵液與未發(fā)酵山楂汁的香氣組成相似，為同一類。

圖3 發(fā)酵與未發(fā)酵山楂汁揮發(fā)性成分熱圖和聚類分析Fig.3 Heatmap and cluster analysis of volatile components in unfermented and fermented hawthorn juice with different LAB strains

表8 發(fā)酵與未發(fā)酵山楂汁揮發(fā)性物質(zhì)的香氣閾值和OAVTable 8 Aroma thresholds and odor activity values of volatile compounds in unfermented and fermented hawthorn juice

續(xù)表8

2.6 感官評價

由表9可知，顏色方面，未發(fā)酵的山楂汁呈淺紅色且偏黃，而發(fā)酵山楂汁更加紅潤，更加吸引人，故得分更高，這點與色值參數(shù)一致；酸甜度方面，得分最高的是對照組（7.85±0.81），發(fā)酵樣品得分偏低（5.70～6.70），主要由于乳酸菌發(fā)酵使pH值下降，酸味明顯；香氣方面，、發(fā)酵樣品得分較高，具有明顯的山楂清香和發(fā)酵味；味道方面，未發(fā)酵樣品得分最低，味道略寡淡，發(fā)酵樣品得分更高，主要是山楂酸甜味更強(qiáng)烈；體態(tài)方面，得分均在6～7 分，無明顯差別，所有樣品質(zhì)地均勻，無沉淀；風(fēng)味方面，發(fā)酵樣品的酯香味明顯，發(fā)酵風(fēng)味醇厚，得分高于對照；整體接受性是指整體印象和可接受性，各發(fā)酵樣品得分均高于未發(fā)酵樣品，更吸引人。發(fā)酵的山楂汁香氣（7.25±0.91）、味道（6.85±0.81）、風(fēng)味（7.10±0.55）和整體接受性（6.95±1.43）得分最高，顏色（6.10±0.79）、酸甜度（6.05±1.10）和體態(tài)（6.40±1.14）得分屬中上等，總體上發(fā)酵的山楂汁感官品質(zhì)最好，和其他樣品區(qū)分度明顯?？傮w來說，乳酸菌發(fā)酵在一定程度上改善了山楂汁的香氣、味道和風(fēng)味，使得香氣更濃郁并具有獨特的發(fā)酵風(fēng)味，更受人們喜愛。

表9 不同發(fā)酵山楂汁的感官評分Table 9 Sensory evaluation of different fermented hawthorn juices

3 結(jié)論

選用的6 種商業(yè)乳酸菌菌株在調(diào)酸后山楂汁中均表現(xiàn)出良好的生長能力，菌體濃度在發(fā)酵后期仍高于8.5（lg（CFU/mL））并保持穩(wěn)定，可以發(fā)揮健康益處。乳酸菌發(fā)酵不僅產(chǎn)酸多，還產(chǎn)生豐富的揮發(fā)性物質(zhì)。經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后生成了17 種新的醇、17 種新的酯、4 種新的醛和8 種新的酮，這表明益生菌發(fā)酵使山楂汁的香氣更復(fù)雜。感官評價結(jié)果表明，乳酸菌發(fā)酵改善了山楂汁的香氣、味道和風(fēng)味，的總體感官品質(zhì)最好，次之。發(fā)酵山楂汁具有較高的抗氧化性、豐富的香氣物質(zhì)和良好的感官品質(zhì)，是最適宜發(fā)酵山楂汁的乳酸菌，具有更大的研究和開發(fā)價值。下一步研究將側(cè)重于分析發(fā)酵山楂汁的儲藏和消化特性，以提供更多發(fā)酵山楂汁有益于人體健康的科學(xué)依據(jù)。