circATRNL1與circPDE4B在前列腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義

張春雷 楊琦 康亞芬 徐東波 孟冬冬 常德輝

前列腺癌是歐美國家男性惡性腫瘤中發(fā)病率最高的腫瘤[1]，即便是在亞洲地區(qū)，其發(fā)病率也逐年上升[2]，因此，探索其發(fā)病機(jī)制及潛在的腫瘤分子標(biāo)志物顯得越來越重要。近年來，環(huán)狀RNA(circular RNAs, circRNAs)在疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用逐漸被發(fā)掘，尤其是在腫瘤疾病的研究中，范圍幾乎涵蓋了各個(gè)系統(tǒng)的惡性腫瘤。為了進(jìn)一步探索circRNAs在前列腺癌疾病進(jìn)程中發(fā)揮的作用，我們通過從前列腺癌患者癌及癌旁組織的高通量測序結(jié)果中篩選出的circRNAs來探索其在前列腺癌疾病中的研究價(jià)值。

材料與方法

一、組織測序方法

對(duì)選取的34例前列腺癌患者的癌及癌旁組織樣本進(jìn)行高通量測序，采用edgeR統(tǒng)計(jì)學(xué)方法確定兩組樣本之間差異表達(dá)的circRNAs，差異表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)為錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate, FDR)<0.05、P<0.05、|log2|>1?；颊咂骄挲g(68.9±6.7)歲，PSA (28.8±37.6)ng/ml，腫瘤分期

二、組織RNA提取

選取10例癌及癌旁組織樣本進(jìn)行RNA提取，將組織在液氮中磨碎，每50～100 mg組織加入1 ml Trizol(Trizol，Life Technologies，美國)，勻漿處理后采用Trizol法常規(guī)提取RNA。

三、RNA反轉(zhuǎn)錄

按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript?RT Master Mix試劑，Takara，中國)中推薦的劑量配制反應(yīng)體系，放至PCR儀，按照37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

四、RT-qPCR

按照RT-qPCR試劑盒(SYBR?Premix Ex TaqTM試劑，Takara，中國)中推薦的劑量配制反應(yīng)體系并放入儀器中，采用兩步法RT-qPCR的默認(rèn)設(shè)定程序進(jìn)行檢測，每個(gè)樣品重復(fù)檢測3次。表達(dá)量用ΔCt值表示，該值越高說明其表達(dá)量越低。引物如下：circATRNL1(F：AGCATTGCCAGGGAACAA；R：GGATAGCCTTCAATGAGCCA)；circPDE4B(F：CAGAGTGAAAGGGCAAGGAC；R：CATCACCGTCATCACACTCC)；Gapdh(F：AAGA-AGGTGGTGAAGCAGG；R：GTCAAAGGTGGAGGAGTGG)。

五、數(shù)據(jù)庫應(yīng)用

使用KOBAS 3.0在線分析軟件對(duì)親本基因進(jìn)行基因本體(Gene Ontology, GO)及京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)分析，提取癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)數(shù)據(jù)庫中前列腺癌標(biāo)本及臨床信息進(jìn)行親本基因預(yù)后分析，使用circbank網(wǎng)站進(jìn)行circRNA與miRNA結(jié)合預(yù)測，并應(yīng)用mirPath對(duì)這些miRNAs進(jìn)行GO及KEGG分析，通過circinteractome網(wǎng)站預(yù)測circRNAs是否與蛋白質(zhì)存在結(jié)合位點(diǎn)，利用ORF Finder網(wǎng)站預(yù)測是否擁有開放閱讀框(open reading frame, ORF)及IRESite網(wǎng)站預(yù)測是否具有內(nèi)在的核糖體進(jìn)入結(jié)合位點(diǎn)(internal ribosome entry site, IRES)。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，圖片采用GraphPad Prism 5進(jìn)行繪制，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、circATRNL1與circPDE4B的選擇及驗(yàn)證

通過對(duì)34例前列腺癌患者的癌及癌旁組織樣本進(jìn)行circRNAs的高通量測序，選取相對(duì)于癌旁組織在癌組織中顯著下調(diào)且排名前20的circRNAs。選取10例病理確診為前列腺癌患者的癌及癌旁組織進(jìn)行RNA提取，對(duì)反向引物擴(kuò)增片段進(jìn)行Sanger測序以及利用RT-qPCR在癌及癌旁組織中驗(yàn)證circRNAs的表達(dá)量。篩選出了既滿足Sanger測序結(jié)果正確、又滿足在癌組織中顯著下調(diào)的2個(gè)circRNAs：circATRNL1(hsa_circ_0020094)與circPDE4B(hsa_circ_0008433)作為研究對(duì)象，兩者均收錄在circBase數(shù)據(jù)庫中，基因序列、Sanger測序結(jié)果見圖1。circATRNL1及circPDE4B在癌組織中的表達(dá)量顯著低于癌旁組織(P<0.05)，見圖2，證明測序結(jié)果的可靠性。

A：circRNAs序列；B：反向引物擴(kuò)增片段Sanger測序

A：circATRNL1在癌及癌旁組織中的表達(dá)量；B：circPDE4B在癌及癌旁組織中的表達(dá)量

二、不同Gleason評(píng)分和病理分期癌組織中circATRNL1與circPDE4B的表達(dá)差異

為了探索circATRNL1與circPDE4B在癌組織中的表達(dá)量與前列腺癌的惡性程度是否有關(guān)，按照Gleason評(píng)分分為6、7及≥8分3組和病理分期

A：測序結(jié)果中circATRNL1在不同Gleason評(píng)分分組癌組織中的表達(dá)量；B：測序結(jié)果中circPDE4B在不同Gleason評(píng)分分組癌組織中的表達(dá)量；C：測序結(jié)果中circATRNL1在不同病理分期分組癌組織中的表達(dá)量；D：測序結(jié)果中circPDE4B在不同病理分期分組癌組織中的表達(dá)量

三、不同Gleason評(píng)分和病理分期癌旁組織與癌組織中表達(dá)量的比值差異

為了排除不同組織間表達(dá)差異的影響，同時(shí)探索circATRNL1、circPDE4B各自在癌旁組織和癌組織中表達(dá)量的差異是否與疾病的惡性程度有關(guān)，按照Gleason評(píng)分、病理分期分別對(duì)兩種circRNAs各自在癌旁組織及癌組織中表達(dá)量的比值進(jìn)行分析，結(jié)果表明，在病理分期較高的組別中，癌旁組織與癌組織中circPDE4B表達(dá)量的比值較高(P<0.05)，余差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

A：測序結(jié)果中circATRNL1在不同Gleason評(píng)分分組中癌旁組織與癌組織中表達(dá)量的比值；B：測序結(jié)果中circPDE4B在不同Gleason評(píng)分分組中癌旁組織與癌組織中表達(dá)量的比值；C：測序結(jié)果中circATRNL1在不同病理分期分組中癌旁組織與癌組織中表達(dá)量的比值；D：測序結(jié)果中circPDE4B在不同病理分期分組中癌旁組織與癌組織中表達(dá)量的比值

四、circATRNL1、circPDE4B親本基因的功能分析及預(yù)后分析

為探索circATRNL1與circPDE4B對(duì)前列腺癌疾病進(jìn)展的影響，進(jìn)一步對(duì)二者親本基因的功能、在前列腺癌及對(duì)照組織中表達(dá)的差異以及預(yù)后效能進(jìn)行了分析。GO分析表明，ATRNL1參與調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移等細(xì)胞功能，PDE4B參與cAMP分解代謝過程、細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng)等，KEGG分析表明，PDE4B參與cAMP、代謝等信號(hào)通路，ATRNL1無相關(guān)KEGG信號(hào)通路分析，詳見表1。TCGA數(shù)據(jù)庫結(jié)果分析表明，雖然在癌組織中ATRNL1與PDE4B均表現(xiàn)出了與對(duì)應(yīng)circRNAs相同表達(dá)下降的趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，在預(yù)后分析中，ATRNL1的低表達(dá)預(yù)示著較差的總生存期(overall survival, OS)(P<0.05),但其表達(dá)與無疾病進(jìn)展生存期(disease free survival, DFS)無關(guān)(P>0.05)，結(jié)果顯示PDE4B的表達(dá)與前列腺癌患者的OS及DFS無關(guān)(P>0.05)，見圖5。

表1 親本基因ATRNL1及PDE4B的GO分析及KEGG分析

A：ATRNL1在前列腺癌腫瘤組織(T)及正常組織(N)中表達(dá)量的對(duì)比；B、C：ATRNL1對(duì)前列腺癌患者DFS及OS的預(yù)測分析；D：PDE4B在前列腺癌腫瘤組織(T)及正常組織(N)中表達(dá)量的對(duì)比；E、F：PDE4B對(duì)前列腺癌患者DFS及OS的預(yù)測分析

五、circATRNL1、circPDE4B可能參與的作用機(jī)制

為探索circATRNL1與circPDE4B可能參與的作用機(jī)制，從與miRNAs結(jié)合預(yù)測、與蛋白質(zhì)結(jié)合預(yù)測及轉(zhuǎn)錄翻譯蛋白潛能預(yù)測等3個(gè)方面進(jìn)行分析。從circbank數(shù)據(jù)庫得知，與circATRNL1存在結(jié)合位點(diǎn)的miRNAs共92個(gè)，與circPDE4B存在結(jié)合位點(diǎn)的miRNAs共35個(gè)，表2中每組列舉了預(yù)測分值較高且在疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用的10個(gè)miRNAs。通過mirPath對(duì)每組靶miRNAs進(jìn)行GO分析及KEGG分析，結(jié)果表明這些miRNAs參與許多重要生物細(xì)胞功能及信號(hào)通路，在GO分析中，兩者共有的比較重要的為細(xì)胞周期、凋亡過程、胰島素受體信號(hào)通路、細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)等，其中circATRNL1特有的為AR信號(hào)通路、Ras蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，circPDE4B特有的為MAPPK活性激活等。在KEGG分析中，兩者共有比較重要的為細(xì)胞周期、p53、FoxO、Hippo信號(hào)通路等，并包括許多癌癥相關(guān)信號(hào)通路，包括前列腺癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、腦膠質(zhì)瘤等，其中circPDE4B比較特殊的為脂肪酸代謝及合成等。通過circinteractome網(wǎng)站預(yù)測circATRNL1與AFU1、HuR、TDP43存在結(jié)合位點(diǎn)，未預(yù)測到circPDE4B與蛋白質(zhì)存在結(jié)合位點(diǎn)。ORF Finder網(wǎng)站及IRESite網(wǎng)站預(yù)測circATRNL1與circPDE4B存在的ORF和IRES，結(jié)果表明circATRNL1存在12個(gè)ORF，52個(gè)IRES，circPDE4B存在2個(gè)ORF和53個(gè)IRES。

表2 circbank網(wǎng)站預(yù)測circRNAs與miRNAs結(jié)合情況

討 論

近年的研究表明circRNAs在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。比如下調(diào)的circRNA-Foxo3可以促進(jìn)前列腺癌的進(jìn)展，并促使對(duì)多西他賽化學(xué)耐藥性的形成[3]，circRNA-UCK2通過作為miRNA-767-5p海綿增加TET1的表達(dá)，進(jìn)而抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力[4]，外泌體中circ_0044516促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，并可能作為前列腺癌潛在的生物分子標(biāo)志物[5]。為了進(jìn)一步探索circRNAs在前列腺癌中所發(fā)揮的作用，以及作為腫瘤標(biāo)志物的潛在價(jià)值，我們對(duì)34例前列腺癌患者的癌及癌旁組織樣本進(jìn)行circRNAs的高通量測序，在腫瘤組織中，相比較高表達(dá)的circRNA，低表達(dá)的circRNA往往在疾病的發(fā)病及進(jìn)展中發(fā)揮更加重要的作用[6]，因此我們選擇測序結(jié)果中在前列腺癌組織中低表達(dá)的前20個(gè)circRNAs進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證及Sanger測序，篩選出了circATRNL1與circPDE4B作為研究對(duì)象。一項(xiàng)關(guān)于circRNA對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)放療效果影響的研究表明，上調(diào)的circATRNL1通過抑制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯來增強(qiáng)OSCC對(duì)放療的敏感性，放療后其表達(dá)水平降低[7]。進(jìn)一步研究表明，circATRNL1可以充當(dāng)miR-23a-3p的海綿，從而促進(jìn)抑癌基因PTEN的表達(dá)，增強(qiáng)OSCC對(duì)放療的敏感性[7]。另一項(xiàng)研究表明，在視網(wǎng)膜病變的模型中，下調(diào)的circPDE4B促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)和血管內(nèi)皮生長因子A上調(diào)，其作用機(jī)制研究證明了circPDE4B通過靶向作用于miR-181c從而促進(jìn)HIF-1α降解來抑制視網(wǎng)膜病理性血管生成[8]，HIF-1α及血管內(nèi)皮生長因子A均是腫瘤疾病進(jìn)展的關(guān)鍵作用因子，因此circATRNL1與circPDE4B是否也通過調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)蛋白的表達(dá)來調(diào)控前列腺癌疾病的進(jìn)展值得深思。

為了探索circATRNL1與circPDE4B在癌組織中的表達(dá)含量與前列腺癌的惡性程度是否有關(guān)，按照Gleason評(píng)分、病理分期分別對(duì)測序結(jié)果中癌組織的circATRNL1與circPDE4B表達(dá)量進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，Gleason評(píng)分或者病理分期越高，癌組織中circATRNL1與circPDE4B的表達(dá)量越低，說明兩種circRNAs的低表達(dá)與前列腺癌的惡性程度有關(guān)。為了排除不同組織間表達(dá)差異的影響，同時(shí)探索circATRNL1、circPDE4B各自在癌旁組織和癌組織中表達(dá)量的差異是否與疾病的惡性程度有關(guān)，按照Gleason評(píng)分、病理分期分別對(duì)兩種circRNAs各自在癌旁組織及癌組織中表達(dá)量的比值進(jìn)行分析，結(jié)果表明，circPDE4B在病理分期較高的組別中，癌旁組織與癌組織中表達(dá)量的比值顯著升高。以上結(jié)果預(yù)示著低表達(dá)的circATRNL1與circPDE4B可能與前列腺癌疾病進(jìn)展及惡性程度有關(guān)。

circRNAs的功能通常與宿主基因存在一定的相關(guān)性，我們進(jìn)一步對(duì)circATRNL1與circPDE4B親本基因的功能、在前列腺癌組織及癌旁組織中表達(dá)差異以及預(yù)后效能進(jìn)行了分析。ATRNL1與PDE4B參與多種重要細(xì)胞生物功能，包括參與代謝通路、對(duì)藥物的反應(yīng)等，并且低表達(dá)的ATRNL1預(yù)示著前列腺癌患者的不良預(yù)后，而有相關(guān)報(bào)道表明PDE4B下調(diào)激活蛋白激酶A，進(jìn)而促進(jìn)前列腺癌的進(jìn)展[9]。因此，這兩種circRNAs是否通過調(diào)節(jié)親本基因的表達(dá)來發(fā)揮這些作用進(jìn)而促進(jìn)前列腺癌的進(jìn)展也是值得進(jìn)一步探索的。

當(dāng)然，circRNAs的表達(dá)與功能也并非一定與其線性轉(zhuǎn)錄本相似，甚至只有少數(shù)的circRNAs差異表達(dá)變化是與其線性轉(zhuǎn)錄本同步的[6，10]，因此，我們針對(duì)circRNAs本身進(jìn)行了機(jī)制探索。目前，circRNAs在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制主要集中在circRNA-miRNA-mRNA，下調(diào)的circRNAs可能通過釋放更多的miRNA發(fā)揮抑制或促腫瘤作用。為了探索這種關(guān)系，我們利用circbank網(wǎng)站預(yù)測與circATRNL1和circPDE4B存在結(jié)合位點(diǎn)的miRNAs情況，結(jié)果表明多種miRNAs分別與兩種circRNAs存在結(jié)合位點(diǎn)，其中包括與前列腺癌疾病進(jìn)展密切相關(guān)的miRNAs。如Zhang等[11]發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA FENDRR通過競爭性結(jié)合miR-18a-5p可降低前列腺癌的惡性程度，Maeno等[12]發(fā)現(xiàn)在雄激素剝奪的條件下，miR-582-5p的上調(diào)可調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞的增殖。兩種下調(diào)的circRNAs是否通過釋放這些miRNAs促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展有待進(jìn)一步探索。同時(shí)我們對(duì)各自的靶miRNAs進(jìn)行了GO分析及KEGG分析，結(jié)果顯示這些靶miRNAs參與多種腫瘤進(jìn)展相關(guān)的細(xì)胞功能及信號(hào)通路，包括細(xì)胞周期、凋亡、胰島素受體、p53、FoxO、Hippo信號(hào)通路等等，其中AR信號(hào)通路在前列腺癌疾病進(jìn)展中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，AR的多種突變體參與去勢抵抗性前列腺癌進(jìn)程[13]。另外，我們還發(fā)現(xiàn)circPDE4B參與脂肪酸代謝信號(hào)通路，而脂肪酸代謝是影響前列腺癌治療的關(guān)鍵因子[14-15]。

除了作為miRNAs海綿，circRNAs仍然具有翻譯蛋白、影響基因的剪接轉(zhuǎn)錄、與蛋白質(zhì)結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能等作用機(jī)制，我們對(duì)此也進(jìn)行了初步探索。在預(yù)測與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，僅發(fā)現(xiàn)circATRNL1與RNA結(jié)合蛋白存在結(jié)合位點(diǎn)，其中HuR與circRNAs關(guān)系最為密切。研究表明circPABPN1與HuR的相互作用可降低其親本基因PABPN1轉(zhuǎn)錄本的翻譯效率[16], circAGO2通過作用于HuR,激活被HuR抑制的AGO2-miRNA復(fù)合物的功能并促進(jìn)前列腺癌等腫瘤疾病的進(jìn)展[17]。擁有ORF及內(nèi)IRES是預(yù)測RNA能否翻譯蛋白的重要因素，在分析過程中我們發(fā)現(xiàn)兩者均具有ORF及大量的IRES，因此是否通過翻譯蛋白發(fā)揮作用也是值得深入研究的。

本研究根據(jù)癌組織中circATRNL1和circPDE4B表達(dá)情況預(yù)估其與前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)可能參與的作用機(jī)制進(jìn)行了分析，其確切作用及分子調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證明。circRNAs具有高度的穩(wěn)定性及組織表達(dá)特異性等特征，是作為腫瘤分子標(biāo)志物的良好選擇，circATRNL1與circPDE4B有望作為前列腺癌的診斷或預(yù)后指標(biāo)，但仍需更多血液樣本的檢測，其能否作為治療的靶點(diǎn)也需進(jìn)一步探索。