柔肝化纖顆粒抑制肝纖維化大鼠脂質過氧化物生成及TGF-β1、Numb 表達的影響

呂艷杭，吳姍姍，王振常*，溫智稀，段桂姣，符燕青，蘇曉文，農(nóng)小欣

（1.福建中醫(yī)藥大學附屬龍巖市中醫(yī)院，福建 龍巖 364200；2.廣西中醫(yī)藥大學研究生學院，南寧 530222；3.廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院脾胃肝病科，南寧 530201）

肝纖維化是慢性肝病的共同病理階段。適當?shù)闹委煷胧┛赡孓D肝纖維化或早期肝硬化的病理狀態(tài)，控制肝纖維化的發(fā)展，對于肝硬化甚至肝癌的防治起著至關重要的作用[1-3]。前期研究[4-6]證實柔肝化纖顆粒能從多途徑、多方位、多靶點抗肝纖維化作，具有健脾補腎柔肝、兼顧解毒活血、化痰軟堅散結功效，具有抗肝纖維化作用，但該復方抗肝纖維化效果及機制尚不清晰。本研究采用經(jīng)典的 CCl4復合因素建立肝纖維化大鼠模型為研究對象，探討柔肝化纖顆粒預防大鼠肝纖維化作用機制，以期為中藥新藥的臨床應用提供實驗依據(jù)。

柔肝化纖顆粒由黃芪、牡蠣、黃精、枸杞、薏苡仁、橘紅、澤蘭、雞內金、鱉甲、虎杖、牡丹皮、黑棗組成，具有抗氧化、抗炎及抗纖維化等多種藥理和生物學作用[7-9]。黃芪健脾益氣、利尿排毒，佐黃精加強補宜氣血、健脾化濕功效；枸杞子滋養(yǎng)肝腎、益精明目，佐黑棗滋養(yǎng)陰血，二者共奏滋養(yǎng)陰血，補腎柔肝之效，肝體得養(yǎng)、陰血得充，恢復肝臟得功能，佐雞內金加強益精之效；牡蠣軟堅散結、平肝潛陽，合鱉甲加強軟堅散結、活血化瘀、破血消癥之效，橘紅燥濕化痰、通利三焦；澤蘭芳香悅脾以扶氣、行水腫，疏利悅肝以行血，具有活血化瘀而不傷正氣，行血消腫而溫中功效，橘紅、澤蘭、鱉甲、生牡蠣四者合用共奏“活血祛瘀、化痰散結”，主要通過“活血化痰”調整氣血關系、達到“血和則經(jīng)脈流行”；加虎杖化痰散瘀，清熱解毒以除濕熱瘀邪。本實驗通過觀察柔肝化纖顆粒對肝纖維化大鼠肝組織中TGF-β1及Numb 表達的影響，進一步闡明柔肝化纖顆粒預防大鼠肝纖維化的作用機制，為傳統(tǒng)中藥新藥的開發(fā)與應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗設計 采用隨機抽取動物對照實驗。

1.2 時間與實驗地點 本實驗于2018 年2 月－2019年10 月在廣西中醫(yī)藥大學實驗動物中心、廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院動物實驗中心及醫(yī)學分子生物學實驗室、中醫(yī)內科實驗室完成。

1.3 材料

1.3.1 實驗動物 成齡SPF 級Wistar 大鼠72 只，體質量在120～160 g，均購于廣西醫(yī)科大學實驗動物研究所[動物實驗合格證：SCXK（桂）2018-0001]。

1.3.2 藥物 柔肝化纖顆粒方藥組成：生黃芪45 g，黃精 20 g，生牡蠣 30 g，鱉甲 30 g，薏苡仁 45 g，枸杞子 20 g，橘紅 12 g，澤蘭 30 g，雞內金 15 g，虎杖 20 g，黑棗 15 g。藥物免煎顆粒劑由廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科提供，嚴格按照說明書上的克數(shù)進行換算。秋水仙堿（北京盛世康普化工技術研究所，生產(chǎn)批號：170821）。

1.3.3 主要儀器設備與試劑 儀器設備與試劑均由廣西中醫(yī)藥大學及廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院提供。5417R 低溫高速離心機，德國Eppendoff公司；IX71-22FL/PH 顯微鏡，日本OLYMPUS 公司；SHANDON 石蠟切片機，全自動生化分析儀（ES-480），南京頤蘭貝生物科技有限公司。ROS，南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號：20 160629；MDA 試劑盒，南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號：20 170810；4-HNE 試劑盒，南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號：32102；四氯化碳（CCl4）分析純，中國醫(yī)藥集團上海化學試劑公司；花生油，山東煙臺萊陽魯花濃香花生油有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組 采用成齡SPF 級Wistar 大鼠72 只，雌雄各半，適應飼養(yǎng)1 周，隨機分為6 組，取10 只大鼠作為正常對照組（不做任何處理，正常飼養(yǎng)），剩余62 只大鼠采用CCl4復合因素行肝纖維化造模，隨機抽取2 只證實肝纖維化造模成功，取造模成功后的60 只大鼠隨機分為肝纖維化模型組、秋水仙堿組、柔肝化纖顆粒低劑量組（2 mg/kg）、柔肝化纖顆粒中劑量組（4 mg/kg）、柔肝化纖顆粒高劑量組（8 mg/kg），每組12 只。

1.4.2 實驗處理 本實驗采用CCl4聯(lián)合植物油混懸液復合因素誘導[10]，進行肝纖維化造模，此法參照韓德五法進行改進，采用皮下注射40% CCl4（第1 次使用5 mL/kg 體質量，以后每隔3 天以每3 mL/kg 體質量，每周2 次，共8 周）皮下注射，聯(lián)合高脂低蛋白食物（以玉米面為飼料，實驗第1 周、第2 周加用0.5%膽固醇、20%豬油），為了防止肝纖維化自然修復對實驗結果造成的影響，除正常對照組外，其余各組仍每周腹腔注射1 次40% CCl4油劑，每次3 mL/kg 體質量；正常對照組正常飼養(yǎng)，同時采用同體積花生油皮下注射8 周后灌胃予同體積的生理鹽水，肝纖維化模型組造模成功8 周后予灌胃秋水仙堿，以0.01 mg/100 g 體質量給予，每周5 次，共8 周；柔肝化纖顆粒低劑量、中劑量、高劑量組造模8 周后分別灌胃柔肝化纖顆粒溶液（2、4、8 mg/kg），每周3 次，共8 周。

1.4.3 標本采集與處理 各組分別于用藥8 周后，禁食12 h，經(jīng)1%戊巴比妥麻醉，股靜脈采血后處死，開腹剖取肝臟，每只均取肝臟右葉相同部位的組織置入10%的甲醛，另一部分于-80℃液氮速凍中保存待檢。凍存的肝臟組織置于冰水浴中勻漿 10 min，制成 10%的組織勻漿，繼以 3 000 r/min，離心半徑為30 cm，離心 10～ 15 min，吸取上清液，測定ROS、MDA 及4-HNE 值。

1.5 實驗室指標及檢測方法

1.5.1 常規(guī)肝臟組織的病理學檢測 取肝臟組織，使用4%多聚甲醛固定，梯度經(jīng)久脫水，石蠟包埋，經(jīng)組織切片后進行HE 染色及Masson 染色，封片后使用顯微鏡拍照，分析肝臟病理及纖維化情況。

1.5.2 各組肝功能指標檢測 采用AU 5400 型全自動生化儀（美國Beckman Coulter 公司）檢測大鼠血清AST、ALT、ALB、TBIL。

1.5.3 ROS、MDA 及4-HNE 檢測 嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.5.4 qRCR 檢測 RNA 提取及逆轉錄PCR：將30 mg肝臟組織置于1 000 μL Trizol 裂解液（Solarbio，R1100）中，充分裂解混勻后，加入500 μL 氯仿，4℃，12 000 g 離心15 min 后400 μL 上層水相，加入400 μL異丙醇后，4℃，12 000 g 離心10 min 獲得RNA 沉淀，經(jīng)70%酒精洗滌后，晾干，使用無RNA 酶水進行溶解，使用超微量核酸檢測儀（Suizhen，F(xiàn)C-1100）進行RNA 濃度及純度檢測，后按照逆轉錄試劑盒（Monad，RN05004M）說明書進行逆轉錄操作，所得cDNA 置于-20℃保存待用。引物序列與產(chǎn)物長度，見表1。

表1 引物序列及產(chǎn)物長度

qPCR 反應體系為：SYBR Green Premix Taq（Monad，RN04006M）:5 uL，cDNA：1 uL，Primer Forward（10 uM）：0.3ul，Primer Reverse（10 uM）：0.3 uL，H2O：3.4 uL，反應程序：預處理95℃：30 s；PCR 循環(huán)（40 循環(huán)）：95 ℃：5 s，60 ℃：30 s，72 ℃：15 s；溶解曲線：標準溶解曲線程序。實驗儀器為ABI 7500 定量PCR 儀（ABI 7500）。經(jīng)實驗獲得的數(shù)據(jù)使用SPSS 軟件進行整理及分析，采用2-ΔΔCT法進行分析。

1.5.5 Western Blot 檢測 組織蛋白提取：取30 mg 組織塊置于離心管中，加入400 uL RIPA-PMSF 裂解液（Solarbio，R0010），勻漿后于4℃，12 000 rpm 離心5 min，取上清采用BCA 法測定蛋白含量。4×蛋白上樣buffer（Solarbio，P1016）100 ℃變性5～10 min。蛋白電泳：80 V 恒壓電泳約20 min，待樣品進入分離膠層后，換用100 V 恒壓電泳1～1.5 h；轉膜：200 mA恒流轉膜60～90 min。抗體孵育：用TBST（Solarbio，T1081）配制體積分數(shù)為8%的脫脂奶粉（Solarbio，D8340）作為封閉液，將膜放入封閉液中封閉3 h。按抗體說明書上的推薦比例使用封閉液將一抗[Anti-TGF-β1抗 體（Abcam，ab9628），Anti-Numb 抗 體（Abcam，ab84865）]；Anti-β-actin 抗 體（Abcam，ab8227）；抗進行稀釋，將膜放入稀釋后的一抗中4℃孵育12 h。一抗孵育完成后，使用TBST 洗膜3 次，每次15 min。將膜放入按1:3000 比例稀釋的二抗（goat anti-rabbit：Abcam，ab6721）中37 ℃ 孵育1 h，使用TBST（Solarbio，T1081）洗膜3 次，每次15 min 使用ECL 顯色劑（Solarbio，PE0010）對膜進行顯色，于凝膠成像儀（Tanon，5200）中進行曝光成像。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0 軟件處理實驗數(shù)據(jù)，均以均數(shù)±標準差（）表示，各組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 柔肝化纖顆?？擅黠@改善肝纖維化情況 經(jīng)HE染色及Masson 染色，與模型組相比，秋水仙堿、柔肝化纖顆粒干預后，大鼠肝纖維化程度均有不同程度降低，秋水仙堿組、柔肝化纖顆粒高劑量組顯著，見圖1。

圖1 肝組織石蠟切片HE 染色及Masson 染色觀察肝纖維程度

2.2 大鼠血清中肝功能指標變化比較 見表2。

表2 大鼠血清中肝功能指標變化比較（）

表2 大鼠血清中肝功能指標變化比較（）

注：與正常組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01；與模型組比較，△△P ＜0.01；與秋水仙堿組比較，▲▲P ＜0.01

2.3 各組大鼠肝組織中ROS、MDA、4-HNE 指標變化比較 見表3。

表3 各組大鼠肝組織中ROS、MDA、4-HNE 指標變化比較（）

表3 各組大鼠肝組織中ROS、MDA、4-HNE 指標變化比較（）

注：與正常組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01；與模型組比較，△△P ＜0.01；與秋水仙堿組比較，▲▲P ＜0.01

2.4 各組大鼠肝組織 TGF-β1及Numb 含量指標變化比較 見表4。

表4 各組大鼠肝組織 TGF-β1 及Numb 含量指標變化比較（，n =10） %

表4 各組大鼠肝組織 TGF-β1 及Numb 含量指標變化比較（，n =10） %

注：與正常組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△△P ＜0.01；與秋水仙堿組比較，▲▲P ＜0.01

2.5 各組大鼠肝組織 TGF-β1及Numb 蛋白表達變化比較 見表5。

表5 各組大鼠肝組織 TGF-β1 及Numb 蛋白表達變化比較（）

表5 各組大鼠肝組織 TGF-β1 及Numb 蛋白表達變化比較（）

注：與正常組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△△P ＜0.01；與秋水仙堿組比較，▲▲P ＜0.01

3 討論

肝纖維化是由各種損肝因素導致的肝臟內結締組織異常增生的病理過程，具有肝細胞外基質（膠原蛋白、層黏連蛋白）的彌漫性沉積與異常分布及肝竇毛細血管化等病理特征，是各種慢性肝病向肝硬化甚至肝癌發(fā)展過程中的必經(jīng)階段，是影響慢性肝病預后的重要環(huán)節(jié)。研究[11]證實，參與肝纖維化的細胞有肝星狀細胞（HSC）、肝巨噬細胞（Kuffer）、肝竇內皮細胞等，而肝星狀細胞（HSC）的活化是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)。正常情況下，肝星狀細胞處于靜息狀態(tài)，當肝臟受到各種損肝因素刺激時，處于靜息狀態(tài)的HSC發(fā)生表型改變，即發(fā)生上皮-間質（EMT）轉化。肝細胞受到刺激后受損凋亡可激活kuffer 細胞、竇內皮細胞，促使其分泌ROS、TGF-β1、TNF-α 等細胞因子，活性氧（ROS）可進一步激活HSC 而增加ECM 沉積，HSC 活化可啟動脂質過氧化，形成大量的脂質過氧化物，如丙二醛（MDA）和4-羥基壬烯酸（4-HNE），可與蛋白質的特定氨基酸殘基結合，形成加合物產(chǎn)生細胞免疫反應釋放TGF-β1而激活HSC，王玲[12]研究證實HSC 培養(yǎng)中加入4-HNE 和MDA 培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)可大幅度蛋白產(chǎn)物及膠原蛋白的表達，表明4-HNE 增加HSC 膠原生成的能力強于MDA。熊章鄂[13]研究發(fā)現(xiàn)ROS 可打破氧化-還原平衡，肝炎患者合并長期酗酒者其4-HNE、MDA 免疫球蛋白顯著增加。于晨輝等[14]體內外實驗研究表明，外源性4-HNE 與慢性酒精攝入在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中均起著至關重要的作用，4-HNE 可抑制TNF-α 介導的NF-κB 抗HSC 凋亡而誘導肝纖維化的形成。

肝纖維化發(fā)生時TGF-β1明顯增多，TGF-β1可促進多條信號通路（Smad、Wnt、Notch）以及上調轉錄因子（NF-κB、Snail、Twist），以上信號通路及轉錄因子均可誘導基質金屬蛋白酶MMPs、金屬蛋白組織抑制因子TIMP 及血漿纖溶酶原活化抑制因子PAI使ECM 成分增多，刺激I 型及III 型膠原的產(chǎn)生或抑制DNA 合成及HSC 的凋亡[15]。楊博等[16]發(fā)現(xiàn)抑制TGF-β1表達可阻止肝纖維化的進展，甚至逆轉。安禎祥等[17]研究顯示TGF-β1質粒轉染技術SiRNA 可顯著降低肝纖維化大鼠中α-SMA 及膠原蛋白的表達，證實TGF-β1在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中起著至關重要的作用。研究[18-19]表明抑制TGF-β1及與其相關的信號通路可有效減輕甚至逆轉肝纖維化。本研究證實，給予不同劑量的柔肝化纖顆粒抑制TGF-β1表達較肝纖維化模型組明顯，進一步說明柔肝化纖顆粒可明顯抑制TGF-β1表達而發(fā)揮肝纖維化的作用。

近年來，Numb 作為一種決定細胞命運的決定因子與Wnt、Notch、Hedgehog 等信號在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中受到廣泛關注，但是Numb 在肝纖維化發(fā)生中的作用尚未深入探討。張旭等[20]研究發(fā)現(xiàn)膽汁淤積性肝纖維化的肝組織Numb 顯著下降，Notch 信號通路異?；罨ｑ阄牡萚21]文獻報道了Numb 是Wnt 信號通路直接靶標，可抑制Notch 和Hedgehog 信號通路，在Notch-Wnt 信號轉導方面起到“開關”作用，因此Numb 基因缺失可能通過阻斷Notch-Wnt 信號通路傳導而進一步誘導肝纖維化的進程。萬贊燕等[22]發(fā)現(xiàn)Wnt3a 可誘導Numb，而在肝纖維化中，Hedgehog 信號作為經(jīng)典Wnt 通路的調節(jié)，證實了在經(jīng)典Hedgehog 和Wnt信號通路中共同調節(jié)了HSC 活化。雖然在肝纖維化中與Numb 聯(lián)系尚未明確，但在肺、腎組織纖維化疾病中已證實。章智慧[23]研究發(fā)現(xiàn),過表達的Numb 參與肺纖維化的上皮-間質轉化的進展。劉偉等[24]研究結果顯示，Numb 過表達在近端小管中會引起細胞周期停滯在G2/M，從而加重腎小管間質纖維化，進而加重腎纖維化。本研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化大鼠的肝臟中的Numb 在纖維間隔、肝細胞中大量表達，給予不同劑量的柔肝化纖顆粒干預，Numb表達較病理模型組減少。故抑制Numb 表達可能是柔肝化纖顆粒預防肝纖維化作用機制之一。

綜上所述，本研究證實柔肝化纖顆粒能夠顯著減少脂質過氧化物、TGF-β1、Numb 的表達而發(fā)揮預防肝纖維化的作用，為柔肝化纖顆粒發(fā)揮抗肝纖維化的臨床運用奠定基礎，但其具體的作用機制需要我們進一步深入研究。