甜菜NAC基因家族生物信息學(xué)分析

周 珂，劉乃新，于清濤,2

(1.黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080； 2.哈爾濱市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，哈爾濱 150000)

1 引言

植物的發(fā)育是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程。在這個(gè)過(guò)程中，DNA和蛋白質(zhì)起著重要的作用。通過(guò)它們之間的相互作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。眾所周知，基因表達(dá)的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上，而在轉(zhuǎn)錄水平上與DNA相互作用的蛋白質(zhì)分子中最多樣化的是轉(zhuǎn)錄因子(TF)。轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)激活許多與植物生長(zhǎng)和發(fā)育有關(guān)的功能基因而發(fā)揮重要作用。通過(guò)與DNA結(jié)合或調(diào)節(jié)DNA結(jié)構(gòu)，TF可以調(diào)節(jié)與逆境脅迫有關(guān)的基因的表達(dá)，從而控制植物的生物過(guò)程[1]。

NAC基因家族主要存在于植物中，它的名字來(lái)自于三個(gè)基因的縮寫(矮牽牛的NAM，擬南芥的ATAF和CUC2)。無(wú)根尖分生組織(NAM)是在矮牽牛中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)特征化的NAC蛋白[2]，而擬南芥轉(zhuǎn)錄激活因子(ATAF)和杯狀子葉(CUC)是在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的。NAC蛋白在N端有一個(gè)高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域[3]。NAC結(jié)構(gòu)域由幾個(gè)螺旋體組成，環(huán)繞著一個(gè)反向平行的B-折疊，它可以結(jié)合DNA和其他蛋白[4]，轉(zhuǎn)錄因子的C端是轉(zhuǎn)錄激活功能區(qū)，其序列和功能具有多樣性[5]。

目前，在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)110多個(gè)NAC成員，在水稻中發(fā)現(xiàn)140多個(gè)NAC成員。以前的研究表明，NAC基因家族參與了植物發(fā)育和形態(tài)發(fā)生的各種過(guò)程，包括芽尖分生組織的形成[6]胚胎發(fā)育[7]花器官的形態(tài)發(fā)生[8]，側(cè)根的形成[9]葉衰老[10]和脅迫條件下的花器官誘導(dǎo)。NAC基因家族的成員還參與了細(xì)胞周期控制、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。[11]激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[12]和谷物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)[13]。

此外，NAC基因家族還與植物抗性有關(guān)，如干旱[14]，高鹽[15]、低溫[16]、機(jī)械損傷[17]和病毒感染[18]。

甜菜(Betavulgaris)是一種兩年生草本植物，原產(chǎn)于歐洲西部和南部沿海地區(qū)，是甘蔗以外的主要糖源。根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)的數(shù)據(jù)，全世界每年有30%的糖產(chǎn)量來(lái)自甜菜，它也是生物乙醇的重要來(lái)源。[19]天然色素[20]蔬菜[21]和動(dòng)物飼料的重要來(lái)源。[22]近年來(lái)，越來(lái)越多的瑞士甜菜[23]栽培品種(紅莖葉甜菜、紅葉甜菜)作為觀賞植物被廣泛用于景觀配置。

甜菜在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，容易受到各種生物和非生物脅迫的影響，嚴(yán)重影響甜菜的產(chǎn)量和觀賞價(jià)值。本研究以甜菜全基因組為基礎(chǔ)，鑒定了NAC家族的成員，并分析了其基因結(jié)構(gòu)、染色體定位、亞細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，為分析NAC轉(zhuǎn)錄因子的功能和構(gòu)建抗逆調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)。

2 材料和方法

2.1 甜菜 NAC 轉(zhuǎn)錄因子的挖掘與篩選

甜菜基因組和注釋文件數(shù)據(jù)下載自NCBI(https://www. ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=beta+vulgaris)。NAC基因家族保守結(jié)構(gòu)包含有PF01849、PF02365(數(shù)據(jù)來(lái)自Pfam數(shù)據(jù)庫(kù))，利用 HMMER3.0 軟件(http://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/)搜索甜菜蛋白序列，鑒定甜菜的PF01849、PF02365的 NAC 候選基因。候選基因再利用保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)網(wǎng)站Pfam (http://pfam.xfam.org/)和CDD (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)進(jìn)行檢測(cè)，保留完整的結(jié)構(gòu)域的作為NAC基因。利用 ProtParam (http://web.expasy.org/protp-aram/)分析NAC基因的氨基酸長(zhǎng)度、分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)進(jìn)行分析。

2.2 甜菜 NAC 轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)化分析

引入擬南芥 NAC 基因家族對(duì)甜菜NAC基因進(jìn)行亞組分類，擬南芥 NAC 蛋白序列下載于arabidopsis網(wǎng)站 (http://www.arabidopsis.org/)。將篩選得到的甜菜 NAC 蛋白序列進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，利用 Clustalx2.0 軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，再通過(guò)進(jìn)化樹(shù)分析軟件 MEGA5.2根據(jù)NJ方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(參數(shù)設(shè)置: P-distance, pairwise deletion, bootstrap (1 000 次重復(fù)))

2.3 甜菜 NAC 轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域分析

使用MEME程序(http://meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi)對(duì)甜菜的motif進(jìn)行識(shí)別。主要參數(shù)Motif的最大數(shù)量是15。

2.4 甜菜 NAC 轉(zhuǎn)錄因子內(nèi)含子、外顯子及染色體定位分析

甜菜 NAC 基因的內(nèi)含子、外顯子和基因組定位信息均下載于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)甜菜注釋文件。利用在線軟件 GSDS2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/) 對(duì) NAC 的內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析和整理；利用R包c(diǎn)hromPlot對(duì)NAC基因進(jìn)行染色體定位。利用軟件MCscanX對(duì) NAC 基因進(jìn)行片段復(fù)制和串聯(lián)復(fù)制分析。

2.5 甜菜NAC轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)分析

從NCBI下載甜菜逆境的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)， ID PRJNA254489。使用軟件solexQA 對(duì)下載的數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，使用軟件Tophat2進(jìn)行比對(duì)并使用Cufflink計(jì)算表達(dá)量, 使用R包pheatmap進(jìn)行候選基因的可視化。

2.6 甜菜 NAC 轉(zhuǎn)錄因子miR164 靶序列的定位

前人研究報(bào)道，NAC基因可能受miR164調(diào)控。根據(jù) miR164 靶序列(TGCACGTGCCCTGCTTCTCCA) ，在篩選得到的 52 個(gè)候選甜菜 NAC 轉(zhuǎn)錄因子相應(yīng)的核苷酸序列中使用 BLAST在線聯(lián)配工具，預(yù)測(cè)潛在的miR164的靶標(biāo)。

3 結(jié)果

3.1 甜菜 NAC 轉(zhuǎn)錄因子序列的鑒定

通過(guò) NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載甜菜基因組及蛋白序列，根據(jù) NAC 保守域序列號(hào) PF01849、PF02365(Pfam數(shù)據(jù)庫(kù))，利用 HMMER3.0 軟件檢索甜菜的氨基酸序列。再利用保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)網(wǎng)站 Pfam和 CDD對(duì)候選序列進(jìn)行篩選鑒定。通過(guò)以上篩選獲得 87個(gè)NAC候選基因，5個(gè)含有NAC結(jié)構(gòu)域，82個(gè)為NAM結(jié)構(gòu)域。去除掉可變剪切和位于scaffold上的NAC基因，一共獲得52個(gè)甜菜NAC基因。利用 ExPASy 提供的在線軟件 ProtParam (http://web.expasy.org/protp-aram/)對(duì)候選成員氨基酸序列進(jìn)行一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 β硫化物中NAC基因的數(shù)量和特性

續(xù)表1

3.2 甜菜 NAC 轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)化樹(shù)分析

引入已知類型的擬南芥 NAC 蛋白序列，構(gòu)建 BvNAC的進(jìn)化樹(shù)。通過(guò)已知擬南芥 NAC 蛋白的類型指導(dǎo) BvNAC 蛋白的分組。進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，BvNAC 蛋白序列可分為 18 個(gè)亞族(圖 2)。各亞族成員數(shù)量分布差異很大，其中Ⅻ亞族的Bv NAC 轉(zhuǎn)錄因子成員最多為 28 個(gè)，而Ⅸ和Ⅹ亞族成員均只有一個(gè)。其中的Ⅻ亞族與擬南芥并沒(méi)有相聚成簇。

圖1 Beta vulgaris和擬南芥的NAC基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3.3 甜菜 NAC 轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域分析

利用在線MEME軟件對(duì)甜菜 NAC 的 NAC 結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甜菜 NAC 轉(zhuǎn)錄因子的 NAC 保守結(jié)構(gòu)域是高度保守的(圖2)。NAC 保守結(jié)構(gòu)域中包含 15個(gè)亞結(jié)構(gòu)域，其中 A、C、D 亞結(jié)構(gòu)域保守性高，B 和 E 保守性低。由于亞族Ⅲ、Ⅵ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ的成員較少無(wú)法使用 Web Logo 軟件構(gòu)建該組的全序列標(biāo)簽，所以沒(méi)有列出。甜菜 NAC 轉(zhuǎn)錄因子Ⅰ、Ⅴ、Ⅺ亞族成員的保守性最高，而Ⅻ亞族成員保守性最低(圖2)。

圖2 甜菜NAC 轉(zhuǎn)錄因子motif結(jié)構(gòu)分布

3.4 甜菜 NAC 轉(zhuǎn)錄因子內(nèi)含子及外顯子分析

甜菜 NAC 基因的內(nèi)含子、外顯子和基因組定位信息均下載于 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)。利用在線軟件 GSDS2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)對(duì) NAC 的內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析和整理(圖3)。甜菜 NAC 轉(zhuǎn)錄因子家族成員主要由 1～7 個(gè)外顯子組成，其中Ⅻ亞族大多數(shù)成員只含有一個(gè)外顯子，這可能與其是甜菜特有的一類 NAC 轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)。

圖3 甜菜 NAC 轉(zhuǎn)錄因子家族染色體定位和數(shù)量分布

3.5 甜菜 NAC 轉(zhuǎn)錄因子染色體定位分析

利用R包c(diǎn)hromPlot制作 NAC 的染色體定位分布圖，并對(duì) NAC 基因進(jìn)行片段復(fù)制和串聯(lián)復(fù)制分析。本實(shí)驗(yàn)篩選出的 52 個(gè)甜菜 NAC 基因不均勻的分布于 9 條染色體上，6 號(hào)染色體上分布最多，為11 個(gè)；其次是 1 號(hào)染色體，為 10 個(gè)；7 號(hào)染色體分布最少，只有 1 個(gè)(圖5B)。同時(shí)，對(duì)甜菜 NAC 轉(zhuǎn)錄因子基因進(jìn)行片段復(fù)制和串聯(lián)復(fù)制檢測(cè)。多個(gè)甜菜 NAC 轉(zhuǎn)錄因子基因處于甜菜基因組復(fù)制事件區(qū)域，其中沒(méi)有基因經(jīng)歷了片段復(fù)制， 6個(gè)基因經(jīng)歷了串聯(lián)復(fù)制，占基因總數(shù)的 11.5%(圖5A)。可見(jiàn)，甜菜 NAC 基因家族以串聯(lián)復(fù)制0為主要擴(kuò)增方式。

3.6 甜菜 NAC 轉(zhuǎn)錄因子 mi R164 靶序列定位

根據(jù) miR164靶序列(TGCACGTGCCCTGCTTCTCCA)與篩選得到的 52 個(gè)候選甜菜 NAC 轉(zhuǎn)錄因子相應(yīng)的核苷酸序列，利用 BLAST工具對(duì) miR164 靶序列的定位分析，選取e-value小于 0.009的序列。結(jié)果表明，在 52 個(gè)甜菜 NAC 轉(zhuǎn)錄因子中有1 個(gè) NAC 轉(zhuǎn)錄因子成員(BvNAC30)的核苷酸序列具有 miR164 靶序列識(shí)別位點(diǎn)。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法篩選出了52條甜菜NAC轉(zhuǎn)錄因子，并對(duì)其構(gòu)建了進(jìn)化樹(shù)、 分析了蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域、染色體上進(jìn)行了定位和 mi R164 靶序列定位，這些研究結(jié)果將為以后 利用基因工程技術(shù)創(chuàng)制甜菜新種質(zhì)提供優(yōu)異基因資源做準(zhǔn)備。