眼庫獲取的角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度變化規(guī)律及影響因素研究△

龍俊君 李蘭 曹倩 李云川 李勇 田二苗

(昆明市第一人民醫(yī)院眼科 昆明 650000)

當(dāng)下角膜供體嚴(yán)重缺乏，在我國約400萬等待角膜移植的患者，而每年僅1萬余人進(jìn)行手術(shù)[1]。在角膜供體如此缺乏的情況下，規(guī)范眼庫管理為臨床提供更多優(yōu)質(zhì)的角膜植片尤為重要。2016年，美國從62家眼庫收集了69 049名捐贈(zèng)者捐贈(zèng)的136 318枚眼角膜，卻有近26%的捐贈(zèng)角膜通過評(píng)估后被認(rèn)為不適合移植[2]。

供體角膜評(píng)估主要包括角膜內(nèi)皮細(xì)胞活性、微生物污染控制以及免疫原性[3]，角膜內(nèi)皮細(xì)胞活性是評(píng)價(jià)供體質(zhì)量的重要因素。在我們植片獲取和保存過程中易受環(huán)境等因素的制約，因此不同國家和地區(qū)的獲取標(biāo)準(zhǔn)不盡相同[4-6]。關(guān)于供體角膜內(nèi)皮細(xì)胞影響因素的研究目前仍沒有定論，而角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度隨死亡-獲取時(shí)間、年齡等多種相關(guān)因素的變化規(guī)律有待進(jìn)一步闡明。本文對(duì)116枚供體角膜進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞密度監(jiān)測(cè)，探究在獲取過程中影響角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度的因素，以期為優(yōu)化角膜取材及保存的流程提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料 收集2019年1月~2021年1月于本院獲取的供體角膜植片132枚，符合標(biāo)準(zhǔn)116枚(87.8%)，16枚排除(12.1%)。其中8枚(6.0%)因角膜潰瘍排除，6枚(4.5%)因患有傳染性疾病排除，1枚(0.7%)因既往內(nèi)眼手術(shù)史排除，1枚(0.7%)因既往青光眼病史排除，余116枚角膜供體納入研究。

1.2 試劑與儀器 試劑：Eusol-C中期保存液、Ⅲ型安爾碘溶液。器材：內(nèi)皮顯微鏡(EB-3000 XYZ型，HAI公司，美國)、角膜剪、開瞼器、持針器、手術(shù)刀。分析軟件：內(nèi)皮分析軟件(CASEB 2.20，HAI公司，美國)。

1.3 研究方法

1.3.1 獲取角膜組織(原位角膜切除) ①消毒鋪巾，Ⅲ型安爾碘溶液沖洗結(jié)膜囊；②角膜剪沿角鞏膜緣剪開結(jié)膜囊，分離結(jié)膜下組織，手術(shù)刀于角鞏膜緣后3 mm處切開鞏膜，直達(dá)色素膜，角膜剪360°剪開鞏膜，取下角膜植片，保存于4 ℃，Eusol-C中期保存液中，內(nèi)皮面朝上；③置塑料透明角膜片于眼表創(chuàng)面，閉合瞼緣，恢復(fù)儀容。

1.3.2 檢測(cè)方法 ①參照《眼庫管理中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》[3]，制訂角膜組織報(bào)告表。記錄供體編號(hào)、性別、年齡、死亡原因、死亡-獲取時(shí)間，取材后立即進(jìn)行保存并由同一名醫(yī)師進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞密度的檢測(cè)。②裂隙燈顯微鏡檢查：角膜上皮層均完整；基質(zhì)層無水腫、瘢痕；后彈力層無褶皺。③內(nèi)皮細(xì)胞密度檢測(cè)：將裝有供體角膜植片的保存液瓶裝入內(nèi)皮顯微鏡的固定槽中，調(diào)節(jié)鏡頭的位置找到中央角膜，調(diào)整粗準(zhǔn)焦螺旋找到角膜內(nèi)皮層，進(jìn)一步調(diào)整細(xì)準(zhǔn)焦螺旋使得內(nèi)皮細(xì)胞成像清晰，拍攝內(nèi)皮細(xì)胞圖，選擇其中的50~100個(gè)細(xì)胞，運(yùn)用CASEB 2.20 內(nèi)皮分析軟件對(duì)所拍攝的圖片進(jìn)行內(nèi)皮密度分析，對(duì)同一角膜植片重復(fù)測(cè)量3次取平均值，記錄數(shù)據(jù)。取材及檢測(cè)均由同一醫(yī)師進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS 23.0軟件將所收集數(shù)據(jù)整理后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)或率表示。滿足正態(tài)分布與方差齊性的資料采用單因素方差分析(analysis of variance，ANOVA)，不滿足的資料則采用秩和檢驗(yàn)。運(yùn)用多元線性回歸分析研究死亡-獲取時(shí)間與角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度的變化規(guī)律。以P＜0.05判定為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 供體年齡與角膜內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)性 116枚角膜供體中，年齡為(35.46±12.55)歲，按年齡將所測(cè)量的供體植片進(jìn)行分組(表1)。其中＜30歲組，48例，平均角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度為(3 151.770±347.288)個(gè)/mm2；＞30歲組，68例，平均角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度為(2 846.338±338.867)個(gè)/mm2。不同年齡的供體角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=22.395，P＜0.001)。

2.2 供體死亡原因與角膜內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)性 本研究中供體因外傷死亡的有86例，余30例死于心腦血管意外(表1)。2組不同死亡原因的供體角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.444，P=0.232)。

2.3 供體死亡-獲取時(shí)間與角膜內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)性

2.3.1 供體死亡-獲取時(shí)間與角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度 將116例角膜供體按死亡-獲取時(shí)間分組(圖1)，0~2 h組，40例，平均角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度為(3 179.975±335.365)個(gè)/ mm2；2~4 h組，42例，平均角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度為(2 962.595±355.271)個(gè)/ mm2；4~6 h組，34例，平均角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度為(2 741.411±295.646)個(gè)/mm2。隨死亡-獲取時(shí)間延長所拍攝圖片角膜內(nèi)皮細(xì)胞清晰程度下降，圖C中因角膜水腫無法拍攝出清晰的圖像，而圖D中出現(xiàn)了無內(nèi)皮細(xì)胞區(qū)。116枚供體角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度均＞2 000個(gè)/mm2。

圖1 不同死亡-獲取時(shí)間供體植片角膜內(nèi)皮細(xì)胞拍攝圖片 A.死亡-獲取時(shí)間為0.5 h，角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度為3 701 個(gè)/mm2；B.死亡-獲取時(shí)間為2.25 h，角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度為3 190 個(gè)/mm2；C.死亡-獲取時(shí)間5.2 h，角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度為2 806 個(gè)/mm2，角膜植片部分出現(xiàn)水腫，所測(cè)角膜內(nèi)皮細(xì)胞圖像清晰度下降；D.死亡-獲取時(shí)間為5.5 h，角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度為2 033 個(gè)/mm2，該植片出現(xiàn)了無內(nèi)皮細(xì)胞區(qū)。D 所拍攝位置非角膜中央，所測(cè)角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度為中央角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度。

表1顯示不同供體死亡-獲取時(shí)間的角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度。不同死亡-獲取時(shí)間的角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=16.078，P=0.005)。運(yùn)用SNK法進(jìn)行事后檢驗(yàn)；對(duì)不同死亡-獲取時(shí)間組間供體角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度差值進(jìn)行兩兩對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 角膜植片內(nèi)皮細(xì)胞密度

2.3.2 供體死亡-獲取時(shí)間與角膜內(nèi)皮細(xì)胞六角形細(xì)胞占比及變異系數(shù) 不同死亡-獲取時(shí)間的供體角膜內(nèi)皮細(xì)胞六角形細(xì)胞占比及變異系數(shù)見表2。將3組數(shù)據(jù)的六角形細(xì)胞占比進(jìn)行ANOVA，結(jié)果示不同死亡-獲取時(shí)間的六角形細(xì)胞占比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.708，P=0.011)。運(yùn)用LSD法進(jìn)行事后檢驗(yàn)：對(duì)不同死亡-獲取時(shí)間組間供體角膜內(nèi)皮細(xì)胞六角形細(xì)胞占比進(jìn)行兩兩對(duì)比，0~2 h、2~4 h分別與4~6 h組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而0~2 h與2~4 h組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。將3組數(shù)據(jù)的變異系數(shù)進(jìn)行ANOVA，結(jié)果示不同死亡-獲取時(shí)間的變異系數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.495，P=0.563)。

表2 角膜內(nèi)皮細(xì)胞六角形細(xì)胞占比及變異系數(shù)

2.4 角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度隨死亡-獲取時(shí)間的變化規(guī)律 通過之前分析進(jìn)行因變量的篩選，發(fā)現(xiàn)供體年齡、不同死亡-獲取時(shí)間對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用多元線性回歸分析，設(shè)角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度為因變量Y，自變量分別為年齡X1，死亡-獲取時(shí)間X2。將所得結(jié)果擬合回歸方程：Y=3 711.007-11.073X1-124.098X2，擬合度R=0.64，P＜0.05，回歸模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。供體角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度隨供體年齡、死亡-獲取時(shí)間的變化規(guī)律符合線性趨勢(shì)，且呈負(fù)相關(guān)。

3 討論

供體角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度及活性是評(píng)估植片質(zhì)量的重要指標(biāo)，亦是穿透性角膜移植手術(shù)成功的保障。角膜內(nèi)皮細(xì)胞是連接角膜與前房的屏障，既能防止房水進(jìn)入基質(zhì)層，也具有鈉泵功能將角膜基質(zhì)內(nèi)的水泵至前房維持角膜透明[7]。然而角膜內(nèi)皮細(xì)胞極易受到損傷，低氧、年齡＞65歲、炎癥及內(nèi)眼手術(shù)干擾等多種物理化學(xué)因素[8-10]均可造成角膜內(nèi)皮細(xì)胞損傷。角膜內(nèi)皮細(xì)胞損傷或是缺失后依靠相鄰的內(nèi)皮細(xì)胞通過伸展、擴(kuò)大、移行進(jìn)行修復(fù)，不僅會(huì)引起數(shù)量減少，而且形態(tài)大小也會(huì)發(fā)生變化，造成六角形細(xì)胞占比減少。由于角膜移植術(shù)后植片曲率變化較大，難以通過非接觸式角膜內(nèi)皮細(xì)胞鏡進(jìn)行術(shù)后早期的角膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)進(jìn)行精確檢測(cè)，而術(shù)后角膜內(nèi)皮的慢性失代償仍有待進(jìn)一步長時(shí)間的隨訪。

本研究結(jié)果提示年齡和死亡-獲取時(shí)間對(duì)供體角膜植片內(nèi)皮細(xì)胞密度的影響是相互關(guān)聯(lián)的。供體角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度與供體年齡、供體死亡-獲取時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。目前已有關(guān)于供體角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度與年齡、保存時(shí)間及方法、死亡-獲取時(shí)間等諸多因素的研究[11]。Armitage等[12]研究表明供體年齡和組織保存時(shí)間是影響器官培養(yǎng)法保存的角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度的主要因素，較高的供體年齡和較長的保存時(shí)間都會(huì)降低供體角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度。然而Langenbucher等[13]研究則認(rèn)為儲(chǔ)存時(shí)間延長可能會(huì)增加角膜內(nèi)皮細(xì)胞丟失，但死亡-獲取時(shí)間與角膜內(nèi)皮細(xì)胞丟失無關(guān)。通常認(rèn)為正常人群角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度隨年齡增長而下降，60歲后人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)目與形態(tài)可發(fā)生變化，但對(duì)供體年齡與角膜術(shù)后成功率的研究認(rèn)為角膜移植后的成功率和供體年齡并無關(guān)系[14]。目前這些研究的結(jié)果往往是相互矛盾的。本研究認(rèn)為影響供體角膜內(nèi)皮細(xì)胞的因素既獨(dú)立存在也相互影響，對(duì)于用作穿透性角膜移植材料的角膜供體，年齡越大則要求死亡-獲取時(shí)間越短。

本研究所收集資料均用于臨床穿透性角膜移植手術(shù)，暫無死亡-獲取時(shí)間＞6 h的病例。研究發(fā)現(xiàn)，雖然在6 h內(nèi)所獲取的角膜植片的內(nèi)皮細(xì)胞密度均＞2 000個(gè)/mm2，但是隨死亡-獲取時(shí)間延長，所測(cè)角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度呈線性下降趨勢(shì)。因此在進(jìn)行增視性角膜移植手術(shù)，例如圓錐角膜患者的穿透性角膜移植手術(shù)時(shí)，不建議使用死亡-獲取時(shí)間＞6 h的供體植片。死亡-獲取時(shí)間對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的影響機(jī)制是由于死后生命活動(dòng)停止，使得機(jī)體處于缺氧狀態(tài)，房水停止生成，而原本在前房里的房水氧含量隨死亡時(shí)間延長而下降，最終導(dǎo)致角膜內(nèi)皮細(xì)胞丟失[15]。通常認(rèn)為死亡-獲取時(shí)間＞12 h，角膜內(nèi)皮細(xì)胞將被滅活，因此國內(nèi)外眼庫多要求供體死亡時(shí)間＜6 h[16]。在我國由于供體的稀缺，謝立信等[17]曾將7枚死亡-獲取時(shí)間＞12 h的供體植片進(jìn)行移植，監(jiān)測(cè)到受體術(shù)后半年角膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)平均為1 230個(gè)/mm2，即供體死亡-獲取時(shí)間＞12 h也可用于穿孔感染等治療性角膜移植。國外也報(bào)道了類似研究，Parekh等[18]對(duì)死亡-獲取時(shí)間為0.3~25.6 h的733個(gè)角膜供體進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在保存過程中，死亡-獲取時(shí)間對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞沒有影響。然而，在對(duì)接受植片死亡-獲取時(shí)間＞10 h的患者進(jìn)行隨訪的過程中發(fā)現(xiàn)，較長的死亡-獲取時(shí)間會(huì)對(duì)角膜移植患者移植后的內(nèi)皮細(xì)胞丟失有影響，因此，排除手術(shù)創(chuàng)傷外，死亡-獲取時(shí)間也是影響內(nèi)皮細(xì)胞密度的潛在因素之一。目前各國對(duì)死亡-供體保存時(shí)間尚未作嚴(yán)格要求，僅均強(qiáng)調(diào)應(yīng)盡快摘取和保存供體眼組織。

本研究所監(jiān)測(cè)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度與死亡-獲取時(shí)間和供體年齡相關(guān)性的回歸模型，擬合度僅為0.64，表明除死亡-獲取時(shí)間和供體年齡對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞起主要影響外，仍有其他因素影響著供體角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度。此前已有研究[19]表明不同溫度對(duì)供體角膜內(nèi)皮細(xì)胞活性有影響，溫度越高，角膜內(nèi)皮細(xì)胞存活的時(shí)間越短。此外，供體眼部疾患，如既往白內(nèi)障、青光眼、玻璃體切除等內(nèi)眼手術(shù)史，眼部炎癥史、圓錐角膜及Fuchs角膜內(nèi)皮營養(yǎng)不良等均可引起角膜內(nèi)皮細(xì)胞丟失；供體原發(fā)病如糖尿病、高血壓、慢性腎衰竭及代謝綜合征等，供體死亡前呼吸機(jī)使用時(shí)間等也被認(rèn)為會(huì)引起角膜內(nèi)皮細(xì)胞丟失[20-21]。

除供體角膜植片在取材及保存過程中有內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，穿透性角膜移植手術(shù)過程也會(huì)造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷。因此，為了提高穿透性角膜手術(shù)的成功率，選用的供體角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度應(yīng)＞2 000個(gè)/mm2，無明顯形態(tài)異常，細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[2]。對(duì)臨床供體角膜植片內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)測(cè)，分析角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度的影響因素并探究其變化規(guī)律，可以為穿透性角膜移植手術(shù)優(yōu)選高質(zhì)量供體材料，從而提高穿透性角膜手術(shù)的成功率。