生物工程角膜應(yīng)用于感染性角膜炎的臨床觀察

康黔，楊雨昆，姚曉明

(成都愛迪眼科醫(yī)院角膜病?？?，成都 610072)

感染性角膜炎是一大類致盲率極高的角膜病變。針對該類疾病較多采用角膜移植進(jìn)行救治。及時的角膜移植可以有效控制感染，甚至部分恢復(fù)患者視力。角膜供體嚴(yán)重缺乏是限制急診角膜移植手術(shù)開展的主要原因。尋求一種在一定程度上能替代人供體角膜的材料，讓嚴(yán)重的角膜炎患者能及時接受角膜移植治療，挽救眼球及視力，是角膜移植醫(yī)師所非常期望的。生物工程角膜(脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì))于2005年開始臨床試用，后經(jīng)全國多中心研究，在155名患者知情同意的情況下，經(jīng)過5年完成生物工程角膜移植的臨床試驗，研究證實其有效率達(dá)到94.4%，并于2015年獲得了我國食品藥品管理局的上市批準(zhǔn)[1]。

四川省位于我國西南部，氣候潮濕，又是西部農(nóng)業(yè)大省，每年農(nóng)忙季節(jié)均有大量的感染性角膜炎患者發(fā)病。很多患者因供體材料缺乏而無法及時行治療性角膜移植，導(dǎo)致視力嚴(yán)重受損甚至眼球不保。為了對感染性角膜病患者進(jìn)行急診角膜移植手術(shù)治療，緩解供體材料的匱乏。成都愛迪眼科醫(yī)院自2018年9月至2021年2月使用生物工程角膜(脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)，艾欣瞳)為19例感染性角膜病患者實施板層移植手術(shù)并取得較好療效。

1 對象與方法

1.1 對象

本研究經(jīng)成都愛迪眼科醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，按照赫爾辛基宣言執(zhí)行，患者均簽署知情同意書，確認(rèn)所有操作和信息。術(shù)前詢問患者病史，行裂隙燈顯微鏡、激光掃描共焦顯微鏡、前節(jié)光學(xué)相干斷層掃描(optical coherence tomography，OCT)掃描以及角膜刮片檢查。納入標(biāo)準(zhǔn)：藥物保守治療1～2周以上，病灶繼續(xù)擴(kuò)大或者病情無法控制者，相關(guān)檢查提示角膜病灶深度大于角膜厚度1/2以上，未累計全層者。排除標(biāo)準(zhǔn)：病灶累計角膜全層或穿孔、視網(wǎng)膜脫離。實驗組使用豬角膜脫細(xì)胞基質(zhì)生物工程角膜(艾欣瞳，艾尼爾角膜工程有限公司，深圳)。同期因感染性角膜炎而使用捐獻(xiàn)角膜行板層角膜移植的案例作為對照組。

1.2 方法

1.2.1 手術(shù)方法

所有手術(shù)由同一名術(shù)者完成(康黔)。采用表面麻醉及2%利多卡因球后阻滯麻醉。根據(jù)角膜病變范圍確定植床大小，選用合適環(huán)鉆(多為7.25～7.5 mm)劃界，標(biāo)示出病變角膜切除范圍。取出4 ℃保存的凍干艾欣瞳，厚度為400 μm，4 ℃復(fù)方生理鹽水復(fù)水15 s左右，采用與植床等大的環(huán)鉆鉆取艾欣瞳植片備用。手法濕剝切除包括角膜病變區(qū)及病變邊緣外約0.25 mm范圍的正常角膜組織，制作植床。剖切植床過程中，用林格液滴淋植床，通過剖切界面上的水層，易于觀察感染灶是否被徹底剖除干凈。將艾欣瞳植片置于植床，10-0尼龍線間斷縫合植片。縫合深度達(dá)植片厚度的4/5以上。線頭埋藏至植床層間[2]。結(jié)膜下注射5%頭孢唑林鈉0.4 mL。單眼包扎，眼罩保護(hù)。對照組術(shù)式相同，僅角膜來源差異。

1.2.2 術(shù)后治療

術(shù)后3 d內(nèi)針對原發(fā)病病原體分別給予靜脈滴注頭孢唑林鈉或伏立康唑、局部滴用左氧氟沙星眼液(可樂必妥)、普羅納克眼液、他克莫司眼液和表皮生長因子眼液等。根據(jù)感染控制情況靜脈給藥5～7 d，術(shù)后2～4周開始眼部滴用皮質(zhì)類固醇眼液、他克莫司眼液及人工淚液，并逐漸減量維持6～12個月。依植片愈復(fù)情況、角膜全景圖及醫(yī)學(xué)驗光結(jié)果，術(shù)后2個月開始分次拆除縫線。

術(shù)后第1年每個月復(fù)診1次，行眼前節(jié)照相、前節(jié)OCT、眼壓、視力檢查及驗光檢查。

1.2.3 排斥反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)

1)上皮愈合不良(面積大小)：無為0分，＜1/3植片范圍為1分，1/3～1/2植片范圍為2分，＞1/2植片范圍為3分。2)早期植片水腫(裂隙燈下觀察)：不明顯為0分，輕度為1分，中度為2分，重度為3分。3)植片溶解(面積大小)：無為0分，＜1/3植片范圍為1分，1/3～1/2植片范圍為2分，＞1/2植片范圍為3分。4)角膜緣新生血管(象限分布)：無為0分，＜1個象限為1分，1～2個象限為2分，＞2個象限為3分。5)遠(yuǎn)期植片透明度(裂隙燈下通過角膜植片觀察虹膜)：虹膜紋理清晰為0分，虹膜紋理模糊窺見為1分，虹膜紋理完全窺不清僅見虹膜顏色為2分，完全窺不見虹膜顏色為3分。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 10.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，行Mann-Whitney檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)前資料

在19例患者中，女9例(47.37%)，男10例(52.63%)。70歲以上1例，＞60～70歲5例，＞50～60歲5例，＞40～50歲6例，＞30～40歲1例，20～30歲1例，平均年齡53.32歲。術(shù)前診斷：細(xì)菌性角膜炎7例(36.84%)，真菌性角膜炎8例(42.11%)，病毒性角膜炎4例(21.05%)。術(shù)前視力檢查：光感3例(光定位準(zhǔn)確)，手動5例(光定位準(zhǔn)確)，數(shù)指4例，3.0～3.9者7例。外眼及眼附屬器正常。

2.2 術(shù)后角膜炎癥控制情況及角膜愈合程度

術(shù)后2～3 d，患眼眼表炎癥明顯減輕，睫狀充血逐步消退，術(shù)前伴有的角膜內(nèi)皮斑或者無菌性積膿均消失。術(shù)后第2天，角膜上皮開始進(jìn)入生物工程角膜植片緣，大部分患者在術(shù)后4～7 d時上皮修復(fù)。1周后，角膜熒光染色可見角膜上皮完全覆蓋角膜植片。隨訪1～14個月，所有病例術(shù)后圍手術(shù)期均未發(fā)生原發(fā)感染復(fù)發(fā)。植片成活18例(94.74%)，1個月內(nèi)植片溶解再手術(shù)1例(5.26%)。

2.3 視力變化(以患者最近1次復(fù)查視力為術(shù)后視力)

裸眼視力4.0～4.5者15例(78.95%)，3.0～4.0者3例(15.79%)，數(shù)指1例(并發(fā)白內(nèi)障，5.26%；表1)。

表1 術(shù)前術(shù)后裸眼視力對比Table 1 Comparison of uncorrected visual acuity before and aft er operation

2.4 術(shù)后植片透明度及有無排斥反應(yīng)發(fā)生

生物工程角膜排異反應(yīng)早期表現(xiàn)有急性睫狀充血、植片水腫、上皮愈合不良及植片溶解等。中長期表現(xiàn)為角膜緣新生血管侵入，植片透明度緩慢減退，視力逐漸下降等，與人來源角膜排斥表現(xiàn)類似。本試驗組病例在上皮修復(fù)后植片透明度逐漸提高，3～6個月時植片透明度最好，6個月后，部分患者可見慢性排異反應(yīng)，新生血管侵入角膜緣進(jìn)入角膜層間或者圍繞植片緣生長，植片緣呈半透明狀改變。局部強(qiáng)化他克莫司、百力特眼液可使新生血管萎縮消退、植片透明度改善。排斥預(yù)后與對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.736，表2)。但中長期觀察(6～12個月及以上)發(fā)現(xiàn)生物工程角膜緣新生血管更明顯、植片透明度降低比例較人供體角膜高。遠(yuǎn)期生物工程角膜植片緣可發(fā)生環(huán)形玉白色半透明狀渾濁，但中央?yún)^(qū)透明度良好，對視力影響不大。

表2 生物工程角膜與人供體角膜術(shù)后排異反應(yīng)評分Table 2 Rejection score of bioengineered and human donor corneal transplantation

續(xù)表2

2.5 典型病例

圖1～4所示為4例行生物工程角膜板層角膜移植術(shù)的典型病例。

圖1 病例1：患者女，49歲，左眼病毒性角膜炎，行生物工程角膜板層角膜移植術(shù)Figure 1 Case 1:A 49-year-old female patient with viral keratitis in her left eye underwent bioengineered lamellar keratoplasty

圖2 病例2：患者男，50歲，右眼真菌性角膜炎，行生物工程角膜行板層角膜移植Figure 2 Case 2:A 50-year-old male patient with fungal keratitis of the right eye underwent bioengineered and lamina corneal transplantation

圖3 病例3：患者男，67歲，左眼紅痛視力下降2 d，銅綠假單胞菌潰瘍，行生物工程角膜行板層角膜移植術(shù)，術(shù)后全身靜脈滴注阿米卡星治療3 d，局部妥布霉素眼液1次/h，他克莫司眼液點眼4次/d，溴芬酸鈉眼液點眼2次/d，玻璃酸鈉眼液點眼4次/dFigure 3 Case 3:The patient is a 67-year-old male,with the left eye eyesight decline in 2 d,pseudomonas aeruginosa ulcer,biological engineering corneal andante layer corneal transplantation,postoperative systemic intravenous drip 3 days amikacin therapy,local tobramycin eye drops 1 time per hour,tacrolimus eyedrops eye 4 times per day,bromfenac sodium eye drops eye for 2 times per day,the sodium hyaluronate drops eye 4 times per day

圖4 病例4：患者女，39歲，行右眼病毒性角膜炎行生物工程角膜板層角膜移植術(shù)Figure 4 Case 4:A 39-year-old female patient with right eye viral keratitis underwent bioengineered lamellar keratoplasty

3 討論

我國是世界上盲人最多的國家之一(雙眼人盲達(dá)600萬～700萬)，其中因角膜病致盲的患者為200萬～300萬，而且每年以10%的比率增加[2-4]。治療角膜盲的第一位方案就是角膜移植，而感染性角膜炎是我國目前角膜移植手術(shù)的主要適應(yīng)證[5]。角膜來源匱乏使得我國無法為感染性角膜病提供急診手術(shù)所需[2-5]。

2010年武漢協(xié)和醫(yī)院眼科首次將由豬角膜制成的人工生物角膜“艾欣瞳”應(yīng)用于人類角膜移植。2015年“艾欣瞳”通過國家食品藥品監(jiān)督管理總局注冊并應(yīng)用于臨床，成為全球首個生物工程角膜產(chǎn)品。有研究團(tuán)隊[6-10]使用人工生物角膜移植治療真菌性角膜炎患者，通過最少6個月的隨訪證實了人工生物角膜應(yīng)用在人角膜移植中的安全性和有效性。

本組病例中植片成活率達(dá)到94.74%，大部分患者保全眼球的同時恢復(fù)了有用視力。艾欣瞳植片成活的關(guān)鍵在于早期上皮化。術(shù)后3 d，在植片邊緣線結(jié)處，角膜上皮生長；術(shù)后10 d，角膜水腫基本消退，角膜上皮細(xì)胞跨過植片邊緣，向中心生長，逐步完成角膜上皮化，但是熒光素染色仍能觀察到點狀染色；術(shù)后1個月，植片透明度逐漸恢復(fù)，角膜上皮化良好。豬脫細(xì)胞角膜基質(zhì)能夠與角膜上皮細(xì)胞形成緊密結(jié)合，上皮細(xì)胞黏附穩(wěn)定[11-13]。本研究顯示：術(shù)后2～3 d，角膜上皮開始進(jìn)入生物工程角膜植片緣，大部分在4～7 d上皮修復(fù)并逐漸排列規(guī)則。

對照組植片上皮術(shù)后1～3 d能修復(fù)，且上皮完整修復(fù)后可出現(xiàn)良好透明度。而生物工程角膜組透明度隨上皮修復(fù)逐漸改善，術(shù)后1～2周時逐漸透明，1個月左右趨于穩(wěn)定，且上皮修復(fù)越快，后期植片透明度更佳。研究[12,14-15]報道：約術(shù)后5個月，在共焦顯微鏡下可觀察到植片上皮下有少量神經(jīng)纖維長入，提示上皮愈合后要持續(xù)注意上皮情況。此外，遠(yuǎn)期觀察(6～12個月及以上)部分生物工程角膜植片緣有新生血管侵入，基質(zhì)呈環(huán)形玉白色半透明狀渾濁，透明度較同期移植的人供體板層角膜植片低(病例1～3)。

本組1例病毒性角膜炎患者(病例4)于術(shù)后1個月出現(xiàn)植片溶解，可能與復(fù)水過度、縫線松緊不一、植片-植床尺寸設(shè)計不當(dāng)?shù)榷嘀匾蛩赜嘘P(guān)，進(jìn)而導(dǎo)致術(shù)后2周縫線松脫，植片上皮化延遲，甚至基質(zhì)溶解。重新縫合后，雖然植片透明度一度得到改善，但因溶解的植片結(jié)構(gòu)難以修復(fù)。更換人角膜板層移植3個月后，矯正視力達(dá)4.8。

本研究結(jié)果顯示：與脫水保存的人角膜植片相比，艾欣瞳植片復(fù)水需時大大縮短，復(fù)水后植片迅速膨大，可能與其異種生物屬性有關(guān)。植片復(fù)水開始后用食指和拇指捏持植片，感知植片由“硬”變“韌”且稍可彎曲即停止復(fù)水，同時及時將植片的水分吸凈，整個復(fù)水時間不應(yīng)超過15 s。植片直徑應(yīng)與植床相同，否則植片極易超過植緣形成“植片騎跨”而導(dǎo)致植片-植床無法良好對合，影響縫合及上皮愈復(fù)。此外，與同種異體角膜植片相比，艾欣瞳植片的縫線易于松動，會導(dǎo)致上皮難以愈合，基質(zhì)溶解。因此術(shù)后需嚴(yán)密觀察，一旦縫線松動即行拆除，必要時可重新縫合，但縫針應(yīng)避開原有線道以防止針孔擴(kuò)大、豁開植片。我們自術(shù)后2個月起即逐步拆線，比同種異體角膜移植拆線早1～2個月，這將有助于減少因松線引起的炎性反應(yīng)和植片溶解[14,16-17]。

綜上，生物工程角膜在上皮修復(fù)時間、植片透明度、植片遠(yuǎn)期穩(wěn)定性等方面不及新鮮同種異體角膜植片，但生物工程角膜基質(zhì)具有較好的結(jié)構(gòu)替代功能，移植后能夠在人眼長期存活，部分治療性角膜移植患者的視力得到一定程度的改善。在緊急情況下，生物工程角膜可作為同種異體角膜的替代材料，對患者進(jìn)行急診角膜移植。盡管該材料的適用范圍較窄，僅用于藥物治療無效的尚未穿孔的角膜潰瘍，但仍有望在一定程度上緩解角膜供體的缺乏。有學(xué)者[18-20]觀察到移植的豬脫細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)并未出現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞，推測豬角膜基質(zhì)本身并不適合人角膜基質(zhì)細(xì)胞的生長，不能排除豬角膜脫細(xì)胞基質(zhì)存在某些缺陷。由于目前同類研究觀察的樣本量較少，觀察時間較短，其圍手術(shù)期并發(fā)癥的處理以及遠(yuǎn)期預(yù)后及安全性評價還需更大樣本量的長期觀察和研究。

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