凡納濱對蝦急性肝胰腺壞死病致病菌的分離鑒定、藥敏特性及其組織病理學觀察

高曉華，張海強，安 偉

(上海市水產(chǎn)研究所，上海 200433)

凡納濱對蝦()又名南美白對蝦，因其營養(yǎng)豐富、肉味鮮美、生長速度快、適鹽度范圍廣等優(yōu)點，已成為我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種。2020年我國凡納濱對蝦養(yǎng)殖總產(chǎn)量186.3萬t，占對蝦養(yǎng)殖總產(chǎn)量的86.54%，但由于近年來高密度集約化養(yǎng)殖方式，細菌性疾病已對凡納濱對蝦的養(yǎng)殖生產(chǎn)造成嚴重危害，大規(guī)模凡納濱對蝦患病死亡，嚴重制約對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

急性肝胰腺壞死病(Acute hepatopancreatic necrosis disease,AHPND)是目前凡納濱對蝦養(yǎng)殖中的主要細菌性疾病，該病主要感染投放10～40 d左右蝦苗，又稱早期死亡綜合征(Early mortality syndrome,EMS)，患病凡納濱對蝦主要病癥為蝦體變軟，肝胰腺萎縮、顏色發(fā)白，空胃空腸，攝食減少，死亡率高達90%以上，已對中國、菲律賓、墨西哥等多國對蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。研究表明，對蝦急性肝胰腺壞死病是由攜帶了能編碼毒力蛋白和質(zhì)粒的部分弧菌引起的，其毒力蛋白可引起對蝦肝胰腺上皮細胞脫落、壞死、肝胰腺功能障礙，進而導致對蝦急性死亡。已有報道顯示，可引起對蝦急性肝胰腺壞死病的病原菌包括副溶血弧菌()、歐文斯氏弧菌()、哈維氏弧菌()、坎氏弧菌()等。上海市奉賢區(qū)某對蝦養(yǎng)殖場凡納濱對蝦出現(xiàn)大規(guī)模的急性死亡，其臨床表現(xiàn)為肝胰腺發(fā)白、空腸空胃、蝦殼變軟等癥狀，與已報道的急性肝胰腺壞死病臨床癥狀相似。本研究對疑似患急性肝胰腺壞死病的凡納濱對蝦進行病原菌分離鑒定、致病性分析及藥物敏感性試驗，并進一步觀察其肝胰腺組織病理變化，以期為凡納濱對蝦急性肝胰腺壞死病的流行病學研究和藥物防控提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

自然患病凡納濱對蝦樣品采自上海市奉賢區(qū)某對蝦養(yǎng)殖場，體長約3.0～5.0 cm。健康凡納濱對蝦購自上海市某對蝦養(yǎng)殖場，大小均勻，無病無傷，體長約為5.0～7.0 cm，在水族缸內(nèi)暫養(yǎng)7 d，水溫控制在(28±1)℃，24 h充氧，并適量投喂飼料，每天按時吸污、換水，養(yǎng)殖穩(wěn)定后進行人工感染。

1.2 主要試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)、硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(TCBS)均購自北京陸橋技術(shù)有限責任公司；PCR Premix Taq、DNA Marker DL2000、TaKaRa MiniBEST 細菌基因組DNA提取試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司；藥敏紙片、瓊脂(MHA)培養(yǎng)基購自英國Oxoid公司，所有藥敏紙片均于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原菌分離

無菌接種環(huán)蘸取患病凡納濱對蝦的肝胰腺組織，劃線接種于弧菌選擇性培養(yǎng)基TCBS上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h，挑取TCBS培養(yǎng)基上形態(tài)一致的優(yōu)勢菌落，接種至TSA固體培養(yǎng)基上進一步純化，純化后的菌株加入50%甘油溶液，混勻后冷凍保存于-80 ℃冰箱，菌株編號為：FHBX-1。

1.4 人工回歸感染試驗及組織病理觀察

1.4.1 菌懸液的制備

挑取TSA培養(yǎng)基上分離株的單菌落接種至TSB液體培養(yǎng)基中，置于30 ℃恒溫搖床(200 r/min)過夜培養(yǎng)，獲得菌懸液。高速離心菌懸液收集菌體，用無菌生理鹽水重懸，分光光度法測定菌液在OD下的吸光度值，確定菌液濃度。

1.4.2 人工感染試驗

人工感染試驗參照Tran浸泡感染法，將健康凡納濱對蝦隨機分成感染組、對照組，每組10尾，每組設(shè)置3個平行。感染組凡納濱對蝦浸泡于菌液終濃度為1.0×10CFU/mL的人工海水中(鹽度約15‰)，對照組凡納濱對蝦浸泡于無菌人工海水中，浸泡15 min，將浸泡后感染組凡納濱對蝦撈出轉(zhuǎn)入菌液終濃度為1.0×10CFU/mL的10 L人工海水桶中，持續(xù)感染。對照組轉(zhuǎn)入10 L無菌人工海水桶中。試驗周期為7 d，水溫控制在(28±1)℃，24 h充氧，每天正常投喂、吸污、換水，觀察凡納濱對蝦癥狀及統(tǒng)計7 d內(nèi)累計死亡率，并對患病凡納濱對蝦再次進行病原菌分離鑒定。

1.4.3 組織病理觀察

取感染組患病瀕死凡納濱對蝦肝胰腺組織進行病理切片觀察，以健康凡納濱對蝦肝胰腺組織作為對照組。用10%中性緩沖福爾馬林固定液固定48 h，再轉(zhuǎn)移到75%乙醇室溫保存，常規(guī)制備石蠟組織切片，HE染色，光學顯微鏡觀察肝胰腺組織病理變化。

1.5 病原菌鑒定

1.5.1 形態(tài)學及生理生化特征鑒定

將分離株接種于TSA固體培養(yǎng)基上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，對平板上的菌落進行形態(tài)學觀察以及革蘭氏染色，同時按照VITEK2 Compact全自動細菌鑒定儀操作步驟，對分離株進行生理生化鑒定。

1.5.2 分子生物學鑒定

取適量菌懸液，根據(jù)TaKaRa細菌基因組DNA提取試劑盒說明書步驟，提取分離株基因組DNA。以基因組DNA為模板，對分離株進行16S rRNA、弧菌鑒定特異HSP60基因PCR檢測，檢測方法和引物序列參照相應(yīng)來源文獻，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系為25.0 μL，其中PCR Premix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，菌株基因組DNA模板2.0 μL，無菌雙蒸水8.5 μL，并設(shè)無菌雙蒸水為陰性對照模板。PCR擴增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結(jié)果在GenBank中進行BLAST比對分析，并采用MEGAX 軟件中Neighbor-Joining法，基于HSP60基因比對結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，1 000次 Bootstrap重復檢驗，對分離株進行分子鑒定。

1.6 病原菌毒力基因的PCR檢測

以基因組DNA為模板，進行菌株急性肝胰腺壞死病相關(guān)、以及副溶血弧菌的耐熱直接溶血毒素基因和相對耐熱直接溶血毒素基因的PCR檢測，檢測方法和引物序列參照相應(yīng)來源文獻，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系同1.5.2PCR反應(yīng)體系進行，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳(130 V,30 min)，凝膠成像系統(tǒng)下拍照記錄結(jié)果后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結(jié)果在GenBank中進行BLAST比對分析。

表1 引物序列

1.7 病原菌藥敏特性分析

采用(K-B)紙片擴散法，測定分離株對18種抗菌藥物敏感性，參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSL)抗生素敏感試驗標準，分離菌株藥敏結(jié)果用S(敏感)、I(中介)、R(耐藥)進行記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離結(jié)果

從患病凡納濱對蝦肝胰腺中分離獲得一株優(yōu)勢菌，命名為 FHBX-1。該菌株在 TCBS培養(yǎng)基上菌落呈綠色，圓形，中央略微隆起，直徑約2～3 mm；革蘭氏染色呈陰性，菌體呈稍微彎曲的桿狀(圖1)。

圖1 FHBX-1菌株的形態(tài)特征

2.2 病原菌的鑒定結(jié)果

由表2可知，菌株FHBX-1生理生化鑒定結(jié)果與副溶血弧菌對照菌株FJLV01生理生化特征基本一致，且VITEK2 Compact全自動細菌鑒定儀鑒定菌株FHBX-1為副溶血弧菌，可信度高達99%?；?6S rRNA基因序列在GenBank上進行同源性比對分析結(jié)果顯示，該菌株與弧菌屬的副溶血弧菌、哈維氏弧菌、溶藻弧菌相似度超過98%，但菌種無法確定。進一步基于弧菌鑒定特異60基因進行序列比對構(gòu)建系統(tǒng)進化發(fā)育樹顯示，菌株FHBX-1與副溶血弧菌聚為一支，與副溶血弧菌NB1013株(GenBank登錄號：DQ279072.1)進化關(guān)系最近(圖2)。綜合上述結(jié)果以及菌株形態(tài)學特征，可判定菌株FHBX-1為副溶血弧菌。

圖2 基于HSP60基因序列構(gòu)建的菌株FHBX-1與相近菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

表2 菌株FHBX-1的生理生化結(jié)果

2.3 人工回歸感染試驗及組織病理觀察

人工回歸感染試驗，感染組凡納濱對蝦在攻毒感染后出現(xiàn)肝胰腺萎縮、顏色變淺，空腸空胃，蝦體發(fā)白、變軟，攝食減少，活力萎靡等病癥與自然患病凡納濱對蝦病癥基本一致。感染組凡納濱對蝦在感染后第1 d已出現(xiàn)死亡情況，7 d內(nèi)累計死亡率為80%；對照組凡納濱對蝦攝食、活力均正常，未發(fā)生死亡情況。從感染組瀕死凡納濱對蝦肝胰腺組織再次分離的優(yōu)勢細菌與菌株FHBX-1生理生化、分子生物學特征相同，由此判斷菌株FHBX-1是引起凡納濱對蝦發(fā)病死亡的病原菌。取感染組瀕死凡納濱對蝦肝胰腺組織進行病理切片觀察，結(jié)果顯示：健康組凡納濱對蝦肝胰腺組織肝小管結(jié)構(gòu)清晰，肝胰腺上皮細胞排列整齊，可以分辨出分泌細胞(B)、吸收細胞(R)及纖維細胞(F)(圖3A)。感染組凡納濱對蝦肝胰腺組織發(fā)生嚴重的病理變化，肝胰腺上皮細胞排列紊亂，肝小管管腔變大(圖3B)，肝胰腺上皮細胞脫落至管腔內(nèi)(圖3C)，細胞之間界限不清，無法辨認出B、R、F細胞，肝小管結(jié)構(gòu)消失，僅見無結(jié)構(gòu)的組織團(圖3D)，呈典型急性肝胰腺壞死病的病理特征。

圖3 健康凡納濱對蝦與患病凡納濱對蝦的肝胰腺組織病理特征

2.4 病原菌的毒力基因分析

參照HAN等、TEY等文獻方法以及水產(chǎn)行業(yè)標準SC/T 7233-2020(急性肝胰腺壞死病診斷規(guī)程)的套式PCR方法，分離株FHBX-1毒力基因檢測結(jié)果如圖4所示，、以及&基因PCR擴增結(jié)果為均為陽性，條帶大小分別為284 bp、392 bp(圖4A)和230 bp(圖4B)，擴增產(chǎn)物送生工測序，測序結(jié)果經(jīng)BLAST序列同源性比對分析結(jié)果顯示，分別與副溶血弧菌BpShHep18(GenBank登錄號：MH388411.1)的基因序列相似為98.41%、副溶血弧菌R13(GenBank登錄號：MK368635.1)的基因序列相似為96.18%、副溶血弧菌YH3(GenBank登錄號：MH718270.1)的&基因序列相似度為100%。但該分離株耐熱直接溶血毒素基因、相對耐熱直接溶血毒素基因PCR擴增結(jié)果均為陰性。

圖4 菌株FHBX-1毒力基因PCR擴增結(jié)果

A：健康凡納濱對蝦的肝胰腺[肝細胞排列整齊，B-分泌細胞，F(xiàn)-纖維細胞，R-吸收細胞(箭頭)]；B：患病凡納濱對蝦的肝胰腺[箭頭示肝細胞排列紊亂，肝小管管腔變大]；C：患病凡納濱對蝦的肝胰腺[箭頭示肝胰腺上皮細胞脫落至管腔]；D：患病凡納濱對蝦的肝胰腺[箭頭示肝小管結(jié)構(gòu)消失，僅見無結(jié)構(gòu)的組織團]。

2.5 病原菌的藥敏特征

菌株FHBX-1對18種抗菌藥物敏感性試驗結(jié)果如表3所示，菌株FHBX-1對氟苯尼考、多西環(huán)素、恩諾沙星、頭孢他啶、復方新諾明等11種抗菌藥物敏感，對新霉素、紅霉素2種抗生素中介，而對鏈霉素、慶大霉素、氨芐西林、磺胺甲噁唑等5種抗菌藥物耐藥。

表3 菌株FHBX-1藥敏試驗結(jié)果

3 討論

對蝦急性肝胰腺壞死病于2009年首次在中國發(fā)現(xiàn)，隨后在越南、馬來西亞、墨西哥等對蝦主要養(yǎng)殖國家也陸續(xù)暴發(fā)，每年造成全球?qū)ξr養(yǎng)殖經(jīng)濟損失高達十億美元以上，該病已成為阻礙對蝦養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的主要細菌性疾病。相關(guān)研究顯示，急性肝胰腺壞死病的致病菌包括副溶血弧菌、哈維氏弧菌、歐文斯氏弧菌等。本研究從上海市奉賢區(qū)疑似患急性肝胰腺壞死病的凡納濱對蝦肝胰腺組織分離出一株優(yōu)勢菌株，經(jīng)菌株形態(tài)學、生理生化以及分子生物學鑒定確定了該菌株為副溶血弧菌?；?6S rRNA、60基因序列的分析鑒定，表明60基因在弧菌屬細菌具相對的保守性、又有一定種間變異性的特點，較16S rRNA更適合區(qū)分鑒定高相似度弧菌種間的聚類分析。

副溶血弧菌已是我國首要的食源性致病菌，能引起人類急性腹瀉、嘔吐、敗血癥等食物中毒病癥，其、基因常作為人源致病性副溶血弧菌毒力的檢測靶標基因。本研究分離株FHBX-1的、基因PCR檢測結(jié)果均為陰性，與余達勇等在浙江臺州分離獲得的急性肝胰腺壞死病致病性副溶血弧菌株HY3檢測結(jié)果一致。目前國內(nèi)鮮見水產(chǎn)蝦源副溶血弧菌、基因陽性樣品，但國外學者SUJEEWA等、RAHIMI等已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)蝦源副溶血弧菌、基因陽性的菌株。因此，水產(chǎn)蝦源副溶血弧菌、基因攜帶情況仍需持續(xù)關(guān)注，以便準確評估人與蝦共患病的潛在風險。

本研究分離株FHBX-1急性肝胰腺壞死病相關(guān)的毒力基因、的 PCR擴增結(jié)果均為陽性，在菌液濃度為1.0×10CFU/mL人工浸泡感染試驗中，感染組凡納濱對蝦7 d內(nèi)累計死亡率為80%，這與林楠在福州分離獲得的對蝦急性肝胰腺壞死病致病性副溶血弧菌株FJLV01的試驗結(jié)果類似，而與賈丹等從山東濰坊分離獲得的副溶血弧菌株20160303005-1相比毒力較弱。感染組瀕死凡納濱對蝦出現(xiàn)明顯的甲殼變軟，空腸空胃，肝胰腺萎縮等癥狀，且組織病理觀察發(fā)現(xiàn)肝胰腺上皮細胞嚴重脫落，肝小管崩塌,與侯巧利等在舟山觀察患急性肝胰腺壞死病凡納濱對蝦的肝胰腺組織的病理變化相似，呈典型的急性肝胰腺壞死病的病理學特征。上述試驗結(jié)果表明，本研究分離到的副溶血弧菌FHBX-1對凡納濱對蝦有較強的致病力，是引起上海奉賢某對蝦養(yǎng)殖場凡納濱對蝦大量死亡的致病菌。

本研究分離株FHBX-1對氟苯尼考、多西環(huán)素、恩諾沙星、頭孢他啶、復方新諾明等11種抗菌藥物敏感，而對鏈霉素、慶大霉素、氨芐西林、磺胺甲噁唑等5種抗菌藥物耐藥，這與賈丹等分離獲得的凡納濱對蝦源副溶血弧菌株20160303005-1對慶大霉素、阿米卡星、妥布霉素等抗菌藥物敏感，但對阿莫西林、復方新諾明等抗菌藥物耐藥試驗結(jié)果存在明顯差異；與DONG等分離獲得的對蝦源副溶血弧菌株Vp2S01對環(huán)丙沙星、頭孢曲松、諾氟沙星、呋喃妥因等17種抗菌藥物耐藥或中介，僅對氟苯尼考敏感也有不同，說明凡納濱對蝦源副溶血弧菌不同菌株之間藥敏特性存在差異。因此，養(yǎng)殖中對凡納濱對蝦急性肝胰腺壞死病進行藥物防治時需先進行藥物敏性篩選試驗，選擇最敏感的藥物治療，以提高疾病的防治效果，避免藥物的過量濫用情況。此外，由于急性肝胰腺壞死病在國內(nèi)對蝦養(yǎng)殖場頻頻暴發(fā)且有持續(xù)流行和擴大趨勢，建議養(yǎng)殖戶購苗時做好該病篩查，盡量選購無特定病原體的SPF蝦苗，為養(yǎng)殖后期的穩(wěn)產(chǎn)穩(wěn)收提供基礎(chǔ)保障。