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    腹腔注射葡萄糖對(duì)大口黑鱸血糖穩(wěn)態(tài)和糖代謝關(guān)鍵酶活性的影響

    2022-05-25 07:16:06趙柳蘭劉昌勇唐小鴻胡一帆
    淡水漁業(yè) 2022年3期
    關(guān)鍵詞:大口糖原高糖

    廖 磊,劉 浩,趙柳蘭,劉 巧,黃 瑞,劉昌勇,唐小鴻,胡一帆,楊 淞

    (四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,成都 611130)

    糖類(lèi)(碳水化合物)是魚(yú)類(lèi)的重要能源物質(zhì)之一,飼料中添加適宜水平的糖有利于節(jié)約蛋白質(zhì),降低飼料成本,促進(jìn)魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)。但多數(shù)魚(yú)類(lèi)對(duì)糖的利用能力有限,特別是肉食性魚(yú)類(lèi)。大口黑鱸()是典型的肉食性魚(yú)類(lèi),在中國(guó)和許多其他國(guó)家都是重要的養(yǎng)殖淡水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)。大口黑鱸的人工養(yǎng)殖受全球水產(chǎn)動(dòng)物飼料生產(chǎn)趨勢(shì)的影響,例如使用高水平的碳水化合物和脂肪以減少飼料中昂貴的蛋白質(zhì)含量。為探求魚(yú)類(lèi)對(duì)糖類(lèi)的利用能力,診斷人類(lèi)糖尿病的糖耐量實(shí)驗(yàn)已被運(yùn)用于多種魚(yú)類(lèi)的營(yíng)養(yǎng)研究中,如鯉()、羅非魚(yú)()和大黃魚(yú)()等。研究發(fā)現(xiàn)大口黑鱸攝食高糖飼料會(huì)出現(xiàn)代謝紊亂、肝組織損傷和損害腸道健康等現(xiàn)象。因此,探討大口黑鱸對(duì)葡萄糖的耐受能力具有一定的生產(chǎn)意義。

    眾所周知,葡萄糖的代謝包括分解代謝和合成代謝過(guò)程。魚(yú)類(lèi)消化吸收后開(kāi)始從糖酵解途徑利用膳食中的碳水化合物,并通過(guò)三羧酸循環(huán)產(chǎn)生能量。過(guò)量的葡萄糖也可能通過(guò)糖異生過(guò)程轉(zhuǎn)化為糖原。在體內(nèi),能量代謝物(例如葡萄糖,丙酮酸和乳酸等)處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài),且受主要飼料營(yíng)養(yǎng)成分調(diào)節(jié);已經(jīng)證明調(diào)節(jié)葡萄糖和脂質(zhì)代謝途徑的關(guān)鍵酶對(duì)飲食中碳水化合物的攝入有反應(yīng)。因此了解高糖負(fù)荷是否影響葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程和葡萄糖代謝酶的活性,是闡釋大口黑鱸對(duì)糖利用能力必不可少的步驟。

    本研究以大口黑鱸為研究對(duì)象,通過(guò)腹腔注射高濃度葡萄糖溶液,測(cè)定0~48 h過(guò)程中血糖濃度、肝臟和肌肉中糖代謝相關(guān)酶的活性和物質(zhì)含量,并檢測(cè)肝臟中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)因子的基因表達(dá),以闡釋大口黑鱸對(duì)糖的利用能力。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    試驗(yàn)所用大口黑鱸購(gòu)自眉山市洪氏水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng),在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)2周后,挑選96尾健康、體質(zhì)強(qiáng)壯、體質(zhì)量(165.42±5.45)g的大口黑鱸作為試驗(yàn)魚(yú)。使用0.8%生理鹽水將分析純葡萄糖溶解為400 mg/mL濃度的葡萄糖溶液用于腹腔注射,配置后經(jīng)過(guò)高壓蒸汽滅菌后,冷藏于4 ℃冰箱中備用。

    1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與取樣

    將禁食24 h的96尾魚(yú)隨機(jī)分到容積為(120 cm×40 cm×21 cm)的6個(gè)水族箱內(nèi),對(duì)照組(C組)、實(shí)驗(yàn)組(G組)各設(shè)3個(gè)重復(fù),每個(gè)水族箱16尾魚(yú)。G組腹腔注射2 g/kg體重葡萄糖溶液;為了確保兩個(gè)組的注射量相同,C組注射相同劑量的生理鹽水。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中水環(huán)境如下:溫度,(20.0±0.5)℃;pH 7.5±0.2;溶解氧(DO)>(7.0±0.2)mg/L;氨氮和亞硝酸鹽<0.02 mg/L。

    在注射前(0 h)和注射后1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h進(jìn)行采樣,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別從C組和G組中各取6尾魚(yú),用MS-222(濃度為50.0 mg/L)麻醉后采取血液、肝臟和肌肉樣品。血液樣品先用肝素鈉抗凝,室溫靜置30 min,再離心10 min(2 500 r/min),收集上層血漿。肝臟和肌肉樣品經(jīng)液氮冷凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存待測(cè)。

    1.3 生化指標(biāo)測(cè)定

    將-80 ℃保存的血漿、肝臟和肌肉組織于冰上解凍,肝臟解凍后加入9倍體積的0.8%預(yù)冷生理鹽水(組織∶生理鹽水=1∶9),在1.5 mL離心管中使用碾磨器充分研磨,然后在4 ℃,2 500 r/min條件下離心10 min,取上清液進(jìn)行檢測(cè)。所有生化檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所,并按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作,利用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)定指標(biāo)及試劑盒貨號(hào)見(jiàn)表1。

    表1 生化檢測(cè)試劑盒信息

    1.4 RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR

    用動(dòng)物總RNA提取試劑盒(Cat.No.re03011,福際生物,成都)從肝臟中提取總RNA,使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。用RT EasyTM II(with gDNase)試劑盒(CAT No.Rt-01031,福際生物)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用real-time PCR試劑盒EASYTm-SYbr Green I(Cat.No.Qp-01011,福際生物)檢測(cè)mRNA表達(dá)水平。本試驗(yàn)所用引物和定量PCR的步驟參照已發(fā)表的文章,引物信息見(jiàn)表2。目的基因用內(nèi)參基因β-actin的幾何平均值進(jìn)行歸一化,目的基因的相對(duì)表達(dá)量采用2法計(jì)算。

    表2 熒光定量PCR引物信息

    1.5 統(tǒng)計(jì)分析

    實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示(=6),利用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,先對(duì)數(shù)據(jù)作單因素方差分析(One-Way ANOVA);若統(tǒng)計(jì)結(jié)果有顯著差異,再進(jìn)行Tukey進(jìn)行多重比較,<0.05表示差異顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 大口黑鱸血糖、糖原和乳酸含量變化

    在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,各組均無(wú)死亡。血糖水平變化如圖1(a)所示,注射生理鹽水的大口黑鱸血糖維持在一個(gè)較低且穩(wěn)定的水平;而注射葡萄糖之后,大口黑鱸血糖水平隨著時(shí)間推移呈先上升后下降的趨勢(shì),且在1~24 h的各個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均顯著高于C組,直至48 h恢復(fù)至基礎(chǔ)水平。肝臟和肌肉中糖原含量變化如圖1(b,c)所示,C組和G組大口黑鱸肝糖原含量均現(xiàn)呈先上升后下降的趨勢(shì),但G組含量上升趨勢(shì)較大且始終高于C組,在12 h和48 h時(shí)間點(diǎn)顯著高于C組。兩組的肌糖原變化趨勢(shì)較小,且兩組之間始終無(wú)顯著差異。由圖1(d,e,f)可知,注射葡萄糖后,血液、肝臟和肌肉中乳酸含量均發(fā)生了一定程度的升高;其中G組血液中乳酸含量在24 h和48 h時(shí)間點(diǎn)顯著高于C組,肝臟中乳酸含量在1 h顯著高于C組,肌肉乳酸含量持續(xù)升高且在24 h顯著高于C組。

    圖1 注射葡萄糖對(duì)大口黑鱸血糖、糖原和乳酸含量影響

    2.2 大口黑鱸糖代謝酶活性的變化

    肝臟和肌肉中糖代謝酶活性變化如圖2所示。注射葡萄糖后,肝臟和肌肉中糖酵解酶(HK和PK)活性都呈現(xiàn)了先上升后下降的趨勢(shì),并且在一些時(shí)間點(diǎn)顯著高于C組。C組肝臟的PEPCK活性呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì),但變化幅度較??;G組肝臟的PEPCK活性在1 h顯著上升,然后持續(xù)下降并且在12 h顯著低于C組。由圖2(f,g)可知,注射葡萄糖造成了肝臟和肌肉組織中Na-K-ATP酶的活性顯著升高。

    圖2 注射葡萄糖對(duì)大口黑鱸糖代謝酶活性影響

    2.3 大口黑鱸肝臟AMPKα和Glut基因的表達(dá)

    大口黑鱸肝臟和基因的表達(dá)情況如圖3所示??偟膩?lái)說(shuō),C組和G組的相對(duì)表達(dá)量均呈現(xiàn)了先上升后下降的趨勢(shì);在2~24 h期間,G組的表達(dá)量幾乎都低于C組,且在2 h具有顯著差異。在注射后2 h至試驗(yàn)結(jié)束期間,G組Glut1的相對(duì)表達(dá)量始終低于C組,且在24 h差異顯著。兩組Glut4的表達(dá)量則先升高后降低,G組變化趨勢(shì)高于C組,且在2 h達(dá)到最高。

    圖3 注射葡萄糖對(duì)大口黑鱸肝臟AMPKα和Glut基因表達(dá)的影響

    3 討論

    3.1 注射葡萄糖對(duì)大口黑鱸血糖穩(wěn)態(tài)和糖原積累的影響

    不同魚(yú)類(lèi)利用膳食碳水化合物作為能量來(lái)源的能力各不相同,肉食性魚(yú)類(lèi)的利用能力一般低于雜食性和草食性魚(yú)類(lèi)。葡萄糖耐量試驗(yàn)被廣泛用于評(píng)價(jià)魚(yú)類(lèi)利用碳水化合物的能力,而血糖水平是魚(yú)體內(nèi)糖代謝和生理功能狀況的一個(gè)重要指標(biāo),能反映糖類(lèi)吸收狀況。本實(shí)驗(yàn)中,在注射之前,大口黑鱸被禁食24 h以恢復(fù)本研究中的基礎(chǔ)血糖水平;同時(shí),注射生理鹽水后的大口黑鱸血糖水平變化較小,表明注射過(guò)程和時(shí)間變化對(duì)大口黑鱸血糖穩(wěn)態(tài)的影響較小。注射2 g/kg葡萄糖的大口黑鱸血糖升高持續(xù)了24 h以上,在48 h時(shí)檢測(cè)到恢復(fù)至基礎(chǔ)水平。已有的研究顯示,雜食性魚(yú)類(lèi)吉富羅非魚(yú)()在腹腔注射2 g/kg葡萄糖后,高血糖持續(xù)6 h以上;暗紋東方鲀()在腹腔注1 g/kg葡萄糖后,高血糖會(huì)持續(xù)9 h。肉食性魚(yú)類(lèi)虹鱒()在腹腔注射1 g/kg和0.3 g/kg葡萄糖后,高血糖分別持續(xù)24 h和18 h;歐洲海鱸()在腹腔注射1 g/kg葡萄糖后血糖水平上升直到12 h恢復(fù)到基礎(chǔ)水平。從血糖升高情況來(lái)看,本實(shí)驗(yàn)中血糖水平在8 h達(dá)到最大值,而其他魚(yú)類(lèi)上的研究顯示,沙重牙鯛()在腹腔注射1 g/kg葡萄糖后血糖在2 h達(dá)到峰值。由此可知,與大多數(shù)肉食性魚(yú)類(lèi)一樣,大口黑鱸糖耐受能力較差,對(duì)血液中葡萄糖的清除能力弱,從而表現(xiàn)為持續(xù)的高血糖。Na-K-ATP酶是一種水解酶,水解時(shí)釋放能量,可推動(dòng)細(xì)胞膜上葡萄糖載體的開(kāi)動(dòng),推動(dòng)葡萄糖等物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸。葡萄糖的運(yùn)輸雖然并不直接利用ATP,但間接利用Na-K泵產(chǎn)生的離子梯度所提供的能量進(jìn)行協(xié)同運(yùn)輸,葡萄糖可利用離子梯度,通過(guò)專(zhuān)一的運(yùn)輸載體,伴隨Na運(yùn)輸入細(xì)胞。本研究中,注射葡萄糖后肝臟中Na-K-ATP酶活力在除8 h外其他時(shí)間點(diǎn)均顯著高于對(duì)照組,肌肉中除2 h和4 h外也都顯著高于對(duì)照組。這表明大口黑鱸可通過(guò)增強(qiáng)Na-K-ATP酶活力來(lái)推動(dòng)葡萄糖的跨膜運(yùn)輸,促進(jìn)血液中葡萄糖進(jìn)入組織,從而降低血糖。

    通常,攝入后暫時(shí)未利用的葡萄糖也可以轉(zhuǎn)化為糖原儲(chǔ)存,其中肝糖原的合成與分解主要是為了維持血糖濃度的相對(duì)恒定,而肌糖原的合成與分解主要是為肌肉提供ATP。已有報(bào)道顯示,魚(yú)類(lèi)在攝食高糖飼料之后,魚(yú)體會(huì)表現(xiàn)出較高的肝糖原水平。對(duì)軍曹魚(yú)()和虹鱒等實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)肝糖原含量先上升后下降,未引起肌糖原的明顯增加。本研究發(fā)現(xiàn),大口黑鱸在注射高濃度葡萄糖后,肝糖原含量逐漸上升至12 h達(dá)最高水平,然后開(kāi)始下降,肌糖原變化不顯著。這表明大口黑鱸在攝入高糖后能夠?qū)⑻妓衔镛D(zhuǎn)化為肝糖原進(jìn)行能量?jī)?chǔ)存和代謝。在魚(yú)類(lèi)中,當(dāng)組織能量物質(zhì)沒(méi)有通過(guò)有氧呼吸或氧不足發(fā)揮作用時(shí),乳酸濃度會(huì)上升。研究表明,隨著飼料中碳水化合物含量的增加,糖代謝會(huì)逐漸增強(qiáng),產(chǎn)生更多的丙酮酸,不可避免地會(huì)消耗更多的氧氣,從而造成無(wú)氧呼吸增加,乳酸含量增加。本研究中,注射葡萄糖后,肝臟乳酸含量在1 h顯著增加,同時(shí)血液和肌肉中乳酸含量呈現(xiàn)了上升趨勢(shì),這表明葡萄糖負(fù)荷促進(jìn)了大口黑鱸乳酸的生成。

    3.2 注射葡萄糖對(duì)大口黑鱸糖酵解和糖異生酶活性的影響

    魚(yú)類(lèi)同其他動(dòng)物一樣,糖酵解過(guò)程是其主要的葡萄糖代謝途徑,HK和PK酶是糖酵解過(guò)程中的限速酶。本研究中,注射葡萄糖后,大口黑鱸肝臟和肌肉組織中兩種酶的酶活性都呈現(xiàn)了先上升后下降的趨勢(shì)。在其他魚(yú)類(lèi)上的研究顯示,大黃魚(yú)和鯉魚(yú)在葡萄糖注射后,HK酶活性先增大后減少;羅非魚(yú)注射葡萄糖后,HK酶活性沒(méi)有顯著變化;以上的結(jié)果表明了HK酶在糖酵解過(guò)程中的關(guān)鍵性地位,葡萄糖注射會(huì)提高HK活力。PK是促進(jìn)丙酮酸生成的關(guān)鍵酶,研究表明飼料中碳水化合物的比例會(huì)對(duì)PK的活性具有一定的影響。青魚(yú)()肝胰臟和肌肉部位中PK活性會(huì)隨著飼料中糖類(lèi)的增加而顯著提高;鯉魚(yú)在注射葡萄糖后血漿中的PK活性呈先上升后下降的趨勢(shì)。本研究結(jié)果與以上報(bào)道基本一致,表明高糖負(fù)荷促進(jìn)了大口黑鱸糖酵解酶HK和PK活性的上升,從而加強(qiáng)了糖酵解過(guò)程。

    在健康的條件下,肝臟也可以通過(guò)抑制肝臟糖異生來(lái)處理葡萄糖負(fù)荷。PEPCK能催化草酰乙酸脫羧轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿嵯┐际奖?,是糖異生途徑的關(guān)鍵限速酶。多項(xiàng)研究表明糖尿病患者的肝臟糖異生關(guān)鍵酶PEPCK表達(dá)量均明顯升高,這表明控制PEPCK酶活性對(duì)維持正常血糖水平有著重要意義。魚(yú)類(lèi)上的研究發(fā)現(xiàn),暗紋東方鲀?cè)谧⑸淦咸烟呛螅琍EPCK活性呈現(xiàn)不規(guī)律變化,在4、8 h顯著升高,其余時(shí)間點(diǎn)無(wú)顯著差異;葡萄糖注射對(duì)羅非魚(yú)肝臟中PEPCK的表達(dá)和酶活性均未造成顯著影響。與以上結(jié)果相似,本研究中注射葡萄糖的大口黑鱸肝臟PEPCK活性呈現(xiàn)無(wú)規(guī)律變化,在1、24 h顯著升高,其余時(shí)間點(diǎn)均低于對(duì)照組但無(wú)顯著差異,這表明大口黑鱸不能有效地處理葡萄糖負(fù)荷。以往研究也報(bào)道了肉食性魚(yú)類(lèi)不能有效調(diào)節(jié)其糖異生,這被認(rèn)為是其糖耐量能力較低的主要原因之一。

    3.3 注射葡萄糖對(duì)大口黑鱸葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

    AMP活化蛋白激酶(AMPK)是一種作為能量傳感器的關(guān)鍵酶,當(dāng)細(xì)胞中ATP/AMP比值降低時(shí),該酶會(huì)被激活。作為營(yíng)養(yǎng)感應(yīng)傳導(dǎo)分子,AMPK激活對(duì)糖代謝調(diào)節(jié)的影響是重要的,可調(diào)控葡萄糖吸收、糖原代謝、糖異生和脂肪生成過(guò)程。在大鼠腎小球系膜細(xì)胞發(fā)現(xiàn),高糖孵育造成了其總AMPKα蛋白和磷酸化AMPKα蛋白表達(dá)水平均低。本研究中,注射葡萄糖造成了的mRNA水平下調(diào),這可能是由于葡萄糖攝入后ATP生成量增加了,從而下調(diào)了基因表達(dá)。因?yàn)锳MPK活化對(duì)營(yíng)養(yǎng)代謝調(diào)節(jié)的總方向是抑制ATP消耗過(guò)程,促進(jìn)ATP的生成反應(yīng)。

    肝臟和血液中葡萄糖濃度保持平衡是由于多種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的存在,它們介導(dǎo)了一個(gè)雙向的、能量獨(dú)立的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(Glut)轉(zhuǎn)移率的提高是AMPK發(fā)揮促進(jìn)葡萄糖吸收的重要原因,Glut l和Glut 4在生物體中廣泛分布,參與轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖,其中Glut l被認(rèn)為是種葡萄糖傳感器。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)羅非魚(yú)餐后血糖水平升高時(shí),1~3 h肝臟1和2的表達(dá)均降低;另外的研究報(bào)道了羅非魚(yú)肌肉中4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量在注射葡萄糖后3 h開(kāi)始升高,在12 h時(shí)達(dá)到最高。在本研究中,注射葡萄糖的大口黑鱸肝臟1 mRNA的表達(dá)水平始終低于對(duì)照組,4先升高后降低。因此,我們推測(cè)肉食性大口黑鱸4表達(dá)上調(diào)可能參與了肝臟葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn),而被高糖水平抑制。

    4 結(jié)論

    總的來(lái)說(shuō),作為肉食性魚(yú)類(lèi)的大口黑鱸對(duì)葡萄糖的耐受能力較低,表現(xiàn)為對(duì)血液中葡萄糖的清除能力弱。在高糖負(fù)荷條件下,糖酵解過(guò)程被加強(qiáng),也促進(jìn)了乳酸和糖原的生成。然而糖異生途徑的關(guān)鍵酶PEPCK活性不能被高濃度葡萄糖抑制,這可能導(dǎo)致內(nèi)源性葡萄糖不斷被合成而使大口黑鱸血糖持續(xù)偏高。此外,Na-K-ATP酶、AMPKα和Glut4可能參與了高糖負(fù)荷條件下的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn),這對(duì)血糖的穩(wěn)態(tài)具有重要意義。

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