Ndfip2表達對肝癌細胞增殖和凋亡的影響及機制*

張強， 羅彩云， 孫達權， 曾志銳， 鄭志菊， 徐國強,3**

(1.貴州醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院， 貴州 貴陽 550025； 2.貴陽市第二人民醫(yī)院 手術室， 貴州 貴陽 550023； 3.貴州醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院 醫(yī)學研究中心， 貴州 都勻 558000)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是常見的原發(fā)性肝癌，也是癌癥相關死亡的第二大主要原因[1-3]。手術切除是根治性治療肝癌最常見的方法，但是術后5年生存率并不理想，根本原因在于手術切除后腫瘤復發(fā)和遠處轉移的幾率很高[4-5]。因此，更好地了解肝癌增殖及凋亡的分子機制對預防肝癌細胞的復發(fā)與轉移具有重要意義。Nedd4家族交互作用蛋白2(nedd4 family interacting protein 2,Ndfip2)是Nedd4家族交互作用蛋白中的一員,可與Nedd4家族蛋白的 WW 結構域結合，能夠激活E3泛素蛋白連接酶中Nedd4家族成員[6]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，Ndfip2通過PTEN/Akt信號通路、MAP激酶信號通路等調控細胞的增殖和轉移等生物學行為[7-8]，然而Ndfip2基因對肝癌細胞生物學行為的影響仍舊不清楚。因此，為了進一步探究Ndfip2對肝癌細胞增殖和凋亡能力的影響，本實驗通過沉默Ndfip2在肝癌細胞SMMC-7721和HepG2中的表達，觀察Ndfip2低表達對肝癌細胞增殖和凋亡能力的影響，探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑

人正常肝細胞株LO2、人肝癌細胞株SMMC-7721、HepG2購自中國科學院昆明細胞庫， RPMI-1640培養(yǎng)基和青-鏈霉素購自美國HyClone公司，新生牛血清(FBS) 購自四季青公司，二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司，Ndfip2-siRNA序列由上海吉瑪基因公司合成。LipofectamineTM 2000購自美國Invitrogen公司，SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自北京索萊寶生物公司，BCA蛋白濃度定量試劑盒購自上海碧云天生物技術公司，RIPA裂解液和PMSF酶抑制劑購自武漢博士德生物公司，PVDF膜購自Millipore公司，高敏ECL曝光液購自上海碧云天生物技術公司，兔抗人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN)多克隆抗體購自美國Abcam公司，兔抗人Nedd4家族交互作用蛋白2(nedd4 family interacting protein 2，Ndfip2)多克隆抗體購自美國Affinity公司，兔抗人磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)、兔抗人磷酸化Akt (Ser473) [phospho-Akt(Ser473)，p-Akt(S473)]、兔抗人蛋白激酶B(protein kinase B，PKB、又稱為Akt) 、兔抗人基質金屬蛋白酶1(matrix metalloproteinase 1, MMP-1)、兔抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、鼠抗人Bcl2關聯(lián)X蛋白(Bcl2-associated X protein，Bax) 、兔抗人B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl2)多克隆抗體購自武漢三鷹公司，兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)多克隆抗體購自巴傲得生物科技有限公司，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔、山羊抗鼠IgG(二抗)購自武漢三鷹公司，CCK-8試劑購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人正常肝細胞株LO2、人肝癌細胞株SMMC-7721及HepG2，在37 ℃、5%培養(yǎng)箱內常規(guī)培養(yǎng)，當細胞融合率70%～80%時，用0.25%胰酶消化并傳代、進行后續(xù)的實驗，此3種細胞均為貼壁生長。

1.2.2si-RNANdfip2沉默細胞株的構建 將細胞按1×106個/孔，鋪于12孔板待長到50%～70%時對細胞進行瞬時轉染，轉染前2 h將12孔換成新鮮無血清RPMI-1640培養(yǎng)基，取siRNA(1D)，瞬時離心后加入125 μL DEPC處理水配成工作溶液。取兩個1.5 mL離心管，一管加入4 μL Lipo2000與200 μL 無血清RPMI-1640培養(yǎng)基后混勻，另一管加入4 μL siRNA與無血清200 μL RPMI-1640培養(yǎng)基后混勻、室溫靜置5 min；混勻上述兩個離心管中的液體，室溫靜置20 min，實驗組中每孔各加入204 μL混合液，然后每孔補充796 μL 無血清RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后換成含20 % FBS的新鮮RPMI-1640培養(yǎng)基，轉染完成后，采用蛋白印跡法檢測轉染效率。Ndfip2特異性si-RNA的正義鏈序列為5′-GGAAGAGUGUCCACCAACATT-3′，反義鏈序列為5′-UCUUGGUGGACACUCU- UCCTT-3′，陰性對照的正義鏈序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′，反義鏈序列為5′-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3′。

1.2.3實驗分組 SMMC-7721細胞分為Ndfip2-siRNA沉默對照組(NC)和Ndfip2沉默組(si-Ndfip2)，HepG2細胞分為Ndfip2-siRNA沉默對照組(NC)和Ndfip2沉默組(si-Ndfip2)。

1.2.4CCK-8實驗檢測肝癌細胞的增殖能力 將轉染完成的各組細胞按每孔5×103個細胞懸液接種于96 孔板中，使用CCK-8 試劑盒檢測細胞增殖，每組3個或以上復孔，在0、24、48 h時分別按照試劑說明書加入CCK-8試劑，37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h后酶標儀檢測各組細胞450 nm處的吸光度。計算細胞增殖率，細胞增殖率(%)=[(實驗孔-空白孔)/(對照孔-空白孔)] ×100%。

1.2.5平板克隆形成實驗檢測肝癌細胞的增殖能力 將轉染完成的各組細胞接種于6孔板，每孔細胞為1 000個，常規(guī)培養(yǎng)10～12 d，當出現(xiàn)肉眼可見的克隆集落時終止培養(yǎng)；棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖洗1～2次，加入4%多聚甲醛溶液固定細胞15 min，然后用0.1%結晶紫溶液染色20 min；棄去染料，用PBS進行沖洗，在自然光狀態(tài)下拍照、并進行計數(shù)統(tǒng)計分析。

1.2.6流式細胞術檢測肝癌細胞凋亡能力 將轉染完成的各組細胞用不含EDTA的胰酶消化后，進離心2 000 r/min 、4 ℃ 5 min；棄去上清液，用預冷的PBS洗滌細胞兩次，每次洗滌后4 ℃離心2 000 r/min 5 min；收集細胞，用移液槍吸盡PBS，然后加入100 μL的1×Binding buffer，將細胞重懸，接著依次加入Annexin V-FITC 5 μL和PI Staining Solution 10 μL，輕輕震蕩混勻。避光，反應約15 min，最后加入1×Binding buffer 400 μL、混勻并放置于冰上，流式細胞儀分析各組細胞的凋亡能力。

1.2.7蛋白印跡法(Western blot)檢測肝癌細胞中Ndfip2、凋亡相關蛋白(Caspase3、Bax、Bcl2)以及PTEN-PI3K/Akt通路蛋白[PTEN、PI3K、Akt、p-Akt(S473)、MMP1]的表達 收集各組細胞，經RIPA裂解液裂解，使用BCA定量法進行定量，配制10%的SDS-PAGE凝膠進行電泳，每孔蛋白上樣量為10 μL；后將蛋白轉至PVDF膜，37 ℃、5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，洗膜(1×TBST，3次，5 min/次)，二抗[辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔(稀釋度均為1 ∶2 000)]室溫孵育2 h，洗膜，在膜上均勻鋪上曝光液ECL，在凝膠成像系統(tǒng)內測定結果；用Quantity One系統(tǒng)分析目的條帶并獲取目的條帶的灰度值進行分析。本實驗使用GAPDH作為蛋白質標準化的內參，用目的蛋白的灰度值與內參蛋白的灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量，p-Akt(S473)蛋白相對表達量為p-Akt(S473)蛋白條帶灰度值與總Akt蛋白條帶灰度值的比值。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 Ndfip2的表達水平

結果顯示，與正常肝細胞LO2組比較，Ndfip2在肝癌細胞SMMC-7721組、HepG2組中表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：(1)與LO2組比較，P<0.05。圖1 Ndfip2在正常肝細胞LO2、肝癌細胞株SMMC-7721和HepG2組中的表達Fig.1 Ndfip2 expression levels in normal liver cell line LO2, HCC lines SMMC-7721, and HepG2

2.2 Ndfip2 siRNA轉染肝癌細胞株

結果顯示，si-Ndfip2組SMMC-7721和HepG2細胞中的Ndfip2的表達水平較NC組細胞下調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示Ndfip2低表達肝癌細胞構建成功。見圖2。

注：(1)與NC組比較，P<0.05。圖2 構建Ndfip2低表達細胞株Fig.2 Construction of silencing Ndfip2 expression in HCC lines

2.3 沉默Ndfip2對肝癌細胞增殖能力的影響

CCK-8實驗(圖3A)結果顯示，與NC組比較，48 h時SMMC-7721和HepG2細胞si-Ndfip2組D值均明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。平板克隆形成實驗(圖3B、C)結果顯示，si-Ndfip2組的SMMC-7721和HepG2細胞克隆形成數(shù)低于NC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

注:A為CCK-8實驗結果，B、 C為平板克隆形成實驗結果；(1)與NC組比較，P<0.05。圖3 沉默Ndfip2對肝癌細胞增殖能力的影響Fig.3 Effect of silencing Ndfip2 on HCC proliferation

2.4 沉默Ndfip2對肝癌細胞凋亡率及凋亡相關蛋白的影響

流式細胞儀(圖4A、B)結果表明，與NC組比較，si-Ndfip2組細胞凋亡率上升，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Western blot(圖4C、D、E、F)結果顯示，與NC組比較，si-Ndfip2組中Caspase3和Bax蛋白表達量上調，而Bcl2表達下調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

注：A為兩組細胞凋亡水平結果，B為兩組細胞凋亡水平定量結果，C、E為條帶灰度結果，D、F為相對定量結果；(1)與NC組比較，P<0.05。圖4 沉默Ndfip2對肝癌細胞凋亡率及凋亡相關蛋白的影響Fig.4 Effect of silencing Ndfip2 on the apoptosis rate and the expression levels of apoptosis-related proteins in HCC lines

2.5 沉默Ndfip2對肝癌細胞中PTEN-PI3K/Akt信號通路的影響

Western blot(圖5)結果顯示，與NC組比較，si-RNA組SMMC-7721和HepG2細胞中的PI3K、p-Akt(S473)和MMP1蛋白表達水平下調，而PTEN水平則升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

注：A、C為條帶灰度結果，B、D為相對定量結果；(1)與NC組比較， P<0.05。圖5 沉默Ndfip2對肝癌細胞中PTEN-PI3K/Akt信號通路的影響Fig.5 Effect of silencing Ndfip2 on PTEN-PI3K/Akt signaling pathway in HCC lines

3 討論

肝癌是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一，目前來說肝移植是治療肝癌的主要方法，但是術后高復發(fā)率和轉移率嚴重影響其治療效果[9]。隨著生物信息學等相關學科的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了很多與術后肝癌復發(fā)和轉移的生物分子標記物，對此類分子標記物的研究有助發(fā)發(fā)現(xiàn)新的靶點，為肝癌的治療提供新的思路與方向[10-12]。近年來，泛素化的研究受到廣大研究者的關注，其中HECT型E3泛素連接酶由于其固有的酶促活性，以及能夠特異性識別蛋白底物而受到廣泛研究[13-14]，例如HECT型E3泛素連接酶的典型代表Nedd4亞家族，研究發(fā)現(xiàn)該家族成員在晚期胃癌、肺癌中均發(fā)生過表達，對腫瘤的生長與發(fā)展產生了重要的影響[15-16]。Ndfip2，全稱Nedd4家族相互作用蛋白2，是一種參與泛素化的多功能蛋白，因其可與Nedd4特異性結合，所以在泛素化過程中作為Nedd4蛋白家族成員的激活蛋白而存在[17]。最新研究發(fā)現(xiàn)NEDD4可通過下調胰腺癌細胞中PTEN的表達來抑制細胞凋亡，同樣在肝癌細胞中NEDD4通過調節(jié)LATS1(Hippo通路的腫瘤抑制因子)而促進肝癌細胞的增殖，抑制肝癌細胞的凋亡[18]。實驗通過CCK-8、平板克隆實驗和流式細胞術等實驗研究發(fā)現(xiàn)沉默Ndfip2可以抑制肝癌細胞的增殖能力，促進其凋亡能力，提示Ndfip2可能促進肝癌細胞的增殖，抑制肝癌細胞的凋亡。

PI3K/Akt信號通路是調節(jié)多種生物過程信號傳導的重要途徑，例如細胞生長、增殖和凋亡[19-20]。磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)是一種腫瘤抑制因子，也是PI3K的主要拮抗劑，研究發(fā)現(xiàn)在多種人類腫瘤中PTEN的缺失或失活將導致PI3K /Akt信號轉導過快，從而驅動腫瘤的發(fā)生，因此也被描述為癌癥的動力途徑之一[21-23]。Mund等[7]研究發(fā)現(xiàn)，Ndfip2能夠通過調控PTEN而影響PI3K/Akt信號通路，最終影響細胞的增殖和凋亡活動。研究發(fā)現(xiàn)在肝癌細胞SMMC-7721和HepG2中，沉默Ndfip2使得PI3K、p-Akt(S473)蛋白表達顯著降低，而PTEN表達水平則顯著升高，提示在肝癌細胞中，沉默Ndfip2可以抑制PTEN-PI3K/Akt信號通路的活化。凋亡機制的缺失也是導致腫瘤發(fā)生的重要因素之一， Bcl2、Bax和Caspase3是關系密切的3個凋亡相關蛋白，其中抗凋亡基因Bcl2與促凋亡基因 Bax均為Bcl2家族蛋白成員，Caspase3則作為凋亡執(zhí)行者而存在，參與多種因素誘導的凋亡[24-25]。流式細胞術結果發(fā)現(xiàn)當在肝癌細胞SMMC-7721和HepG2中中沉默Ndfip2時，Caspase3和Bax蛋白表達顯著上升，而Bcl2卻顯著下降，提示沉默Ndfip2而導致肝癌細胞SMMC-7721和HepG2凋亡能力的提升，可能與Bcl2/Bax通路有關。

綜上所述，沉默Ndfip2能夠顯著抑制肝癌細胞SMMC-7721和HepG2的增殖能力，促進其細胞的凋亡能力，其機制可能PTEN-PI3K/Akt的失活有關，這有助于能夠更好地理解肝癌的發(fā)展和轉移過程，為肝癌的臨床治療提供一定的理論基礎。