RANK基因2個(gè)SNP位點(diǎn)多態(tài)性與貴州燃煤污染型地氟病患病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性*

趙安宿， 田薇， 李瑞超， 喻艷琴， 王嬋娟， 張婷， 吳昌學(xué)*， 何燕*

(貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 & 貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

氟是一種常見(jiàn)的微量元素,參與人體生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)，人體每日攝入適量的氟,可促進(jìn)牙齒和骨骼的發(fā)育,預(yù)防齲齒[1]；但是氟過(guò)量也會(huì)導(dǎo)致人體中毒,嚴(yán)重者甚至?xí)?duì)人的生命健康造成威脅，產(chǎn)生以骨骼病變?yōu)橹鞯牡胤叫约膊2-3]。根據(jù)氟化物的來(lái)源，地方性氟中毒分為飲水型氟中毒、飲茶型氟中毒、燃煤污染型氟中毒[4-6]，其中燃煤污染型地方性氟中毒(簡(jiǎn)稱燃煤型地氟病)是由于居民長(zhǎng)期在室內(nèi)使用高氟煤取暖、烘烤食物，導(dǎo)致人體氟攝入過(guò)量引發(fā)的全身性慢性疾病[7]。研究發(fā)現(xiàn)，氟具有很強(qiáng)的親骨性，適量氟能促進(jìn)骨骼發(fā)育，但過(guò)量氟攝入會(huì)影響骨形成與骨吸收，引發(fā)骨代謝紊亂導(dǎo)致氟骨癥，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)僵直、腰腿關(guān)節(jié)疼痛、骨骼變形等癥狀[8-10]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，氟對(duì)骨骼的毒性作用機(jī)制復(fù)雜，除外界因素的刺激外，還可能受遺傳因素的影響[11]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，不同的人群對(duì)于氟暴露反應(yīng)敏感性不同，氟骨癥的發(fā)病率存在差異[12]，提示遺傳因素可能與氟中毒的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。RANK屬于腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)超家族成員之一，是一種Ⅰ型跨膜蛋白，由616個(gè)氨基酸殘基組成，基因定位于染色體18q21.33，全長(zhǎng)3 809 bp，外顯子12個(gè)。RANK與核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)結(jié)合能引起破骨細(xì)胞分化成熟[13]。有研究報(bào)道RANK基因多態(tài)性與某些骨疾病有關(guān)系，Wang等[13]報(bào)道了RANK基因rs1805034位點(diǎn)CC基因型與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生相關(guān)，Chen等[14]發(fā)現(xiàn)RANK基因rs884205基因多態(tài)性與肱骨頭壞死有關(guān)。但RANK基因的rs1805034和rs884205位點(diǎn)多態(tài)性與燃煤型地氟病的反生發(fā)展是否相關(guān)的報(bào)道較少。本研究在知情同意的原則下，以貴州省某燃煤污染型地氟病人群為調(diào)查對(duì)象，探討該人群外周血DNA中RANK基因的rs1805034和rs884205位點(diǎn)多態(tài)性與燃煤污染型地氟病患病的關(guān)系，報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇居住于貴州省六枝特區(qū)梭戛苗族彝族回族鄉(xiāng)(簡(jiǎn)稱梭戛鄉(xiāng))3年及以上、無(wú)顱腦外傷及精神疾病家族史的8～12歲在校小學(xué)生作為研究對(duì)象，在知情同意原則下，根據(jù)《氟斑牙診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS/T 208-2011)進(jìn)行氟斑牙分度診斷，其中氟斑牙分度在極輕度及以上者為地氟組，分度正常者為對(duì)照組。入選人數(shù)：地氟組283人，平均年齡(10.32±1.46)歲，男139人、女144人；對(duì)照組200人，平均年齡9.89±1.31歲，男101人、女99人。

1.2 研究方法

1.2.1DNA模板標(biāo)化 采集研究對(duì)象外周靜脈血5 mL，采用DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取全血基因組DNA，用NanoDrop Lite紫外分光光度計(jì)[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]對(duì)DNA定量后，標(biāo)化至30 mg/L，轉(zhuǎn)入96孔PCR反應(yīng)板中作為模板DNA，封膜后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2基因分型 采用TaqMan-MGB探針?lè)▽?duì)RANK基因rs1805034和rs884205位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。PCR反應(yīng)總體系(10 μL)：TaqMan genotyping Master MixⅡ 3.0 μL，探針0.15 μL，DNA溶液(3 mg/L)1.0 μL，加無(wú)菌ddH2O補(bǔ)足至10 μL。PCR反應(yīng)條件：60 ℃ 30 s，95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，循環(huán)40次；60 ℃ 30 s結(jié)束反應(yīng)。采用Step one software v2.3軟件分析擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.3測(cè)序驗(yàn)證 根據(jù)分型結(jié)果，每個(gè)SNP位點(diǎn)、每種基因型隨機(jī)抽取5%的樣本送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序驗(yàn)證(不足5例的全部測(cè)序驗(yàn)證)，測(cè)序結(jié)果與分型結(jié)果100%相符。測(cè)序引物序列見(jiàn)表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用χ2檢驗(yàn)對(duì)兩組樣本兩個(gè) SNP位點(diǎn)基因型頻率進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)， SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析各SNP位點(diǎn)的等位基因、基因型頻率在各組間的分布差異；采用SNPstats對(duì)每個(gè)SNP位點(diǎn)基因型與燃煤型地氟病發(fā)生發(fā)展的相關(guān)遺傳模式進(jìn)行分析，并根據(jù)赤池信息量準(zhǔn)則(akaike information criterion，AIC)和貝葉斯信息準(zhǔn)則(bayesian information criterions，BIC)來(lái)確定最優(yōu)遺傳模式；采用在線軟件系統(tǒng)SHEsis對(duì)RANK基因rs1805034和rs884205位點(diǎn)之間進(jìn)行連鎖不平衡分析，各個(gè)方塊的顏色由淺至深表連鎖程度由低到高。D′代表連鎖不平衡系數(shù)，顏色越深、D′值越大，代表兩位點(diǎn)之間連鎖不平衡越強(qiáng)；當(dāng)D′>0.5時(shí)存在弱連鎖不平衡，D′> 0.8、且r2> 0.3時(shí)兩點(diǎn)間存在強(qiáng)連鎖不平衡，D′=1 存在完全連鎖不平衡；r2為相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 基因分型

研究采用Step One Software v2. 3軟件對(duì) Real-time PCR 擴(kuò)增分析，結(jié)果顯示RANK基因 rs1805034 位點(diǎn)在地氟病人群和對(duì)照組人群中均存在C和T等位基因以及3種基因型(即CC、CT、TT)，如圖1；rs884205位點(diǎn)在地氟病人群和對(duì)照組人群中均存在A和C等位基因以及3種基因型(即AA、 AC、CC )。見(jiàn)圖2。

注：紅點(diǎn)為CC野生型，綠點(diǎn)為CT雜合型，藍(lán)點(diǎn)為T(mén)T突變純合型，“X”為未確定。圖1 RANK基因rs1805034位點(diǎn)基因分型Fig.1 rs1805034 loci genotyping of RANK gene

注：紅點(diǎn)為CC野生型，綠點(diǎn)為AT雜合型，藍(lán)點(diǎn)為AA突變純合型，“X”為未確定。圖2 RANK基因rs884205位點(diǎn)基因分型Fig.2 rs884205 locus genotyping of RANK gene

2.2 測(cè)序驗(yàn)證

隨機(jī)在每個(gè)SNP位點(diǎn)的每種基因型樣本中抽樣5%進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，例數(shù)不足5例的全部測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與基因分型結(jié)果完全符合。見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 RANK基因 rs1805034位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果Fig.3 Sequencing of rs1805034 of RANK gene

圖4 RANK基因 rs884205 位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果Fig.4 Sequencing of rs884205 of RANK gene

2.3 rs1805034和rs884205等位基因及基因分型的分布頻率

rs1805034和rs884205位點(diǎn)的基因型頻率在地氟組和對(duì)照組中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡。在地氟組和對(duì)照組間兩個(gè)位點(diǎn)的等位基因及基因分型比較顯示：RANK基因rs1805034位點(diǎn)等位基因和基因型分布在地氟組和對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，rs884205位點(diǎn)基因型和等位基因分布在地氟組和對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 RANK基因多態(tài)性位點(diǎn)在地氟組和對(duì)照組中的分布頻率Tab.2 Distribution frequency of RANK gene polymorphism loci in the fluorosis group and control group

2.4 貴州梭戛RANK基因rs1805034和rs884205位點(diǎn)最優(yōu)遺傳模式分析

采用 SNPStats 在線軟件對(duì)地氟組和對(duì)照組的RANK基因 rs1805034 位點(diǎn)和rs884205位點(diǎn)的等位基因進(jìn)行最優(yōu)遺傳模式分析， 探討2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)基因型與燃煤型地氟病發(fā)生的相關(guān)性。結(jié)果顯示RANK基因rs1805034位點(diǎn)最優(yōu)遺傳模式為共顯性，在該遺傳模式下C/T基因型和T/T基因型相對(duì)于C/C基因型來(lái)說(shuō)是燃煤型地氟病發(fā)生的保護(hù)因素(OR=0.17，95%CI為0.09～0.31；OR=0.04，95%CI為0.02～0.08)；rs884205位點(diǎn)與燃煤型地氟病的發(fā)生無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 地氟組和對(duì)照組最優(yōu)遺傳模式分析Tab.3 Analysis of optimal genetic model between fluorosis group and control group

2.5 貴州梭戛RANK基因rs1805034和rs884205位點(diǎn)在地氟組和對(duì)照組間連鎖不平衡分析

SHEsis分析結(jié)果顯示RANK基因多態(tài)性位點(diǎn)之間不存在連鎖不平衡(D′<0.5)。見(jiàn)圖5。

圖5 地氟組和對(duì)照組間2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的連鎖不平衡分析Fig.5 Analysis of linkage disequilibrium of 2 polymorphism loci between fluorosis group and control group

3 討論

氟參與人體生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)，適量的氟不僅對(duì)牙齒和骨骼的發(fā)育有好處而且還可以預(yù)防齲齒[15]。但在牙齒和骨骼發(fā)育過(guò)程中氟的過(guò)量攝入可能會(huì)影響牙釉質(zhì)的發(fā)展、導(dǎo)致骨穩(wěn)態(tài)的紊亂，導(dǎo)致牙釉質(zhì)缺失、骨骼氟中毒等癥狀，引起骨轉(zhuǎn)換障礙，導(dǎo)致各種骨骼病變，如骨硬化、骨質(zhì)疏松和退行性關(guān)節(jié)改變[16]。氟中毒有急性和慢性氟中毒之分。慢性氟中毒比較常見(jiàn)，分為飲水、飲茶和燃煤污染型,其臨床特征均為氟斑牙和氟骨癥[17-18]。高氟刺激下，成骨細(xì)胞大量分泌骨鈣素，可參與骨代謝并調(diào)節(jié)相關(guān)激素表達(dá)水平，從而影響骨質(zhì)生長(zhǎng)發(fā)育、骨骼和非骨骼系統(tǒng)[19-20]。地氟病的發(fā)病機(jī)制和治療策略尚未闡明。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)地氟病的發(fā)病機(jī)制進(jìn)入了分子水平研究。

RANK基因?qū)堑男纬珊桶l(fā)育具有重要作用，其上SNP位點(diǎn)多態(tài)性與骨相關(guān)疾病的研究近年來(lái)屢見(jiàn)報(bào)道，Casas-Avila等[21]報(bào)道了RANK基因rs3018362位點(diǎn)多態(tài)性與骨質(zhì)疏松癥具有相關(guān)性，Mohamed等[22]報(bào)道了RANK基因rs1805034位點(diǎn)多態(tài)性與絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生有關(guān)。在本研究中對(duì)RANK基因rs1805034、rs884205位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性分型結(jié)果顯示，RANK基因rs1805034位點(diǎn)基因型在地氟組的分布為CC頻率42.8%、CT頻率46.6%、TT頻率10.6%，在對(duì)照組的分布為CC 頻率8.0%、CT頻率 46.0%、TT 頻率46.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；等位基因在疾病組的分布為C 頻率66.1%、T 頻率33.9%，在對(duì)照組的分布為C頻率 31.0%、T頻率 69.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；rs884205位點(diǎn)基因型和等位基因在地氟組和對(duì)照組之間分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。最優(yōu)遺傳模式分析RANK基因2個(gè)SNPs位點(diǎn)多態(tài)性與燃煤型地氟病發(fā)生的相關(guān)性，結(jié)果顯示RANK基因rs1805034位點(diǎn)最優(yōu)遺傳模式為共顯性，在該遺傳模式下C/T基因型和T/T基因型相對(duì)于C/C基因型來(lái)說(shuō)是燃煤型地氟病發(fā)生的保護(hù)因素(OR=0.17，95%CI為0.09～0.31；OR=0.04，95%CI為0.02～0.08)，其余位點(diǎn)與燃煤型地氟病的發(fā)生無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，提示rs1805034位點(diǎn)C/T基因型和T/T基因型可能與燃煤型地氟病的發(fā)生有相關(guān)性。本研究對(duì)RANK基因多態(tài)性位點(diǎn)在地氟組和對(duì)照組中進(jìn)行連鎖不平衡分析結(jié)果顯示，RANK基因上述2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)之間不存在連鎖不平衡(D′<0.5)，不能構(gòu)建單倍型，因此無(wú)法通過(guò)連鎖不平衡來(lái)判斷RANK基因上述2個(gè)多態(tài)性位與燃煤型地氟病的關(guān)系。

綜上所述，本研究顯示RANK基因rs1805035位點(diǎn)可能與燃煤型地氟病的發(fā)生有關(guān)，rs884205可能與燃煤型地氟病的發(fā)生無(wú)關(guān)。由于本研究樣本量相對(duì)較少，容易產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)偏差，還需進(jìn)一步加大樣本量開(kāi)展研究工作，從而闡述RANK基因 rs1805035、rs884205位點(diǎn)與燃煤型地氟病的相關(guān)性。