糖通飲對(duì)2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝大鼠肝組織的保護(hù)作用及機(jī)制*

陳俞如， 馬歡， 伏紅穎， 潘艷伶,2***

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院 中醫(yī)學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 中醫(yī)科， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)在2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者中極為普遍，T2DM患者罹患NAFLD的幾率可達(dá)60%左右[1]，如未能及時(shí)治療，可導(dǎo)致肝硬化、肝纖維化、肝癌及心血管疾病的發(fā)生[2]，因此對(duì)T2DM合并NAFLD引發(fā)的肝損傷進(jìn)行積極防治意義重大。本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方糖通飲可改善T2DM大鼠胰島素抵抗(insulin resistance,IR)并能顯著降低其血脂水平[3-5]，但糖通飲對(duì)T2DM合并NAFLD模型大鼠肝組織是否具有保護(hù)作用尚不清楚。因此，本研究通過(guò)對(duì)T2DM合并NAFLD模型大鼠進(jìn)行糖通飲干預(yù)治療后，觀察各組大鼠相關(guān)指標(biāo)的變化，從而探討糖通飲對(duì)T2DM合并非酒精性脂肪肝模型大鼠肝組織的作用及可能機(jī)制，為臨床應(yīng)用該方治療T2DM合并NAFLD提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 44只SPF級(jí)SD雄性大鼠，體質(zhì)量(180±20)g，由重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)SCXK(軍)2012-0011，大鼠置于貴州醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房飼養(yǎng)，自由攝水飲食，飼養(yǎng)溫度21～26 ℃。

1.1.2藥物與試劑 糖通飲(生地、黃芪、山藥、山茱萸、茯苓、丹皮、丹參、草決明、澤瀉、地骨皮)由貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供，丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒(南京建成生物公司)，大鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測(cè)定試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)，蘇木素染液、伊紅染液(武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司)，飽和油紅O染色液(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1模型制備及分組 44只SPF級(jí)SD雄性大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)取10只作為正常對(duì)照組，給予普通飼料喂養(yǎng)；其余大鼠為模型組，以高脂高糖飼料(普通飼料58%、精煉豬油20%、糖20%、膽固醇2%，由貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房提供)喂養(yǎng)8周后禁食12 h，用1%鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)的檸檬酸緩沖液(pH 4.5)按20 mg/kg、25 mg/kg、30 mg/kg劑量依次腹腔注射，正常對(duì)照組則注射相應(yīng)劑量的檸檬酸鈉緩沖液。造模72 h后，隨機(jī)從正常對(duì)照組及造模大鼠中各抽取2只檢測(cè)尾靜脈空腹血糖(fasting blood-glucose,FBG)，并行肝組織HE染色，造模大鼠FBG≥16.7 mmol/L，且較正常對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)存在明顯脂肪樣變性，提示T2DM合并NAFLD造模成功[6]。將造模成功的大鼠根據(jù)FBG從高到低的順序進(jìn)行排序，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、糖通飲(低劑量組、中劑量組及高劑量)組，每組各8只。

1.2.2藥物制備 將糖通飲飲片熬制成煎劑，低劑量糖通飲濃縮為含生藥0.6 g/mL的藥液，中劑量濃縮為含生藥1.2 g/mL的藥液，高劑量濃縮為含生藥1.8 g/mL的藥液，灌胃容積為20 mL/kg[7]。

1.2.3干預(yù)治療 大鼠用藥劑量按成人與大鼠等效劑量比值表計(jì)算。糖通飲低劑量組按12 g/kg、中劑量組按24 g/kg、高劑量組按36 g/kg灌胃給藥，正常對(duì)照組及模型組予等容積雙蒸水灌胃。各組大鼠每天灌胃1次，連續(xù)8周。灌胃期間大鼠死亡6只(模型組及糖通飲低劑量組各死亡2只，糖通飲中、高劑量組各死亡1只)。

1.2.4標(biāo)本采集 大鼠灌胃治療8周后稱取體質(zhì)量，禁食不禁水12 h，尾靜脈采血測(cè)FBG；按300 mg/kg劑量給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后迅速開(kāi)腹，腹主動(dòng)脈取血靜置30 min，3 000 r/min離心10 min分離血清，測(cè)定甘油三酯(triglycerides,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、MDA、SOD、TNF-α水平；取肝組織觀察肝組織病理學(xué)變化及肝細(xì)胞中脂質(zhì)沉積的情況。

1.2.5大鼠肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化 大鼠肝組織用4%多聚甲醛溶液固定、常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、65 ℃烤片40 min，二甲苯脫蠟后，脫水、清洗，蘇木素染液染色5 min，清洗，分化液分化4 s，HE染色5 min，清洗、脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察、采圖。

1.2.6大鼠肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積情況 采用油紅O染色法進(jìn)行觀察，將大鼠肝組織冰凍切片復(fù)溫干燥，固定液固定15 min，清洗，晾干；油紅染液浸染8 min(避光)；切片依次浸入60%異丙醇Ⅰ3 s、60%異丙醇Ⅱ分化5 s，純水浸洗10 s；蘇木素復(fù)染5 min，純水浸洗10 s；分化液(以60%酒精為溶劑)分化8 s、水洗10 s、返藍(lán)液返藍(lán)1 s、浸洗10 s；封片，顯微鏡下觀察、采圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 FBG水平

與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠FBG水平明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，糖通飲各劑量組FBG水平明顯降低(P<0.01)；但各劑量組間差異比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠FBG水平Tab.1 FBG levels in each

2.2 大鼠血清TG、TC水平

與正常組相比，模型組大鼠血清TG、TC水平均明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，糖通飲各劑量組血清TG、TC水平均明顯降低(P<0.01)；此外，糖通飲高劑量組與糖通飲低劑量組相比，血清TG水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清TG、TC水平Tab.2 The levels of serum TG and

2.3 大鼠血清ALT、AST水平

與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血清ALT、AST水平均明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，糖通飲各劑量組血清ALT水平降低(P<0.05或P<0.01)，糖通飲高劑量組血清ALT水平較低、中劑量組降低更明顯(P<0.05)。與模型組比較，糖通飲高劑量組血清AST水平降低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清ALT、AST水平Tab.3 The levels of serum ALT and

2.4 大鼠血清MDA、SOD、TNF-α水平

與正常組相比，模型組大鼠血清MDA、SOD、TNF-α水平均明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，糖通飲各劑量組大鼠血清MDA、SOD、TNF-α水平均降低(P<0.05或P<0.01)；但各劑量組間差異比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

2.5 大鼠肝組織觀察

正常對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核清晰；模型組肝細(xì)胞明顯腫脹變性，排列錯(cuò)雜紊亂，細(xì)胞核被脂滴擠至邊緣；糖通飲各劑量組較模型組均有改善，肝細(xì)胞體積縮小，脂滴數(shù)量減少，其中糖通飲高劑量組較低、中劑量組改善效果更明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠肝組織觀察(HE，×400)Fig.1 Characteristics of liver tissues in each group (HE，×400)

2.6 大鼠肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積的情況

正常對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)明顯脂質(zhì)沉積，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠肝細(xì)胞中紅色脂質(zhì)沉積明顯增多；與模型組相比，糖通飲各劑量組肝細(xì)胞內(nèi)紅色脂質(zhì)沉積均有一定程度的減少，其中，高劑量組脂質(zhì)減少更為明顯。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠肝組織脂質(zhì)沉積觀察(O染色，×400)Fig.2 Observation of lipid deposition of liver tissues in each group (O staining,×400)

3 討論

NAFLD的發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，包括肥胖、IR、脂代謝異常、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、肝臟自噬和腸道菌群失調(diào)等因素[8]。其中，IR是T2DM及NAFLD共同的發(fā)病機(jī)制。當(dāng)IR發(fā)生時(shí)，機(jī)體抗脂解激素缺乏，增強(qiáng)了脂肪的分解作用，游離脂肪酸蓄積在肝內(nèi)合成TG，肝細(xì)胞發(fā)生腫脹變性。隨著脂代謝紊亂的發(fā)生，機(jī)體抗氧化能力下降，氧自由基大量生成，促使炎性因子TNF-α釋放增加，從而介導(dǎo)炎性反應(yīng)發(fā)生，并通過(guò)增強(qiáng)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)致使細(xì)胞發(fā)生凋亡和損傷[9-10]。MAD是機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程的最終產(chǎn)物，SOD具有保護(hù)機(jī)體免受自由基攻擊的作用，MDA與SOD水平的變化可反應(yīng)機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)損傷的程度。當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，肝細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，致使肝細(xì)胞中的ALT、AST釋放進(jìn)入血液中，表現(xiàn)為血清ALT、AST水平升高。目前，西醫(yī)治療T2DM合并NAFLD主要以胰島素增敏劑及降脂類(lèi)藥物為主，可一定程度地延緩該病病情進(jìn)展，但容易出現(xiàn)肝腎損傷、橫紋肌溶解等毒副作用[11]，而中醫(yī)藥在防治T2DM合并NAFLD的過(guò)程中收獲了良好的治療效果，且以毒副作用小、治療成本低的優(yōu)勢(shì)而備受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，六味地黃丸、化肝煎、加味四逆散等均能明顯降低T2DM及NAFLD患者血脂水平，緩解肝功能損傷[12-14]。

T2DM合并NAFLD在古籍中雖未明確記載其病名，但根據(jù)其臨床表現(xiàn)，可歸為“消渴”“肝積”“脅痛”等范疇，現(xiàn)代醫(yī)家大多認(rèn)可該病多為氣陰兩虛、痰濁瘀血之證[15-17]。糖通飲為全國(guó)名老中醫(yī)凌湘力教授的臨床經(jīng)驗(yàn)方，該方是以生地黃、山藥、山萸肉、茯苓、澤瀉、丹皮、黃芪、地骨皮、丹參、草決明所組成，具有益氣養(yǎng)陰，祛瘀泄?jié)嶂А，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，生地、茯苓、地骨皮有著抗氧化、降脂抗炎的作用[18-19]，黃芪中多糖類(lèi)成分能改善IR，并可降低血脂水平[20]，牡丹皮亦具備顯著降低肝損傷大鼠血清AST、ALT含量，對(duì)肝組織具有保護(hù)作用[21]。

本研究結(jié)果顯示，糖通飲可明顯減少T2DM合并NAFLD模型大鼠血清TG、TC含量，減輕肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積及脂肪變性程度，還可明顯降低血清MDA、SOD、TNF-α、AST、ALT水平，說(shuō)明糖通飲可能是通過(guò)糾正脂質(zhì)代謝紊亂、增強(qiáng)抗氧化能力、減輕炎癥反應(yīng)以及脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的途徑來(lái)改善T2DM合并NAFLD模型大鼠肝細(xì)胞脂肪樣變及肝功能損傷的情況，從而發(fā)揮對(duì)其肝組織的保護(hù)作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，糖通飲還可劑量依賴性地降低T2DM合并NAFLD模型大鼠血清ALT水平，說(shuō)明糖通飲治療T2DM合并NAFLD引起的肝功能損傷存在一定的量效關(guān)系。以上結(jié)果為臨床應(yīng)用糖通飲治療T2DM合并NAFLD提供了一定的理論依據(jù)。